乙肝病毒体外感染的血清模型和细胞模型及其建立方法

摘要

本发明公开一种乙肝病毒体外感染的血清模型和细胞模型及其建立方法，该血清模型由去除病毒的乙肝大三阳血清和HepG2.2.15病毒颗粒混合而成，其中，所述去除病毒的乙肝大三阳血清的拷贝数为HBV-DNA>10

说明书

技术领域

本发明属于动物细胞系领域，具体地指一种乙肝病毒体外感染的血清 模型和细胞模型及其建立方法。

背景技术

全球各地都有乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染者， 在亚洲、非洲、太平洋等地区乙型肝炎病毒HBV是危害人类健康，引起 人类肝脏疾病的主要病原体之一。中国是乙型肝炎的高发区，乙型肝 炎病毒对肝细胞的持续感染又导致部分人肝功能异常并最终发展成为 比较严重的肝脏疾病，其中包括肝硬化和肝细胞癌。目前的抗乙型肝 炎病毒的药物如干扰素和核苷类似物又因严重的副作用限制了其在临 床上的广泛应用。研究清楚乙型肝炎病毒的生活史和其致病机制尤其 是宿主与乙型肝炎病毒之间的相互作用，可以给抗病毒药物的研发提 供新的思路。目前对于乙型肝炎病毒的结构，复制过程以及生物学特 性有了一定的了解，但是由于乙型肝炎病毒有严格的宿主特异性，只 能感染人类和少数灵长类动物的肝脏组织，不感染低级灵长类和其他 哺乳动物，在一定程度上限制了其生活史和发病机制的研究。

乙型肝炎病毒具有较严格的种属特异性，虽然有类人猿和黑猩猩作为 乙型肝炎病毒体内感染模型得到公认，但是价格昂贵，难以推广。鉴 于嗜肝病毒属具有相似的病毒结构和复制特点，利用其它动物嗜肝DN A病毒建立的细胞感染模型和动物模型用于乙肝肝炎病毒的研究。树鼩 可以感染乙型肝炎病毒，但是树鼩感染乙型肝炎病毒是一过性的，乙 型肝炎病毒复制和表达水平都不高。土拨鼠肝炎病毒(woodchuck he patitis B virus,WHBV)感染的土拨鼠，以及鸭乙肝病毒（duck h etpatitis B virus,DHBV）可以感染鸭肝细胞，但是土拨鼠肝炎 病毒和鸭乙肝病毒和人乙型肝炎病毒有一定差异，使得乙型肝炎的发 病机制和机体的应答研究受到限制。

目前尚无用于乙型肝炎病毒体外感染的细胞模型，对乙型肝炎病毒感 染早期阶段的分子机制缺乏深入了解，特别是血清中哪些物质参与乙 型肝炎病毒入胞，病毒感染过程中相关的细胞上的大分子（受体）等 。体外培养的人原代肝细胞可以支持乙型肝炎病毒的复制，但由于原 代肝细胞感染乙型肝炎病毒有时间限制不能进行传代培养，随着时间 的延长一些肝细胞的功能下降，失去了典型的多角形态。王安辉等在 2004年以及2003年发表论文《乙型肝炎病毒感染体外培养细胞的实验 研究》，直接用病人的高拷贝血清感染细胞，从而在细胞内观察到乙 肝病毒特异性蛋白。但是没有办法证明是血清因素还是乙肝病毒本身 的因素在乙肝病毒入胞时候发挥作用。

HepG2细胞是目前研究乙型肝炎病毒最常用的肝癌细胞系之一，支持乙 型肝炎病毒的复制但不能被乙型肝炎病毒自然感染。经过DMSO（二甲 基亚砜）处理的HepG2细胞可以被乙型肝炎病毒感染。DMSO作用是促进 乙型肝炎病毒进入细胞机制尚不明确，是促进细胞内的一些未知蛋白 的表达使细胞维持在一定的细胞周期，或者是提高了病毒结合细胞的 能力，或者在某一环节诱导某一基因表达的提高等有待于进一步的探 索。但是DMSO可以促进胞内未知蛋白的表达，使细胞维持在一定的细 胞周期内。Gripon等从慢性丙型肝炎导致的肝癌患者体内分离出细胞 ，并且加入DMSO和地塞米松培养，建立了HepaRG细胞株。该细胞株具 有肝细胞相似的形态和生理学功能，对乙型肝炎病毒易感。但是由于 该细胞株的建立在DMSO和地塞米松的辅助下完成，故不能很好的诠释 HBV感染的机制。

尽管乙型肝炎病毒在体内具有很高的感染性，但是在体外的细胞培养 中却很难建立有效的感染。乙型肝炎病毒早期阶段如HBV的识别与吸附 肝细胞的分子等的研究仍不是十分清楚，现有的关于乙肝病毒早期感 染的资料多来自于对DHBV的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种乙肝病毒体外感染的血清模 型和细胞模型及其建立方法，该血清模型可以与细胞共培养，在体外 进行感染，得到HBV-DNA和Dane颗粒。细胞模型可以用于研究乙肝病毒 入胞过程中的受体。使用该细胞模型时，感染过程中不添加任何辅助 分子，如DMSO和PEG等，而且实验重复多次，具有很好的重复性。

为解决上述技术问题，本发明提供一种乙肝病毒体外感染的血清模型 ，该血清模型由去除病毒的乙肝大三阳血清和HepG2.2.15病毒颗粒混 合而成，其中，所述去除病毒的大三阳血清的拷贝数为HBV-DNA>10⁸c opies/mL。

进一步地，所述细胞模型的拷贝数为1~9.9*10^4~5copies/mL。

本发明还提供一种利用乙肝病毒体外感染的血清模型得到的细胞模型 ，该细胞模型由正常肝细胞/肝癌细胞与血清模型共培养而成。

进一步地，所述肝癌细胞为HepG2，所述正常肝细胞为changlive细胞 。

本发明还一种乙肝病毒体外感染的血清模型建立方法，其特征在于：

1）收集乙肝大三阳血清，然后初步除去血清中沉淀物及其细胞碎片杂 物，再沉淀病毒，得到去除病毒的乙肝大三阳血清，其中，所述去除 病毒的乙肝大三阳血清的拷贝数为HBV-DNA>10⁸copies/mL；

2）收集HepG2.2.15细胞，然后初步除去HepG2.2.15细胞中沉淀物及其 细胞碎片杂物，再沉淀病毒，去除上清得到HepG2.2.15病毒颗粒；

3）将去除病毒的乙肝大三阳血清与HepG2.2.15病毒颗粒混合均匀，得 到细胞模型。

本发明还提供了一种根据乙肝病毒体外感染的血清模型和细胞模型在 乙肝病毒体体外感染的应用。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的细胞广泛来源易得，保持了肝癌细胞的一般特 性可以无限制传代培养。

2、本发明提供的方法简便，并且较好的模拟乙肝病毒进入细胞的自然 过程。

3、根据本发明提供的模型不破坏细胞结构，可以更好的研究乙肝病毒 入胞过程中的受体，为乙肝病毒的预防和治疗提供新的思路。

附图说明

图1为血清模型验证分组示意图；

图2为去感染后不同时间点各组细胞上清中的乙肝病毒表面抗原的测定 ；

图3为各组细胞上清中不同时间点HBV-DNA的拷贝数；

图4为电镜下观察高拷贝血清混合组去感染后继续孵育24h时的细胞上 清中的乙肝病毒；

图5为激光共聚焦观察各组细胞内表面抗原和核心抗原的表达，Bar,  50um；

图6为去感染24h后各组细胞中的核心抗原的表达；

图7为应用Western Blot方法检测各组不同时间段细胞内HBcAg的表达 。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主 要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

英文缩略词表

一、材料与试剂：

1、血清收集：收集乙肝大三阳血清（HBV-DNA>10⁸copies/mL）以及乙 肝两对半阴性未注射过乙肝疫苗的正常人血清。

2、细胞：HepG2细胞和HepG2.2.15购于ATCC公司，美国。

3、PBS液：取NaCl 8.00 g，KH₂PO₄ 0.20g，Na₂HPO₄12H₂O 2.08g， KCl 0.20g，将上述试剂充分溶于1000mL超纯水中，高压蒸气灭菌30 min，4℃保存备用。

4、DMEM培养液：DMEM培养基粉剂购自美国GIBCO公司，将粉剂充分溶 解后加入2.00gHEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）定容至1L。调节pH值至 7.2左右。过滤除菌后分装放入无菌玻璃瓶中，-20℃保存备用。

5、0.25％胰酶：称取0.25g胰蛋白酶，加到100mLPBS缓冲液中，磁力 搅拌器上充分搅拌至溶解，滤过除菌，分装，-20℃保存备用。

6、细胞冻存液：1mLDMSO（购于美国Sigma公司）+4mLFBS+5mLDMEM共 10mL，存放于备用。

7、G418溶液（100mg/mL）：将1gG418粉剂溶于10mLPBS里，充分吹打 至完全溶解，滤过除菌，分装到1.5mLEP管中，-20℃保存 备用。

8、TNE溶液：称取25mMTris 1.21g，100mM Nacl 5.84g，1mM ED TA 0.37g，加到1000mL的超纯水中混匀，用HCL调节pH值至7.5左右。 灭菌后保存于4℃备用。

二、主要仪器与设备：

1、细胞培养瓶(75mL)：美国Corning Costar公司；

2、22um细胞滤器：美国BD Falcon公司；

3、WJ-12D CO₂水套培养箱：美国FORMA公司；

4、倒置相差显微镜：日本Olympus公司；

5、医用净化工作台：苏州净化设备有限公司；

6、AF100制冰机：美国SCOTSMAN公司；

7、YM50不锈钢立式高压灭菌锅：广州永程；

8、低温超速离心机：美国Beckman公司；

9、FV500型激光共聚焦显微镜：日本Olympus公司；

实施例1：乙肝病毒体外感染的血清模型的建立：

一、细胞培养：

1、细胞的复苏：从液氮罐中取出HepG2和Hep2.2.15细胞，迅速置于3 7℃恒温水浴箱中，不断摇晃，冻存液溶解后，用75%酒精擦拭冻存管 表面后在无菌细胞台中，加入含10mLDMEM培养基的离心管中，1000rp m离心10min，在到超净台中弃去离心管中的上清，加入10mLDMEM培养 基的细胞培养瓶，HepG2.2.15细胞培养基还需要加入G418 200ug/mL 。置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中，视细胞生长情况换液或者传代 。

2、细胞的传代：收取HepG2.2.15细胞旧培养基于15mL离心管，HepG2 细胞旧培养基弃掉。无菌PBS洗涤3次，弃去清洗液。加入适量0.25%胰 酶消化液消化，37℃孵育1min。显微镜下观察：看到大部分贴壁细胞 回缩变圆、细胞间隙增大后弃掉胰酶，加入适量含10％FBS的DMEM培养 液终止消化。用1mL移液器吸取适量培养液轻轻吹打瓶壁，制备单细胞 悬液，吸取少量细胞悬液注计数，计数后将细 胞按合适比例接种于新的培养瓶。

3、细胞的冻存：按照细胞传代方法制成单细胞悬液，收集于离心管中 ，1000rpm离心5min，弃上清，加入冻存液重悬细胞，使细胞的最终密 度为1×10⁶/mL。混匀分装入冻存管。封口标记冻存管后，4℃放置2h ，-20℃放置4h，-80℃过夜，转入液氮中长期保存。

二、乙肝病毒体外感染的血清模型的建立

1、将收集的乙肝大三阳血清，正常人血清和HepG2.2.15细胞上清置于 4℃，10000rpm离心10min，初步除去血清沉淀物以及细胞碎片等；

2、加Nacl至0.5mol/L,室温10min；

3、加PEG8000 6%~8%（W/V）之间，充分混匀使病毒沉淀；

4、4℃放置12h；

5、在4℃，10000g条件下离心30min；

6、乙肝大三阳血清和正常人血清弃沉淀，得到去病毒的乙肝大三阳血 清和去病毒正常人血清，另取干净的离心管放置于4℃。HepG2.2.15细 胞上清弃上清留沉淀；并用1mLPBS重悬的病毒颗粒，得到病毒颗粒悬 浮液；

7、蔗糖密度梯度离心：

1）蔗糖密度梯度液的配制及铺设：由TNE配制的10％、20％、30％、 40％、50％、60％(w/v)蔗糖溶液各1.7mL，用枪头小心地将按照高浓 度到低浓度将不同浓度的蔗糖液依次铺于12mL的超速离心管（PA管） 内，顶端铺上步骤6）中1mL的病毒颗粒悬浮液；

2）超速离心：将PA管配平后小心的装到超速离心机内，在200，000g ，4℃条件下离心4h后，收集20%-40%蔗糖梯度之间的溶液。

8、去蔗糖制备感染细胞的病毒混合液：合并含病毒的20%-40%蔗糖梯 度溶液，在150000g，4℃条件下离心2.5h，得到纯化后的病毒颗粒，

9、将去病毒的乙肝大三阳血清和去病毒正常人血清分别于病毒颗粒混 合，得到乙肝病毒体外感染的细胞模型和正常血清混合物，在 超净台中过滤保存于-80℃。

实施例二  验证乙肝病毒体外感染的细胞模型

将去病毒的乙肝大三阳血清和HepG2.2.15病毒颗粒混合形成的血清模 型作为实验组，正常人血清和HepG2.2.15细胞的病毒混合物作为阴性 对照组，用DMSO处理六天的HepG2细胞加实验组血清作为阳性对照组。 具体见下图1：

具体实验步骤如下：

1）HBV感染前一天将HepG2细胞接种于六孔板中，其中2孔接种2%DMSO 处理六天的HepG2细胞作为阳性对照孔。计数调整细胞数在2*10⁵/孔。

2）弃旧培养基，用PBS洗3次。

3）每孔加入2mL DMEM培养基，然后DMSO处理六天的细胞和其中2孔加 入细胞模型分别作为阳性对照组和实验组，另外2孔加入正常血清混合 物作为阴性对照组MOI（multiplicity of infection）=100︰1。

4）将六孔板置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱培养24h

5）弃去旧培养基，注意每组之间换一个枪头防止交叉污染。PBS洗3次 后，加入0.25%胰酶0.5mL/孔，37℃消化2min以去除细胞表面吸附的乙 肝病毒颗粒。

6）加入DMEM后吹打下来，1000rpm离心5min，然后加入DMEM制备成单 细胞悬液后继续放入培养箱培养。

7）收集洗后12h，24h，48h，72h，96h，120h的细胞上清。用于HBsA g和HBV-DNA的检测。收集去感染后24h的细胞上清做电镜实验。

8）收集去感染后24h细胞做共聚焦、组化、以及western blot检测细 胞内的乙肝病毒标记抗原。

一、分析上清中的乙肝表面抗原，HBV-DNA，以及电镜观察乙肝病毒

1.ELISA法检测上清中的HBsAg（购于上海科华有限公司）

收集去感染后的0h-120h上清，每组样品经过2000rpm离心10min后去上 清用于ELISA检测。操作安装上海科华有限公司的说明书进行，具体方 法如下：

1.1 每孔加入待测标本75uL，设置阴性对照和阳性对照各2孔，加入 阴性对照或者阳性对照75uL，空白对照孔一个。

1.2 用封片纸覆盖反应板，37℃孵育60min

1.3 每孔加入50uL酶结合物。微孔振荡器上震荡10s

1.4 贴上封片纸，反应板置于37℃孵育30min

1.5 洗涤反应板5次。

1.6 每孔加入显色剂A和B各50uL，混匀，震荡10秒。

1.7 覆盖上封片纸37℃孵育30min

1.8 所有的孔加入50uL终止液，混匀

1.9 酶标仪读数波长450nm，参考波长为630nm。

1.10 结果判断：

细胞上清液中表面抗原的ELISA检测结果根据公式：结果以COI（COI= cutoff index）表示，当COI>1.0时为阳性，COI≤1.0为阴性。从图 2上可以看出，从24h开始到测试的120h结束，实验组和阳性对照组HB sAg值均为阳性，从24h到72h时间内，实验组的乙肝抗原表达量高于阳 性对照组，从120h开始起阳性对照组乙肝抗原表达量超过实验组。正 常血清混合物作为的阴性对照组各时间点收集的细胞培养上清表面抗 原ELISA检测均为阴性。

2 荧光定量PCR检测上清中HBV-DNA（购于上海科华有限公司）

① 核酸提取（在标本处理区进行）

1.1用带滤芯吸嘴取100微升[样品处理液A]于0.5毫升离心管中。

1.2加入100微升被测上清。

1.3盖上管盖，振荡混匀，13000rpm离心10分钟,弃去上清。

1.4再加入25微升[样品处理液B]。

1.5振荡混匀，低速（2000rpm）离心数秒后，沸水浴10分钟。13000r pm离心10分钟，取上清为PCR反应模板。

② PCR反应体系：反应液A 13.5uL，反应液B 13.5uL，反应液C  1uL，加入2uL待测上清总30uL

③ PCR反应条件：UNG酶反应2min 50℃，预变性2min，94℃，变性 10s  94℃，退火延伸30s变性2min，60℃。40个循环。

④ 结果判断：实验的灵敏度为500copies/mL，≥500copies/mL为阳 性结果。

用荧光定量PCR方法检测（方法如图所述）结果如下：

沉淀后的血清和2.2.15细胞上清<500copies/mL

细胞模型（实验组）：  3.5*10⁵copies/mL

正常血清混合物（阴性对照组）：  1.2*10⁵copies/mL。

应用荧光定量PCR检测去感染后不同时间段的各组细胞上清中HBV-DNA 表达量，其中HBV-DNA大于500copies/mL判读为阳性，反之则为阴性。 去感染后24h，高拷贝血清混合组的乙肝HBV-DNA的表达量达到10⁵cop ies/mL以上。和DMSO处理组的结果一致。正常血清混合组各个时间点 的HBV-DNA表达量一致小于检测值500copies/mL（图3）。

3 电镜观察去感染24h后上清中的病毒颗粒

①上清液中病毒的收集与浓缩：

1）收集高拷贝血清混合组去感染后24h的细胞上清，约4mL，2000×g ，4℃，离心30min去除上清液中的细胞碎片及杂质，弃沉淀取上清， 进一步离心处理，4℃，10000rpm，离心60min（sigma 12150）后再 次收集上清并转至另一个10mL离心管中；

2）按照病毒混合液的制备方法浓缩上清。

3）沉淀物用1mLPBS（磷酸盐缓冲液）充分悬浮后得到初步浓缩的样品 液。

②蔗糖密度梯度离心：

1）蔗糖密度梯度液的配制及铺设：由TNE配制的10％、20％、

30％、40％、50％、60％(w/v)蔗糖溶液各1.7mL，用枪头小心地将按 照高浓度到低浓度将不同浓度的蔗糖液依次铺于12mL的超速离心管（ PA管）内，顶端铺上之前已制备完成的浓缩液样品1mL。

2）超速离心：将PA管配平后小心的装到超速离心机内（Beckman L- 80XP SW60Ti type rotor），200000×g，4℃离心4h后，收集20% ~40%蔗糖梯度之间的溶液。

3）去蔗糖：合并并用适量TNE缓冲液稀释这些组分，150000g，4℃离 心2.5h，沉淀用50uL滤过的PBS缓冲液重悬，即最终富集纯化的病毒。

4）免疫电镜：我们采用病毒-抗体沉淀法特异性沉淀病毒，负染后电 镜观察。

每组各适量的的纯化样品分别与100︰1稀释的等量horse anti-HBsA g多克隆抗体37℃，30min后，加PBS至2mL进行超速离心，150000g，4 ℃离心2h后沉淀用50μlPBS重悬，取适量重悬液滴于250目有fomvar膜 的铜网上，吸附10min后滤纸吸去多余的样品，65℃烘烤2~3min后，滴 加1％磷钨酸负染10min，干燥后于透射电子显微镜（FEI Tecnai G 2 12型）下观察病毒颗粒并拍照。

去感染后继续孵育24h，高拷贝血清混合组细胞上清经过蔗糖密度梯度 离心后在透射电镜下观察，图4左图显示可以观察到丝状病毒（黑色箭 头所示）和Dane颗粒（白色箭头所示）。如图4可见大量的亚病毒颗粒 和Dane颗粒（白色箭头所示）。

二、分析细胞中的乙肝表面抗原，乙肝表面抗体

1、共聚焦观察细胞内的HBsAg和HBcAg

去感染后24h，固定细胞，免疫荧光标记表面抗原和核心抗原检测其在 细胞内的表达及分布情况。按照免疫荧光的常规操作步骤进行，具体 如下 ：

1）对于6孔培养板中的细胞爬片，弃去培养基后温PBS洗细胞3遍，每 遍5min，

2）每孔中加入适量4%多聚甲醛，室温下固定20min，37℃自 然干燥，PBS润洗细胞三次，每次5min；

3）每孔加入适量0.1%（wt/vol）Trion X-100，37℃透化20min，PB S润洗三次，每次5min；

4）每孔加入适量5％BSA，室温封闭30min，吸出封闭液，但不润洗。

5）每孔加入足量（完全覆盖爬片上的细胞为宜）1︰100稀释度的一抗 （用1%BSA或者抗体稀释液稀释），在湿盒中4℃冰箱孵育过夜，吸弃 一抗溶液，PBS彻底润洗细胞三次，每次5min；

6）每孔加入400~500μl合适1︰200稀释的二抗溶液（用1%BSA或者抗 体稀释液稀释），37℃湿盒中闭光孵育1h，吸弃二抗溶液，PBS润洗三 次，每次5min；

7）在暗室中每孔加入0.1ug/mL DAPI工作液染细胞核，室温下孵育细 胞10min，吸弃染液，PBS润洗三次，每次5min；

8）封片：小心取出细胞爬片，用抗荧光淬灭封片液封片，锡箔纸避光 处理；

9）激光扫描共聚焦显微镜下观察荧光信号并照相。

去感染后，各组继续孵育24h后按照以上的实验步骤进行荧光染色后， 在激光共聚焦下观察。高拷贝血清混合组在细胞内均可观察到有乙肝 表面抗原和乙肝核心抗原的表达。DMSO处理组作为阳性对照在细胞内 也观察到了乙肝表面抗原和核心抗原，这与之前的文章结果一致。正 常血清组没有观察到细胞内有乙肝表面抗原和核心抗原的存在（图5） 。

2、组织化学方法观察细胞中的HBcAg

细胞爬片免疫组织化学染色方法观察去感染24h后的细胞内HBcAg

1）弃六孔板中的旧培养基，PBS漂洗3次，每次10min，注意漂洗时候 不用用力吹，防止细胞从爬片上脱落；

2）加入适量4%多聚甲醛以能盖过细胞为宜，室温条件下固定10min， 吸去多余液体后自然晾干；

3）PBS漂洗3次，每次10min；

4）每孔加入适量0.5%TritonX-100（PBS配），室温放置10min，然后 PBS漂洗3次，每次10min；

5）3%H₂O₂封闭过氧化物酶20分钟，PBS漂洗3次，每次10min；

6）0.01M柠檬酸缓冲液进行抗原修复，微波炉高中低火3-7-3分钟处理 。PBS漂洗3次，每次10min；

7）每孔加入适量的2.5%马血清进行封闭，湿盒常温30分钟，PBS漂洗 3次，每次10min；

8）用PBS按照1︰100稀释鼠抗人HBcAg。然后将稀释好的一抗滴加在细 胞上，湿盒4℃冰箱中过夜。

9）从4℃冰箱取出湿盒，常温下孵育2小时，PBS洗3次x5min；

10）每孔滴加50μl二抗，湿盒常温30分钟，PBS洗3次x5min；

11）每孔滴加50μl三抗，湿盒常温30分钟，PBS洗3次x5min；

12）DAB显色：用DAB显色试剂盒，取1mL双蒸水，A,B,C液各一滴，混 匀。每张爬片滴加50μl，避光反应5分钟，镜下观察控制染色时间。

13）蒸馏水洗3次，每次5分钟；

14）苏木素染色3~5分钟，蒸馏水洗3次；

15）1%盐酸乙醇处理3秒，水洗1min；

16）1%盐酸乙醇处理5秒，水洗1min；

17）PBS反蓝处理10秒；

18）中性树胶封片，镜检。

用细胞组织化学方法标记观察去感染后24h的各组细胞内的乙肝核心抗 原，高拷贝血清组的表达量低于DMSO处理组，正常血清组内只有细胞 核被染成蓝色，而胞浆中未观察到乙肝核心抗原（图6）。

3、Western Blot方法检测细胞内的HBcAg

①溶液配制

●细胞裂解缓冲液

HEPES（pH7.5） 10mmol/L EDTA 1mmol/L NaCl 100mmol/L PMSF（苯甲基磺酰氟） 100μg/mL Aprotinin（抑蛋白酶肽） 1μg/mL NP-40 1%

●10%SDS

SDS 10g 2dH₂O至 100mL

50℃水浴下溶解，室温条件下保存。如在保存中出现沉淀，水浴加热 沉淀溶解后即可使用。

●1mol/LTris·HCl（pH6.8）：

Tris(分子量为121.14) 30.29g 双蒸水 200mL

溶解后，浓盐酸调pH到6.8，双蒸水定容至250mL，高温灭菌后室温条 件下保存。

●1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）：

Tris(分子量为121.14) 45.43g 2dH₂O 200mL

充分溶解后，浓盐酸调pH到8.8，后用双蒸水定容至250mL，高温灭菌 后室温条件下保存。

● 10％过硫酸胺（AP）

过硫酸胺 0.1g 2dH₂O 1mL

充分溶解后，-20℃保存。

● 20％Tween20：

Tween20 15mL 2dH₂O定容至 150mL

混匀后4℃保存。

●30%（W/V）丙烯酰胺溶液配方

丙烯酰胺粉剂 29g 甲叉双丙烯酰胺粉剂 1g 2dH₂O 定容至100mL

过滤后置棕色瓶中避光室温保存。

●10×TBS buffer

Tris base 24.2g NaCl 80g 2dH₂O定容至 800mL

充分溶解后，用浓盐酸调pH到7.6，双蒸水定容至1000mL，常温保存， 使用时稀释10倍。

●TBST buffer：

20％Tween20 825μL 1×TBS 350mL

室温下保存，现配现用。

●1×SDS-PAGE（PH8.3）电泳缓冲液的配置：

Tris-Base 3.03g 甘氨酸： 18.77g SDS 1g 2dH₂O 800mL

双蒸水定容到1L，室温保存。

●封闭液：

脱脂奶粉 2.5g TBST 50mL

充分混匀后，现配现用。

●转膜缓冲液（PH8.4）的配制：

Tris-Base 5.8g 甘氨酸 2.9g SDS 0.37g 2dH₂O 600mL

双蒸水定容到800mL，再加入甲醇200mL，混匀，室温避光保存，使用 前置冰上预冷。

●封底胶的配制：

组份 封底胶（mL） 3dH₂O 100μL 30%丙烯酰胺 300μL 10%AP 100μL TEMED 2μL 2×SDS-PAGE电泳缓冲液 500μL

●SDS-PAGE分离胶的配制：

●SDS-PAGE浓缩胶的配制：

② Western blotting具体操作：

1）细胞蛋白的提取

a.去除感染后24h，48h，72h，96h，六孔板中的旧培养基，PBS洗3次 ，加入0.25%胰酶消化2min至细胞悬浮，转入1.5mLEP管中，2000rpm离 心5min，收集沉淀。

b.每管加入500μlRIPA buffer，冰上裂解30min，每孔10min，混匀 一次。

c.10000rpm，4℃离心10min，收集上清备用。

2）BCA蛋白定量

使用BCA蛋白定量试剂盒来给蛋白定量。

Ⅰ 配制工作液：BCA试剂A：BCA试剂B=50：1的比例配制成适量的BC A工作液；

Ⅱ 稀释标准品：把冻干标准品（BSA）以PBS稀释到2000μg/mL配成 储存液，然后据下表进行稀释：

Ⅲ 把10μL上述A-I各管中的标准品及10μL样品分别加至测试管内；

Ⅳ 将200μLBCA工作液加入各管内，37℃水浴30min；

Ⅴ 将测试管冷却10min到室温后测试蛋白样品浓度，要求在10min内 完成，使用NanoDrop2000测定样品A562处的吸光度值，在根据标准品 浓度以及相应吸光度值来绘制标准曲线，然后根据标准曲线来计算出 样品的蛋白浓度。

3）加入适量的1×SDS凝胶加样缓冲液，将样品置沸水中加热10 min ，灭活蛋白酶。

③ SDS-PAGE电泳

1）清洗玻璃板后，于通风处或者烤箱内晾干

2）将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，使用透明胶封闭底部，封好后垂直 放到制胶架上卡紧。根据上述方法配制好封底胶，混匀后立即将封底 胶注入到两层玻璃板之间，摇晃玻璃板使封底胶将玻璃板之间的底部 空隙均匀铺满，室温下放置10min使封底胶凝固。配制12%分离胶，将 分离胶沿着玻璃板边缘缓慢注入，胶面到达玻璃板高度约2/3时停止注 入，注入分离胶时候一定要沿着玻璃板缓慢注入，避免胶中产生气泡 。然后再注入少量蒸馏水以压平分离胶上缘，加水时一 定要十分缓慢，以免破坏分离胶。室温下静置30分钟等待胶凝固，注 意放置于水平桌面上。当分离胶与水之间形成一条很明显透明带时， 说明分离胶已经凝固。用滤纸小心将水吸干。配制浓缩胶，将浓缩胶 注满玻璃板之间的空隙后插入点样梳，室温静止30min~60min。

3）将玻璃板置入电泳槽，小心拔出点样梳，在槽内注入电泳缓冲液， 电泳液必须淹没内侧玻璃板，使胶体完全没入到电泳缓冲液中。拔出 梳子。

4）上样：按照预定顺序加样，每孔加入30ug蛋白量，加入5uL蛋白Ma rker。

5）电泳：先用低电压60V电泳待到蛋白样品电泳到分离胶与浓缩胶之 间时，换成120V继续直到溴酚蓝到达胶底，停止电泳。

6）转膜：根据实验需求将PVDF膜剪至适合大小后，在无水甲醇中浸泡 15S，然后将PVDF膜转移到转膜液中备用。撬开玻璃板切胶，注意动作 轻柔，避免将胶刮破。按照蛋白Marker所指示的条带，切下包括目的 蛋白的分离胶。小心将切下的目的胶转移到滤纸上，轻轻用玻璃棒赶 去气泡。将PVDF膜做好标记后覆盖于胶上，然后再用玻璃棒赶去气泡 。在膜上覆盖适当厚度的滤纸，盖上海绵垫后合气夹子。由于甲醇具 有刺激性对人体有害，在整个操作过程中一定要注意通风。将转膜夹 放入到转膜槽中，倒入转膜液，250mA，转1.5h到2h。（具体视待转的 蛋白分子量大小而定）

7）封闭：在转膜过程中配TBST液和封闭液，转膜结束后将PVDF膜在T BST液中漂洗3次，每次10min。漂洗结束后，将PVDF膜置于装有封闭液 的平皿中，将平皿放置到摇床上，室温下封闭2h。

8）孵育一抗：在封闭过程当中，用封闭液按照1︰1000稀释一抗。用 PE手套制作孵育袋。封闭好的PVDF膜用TBST液漂洗3次，每次10min。 然后将PVDF膜放到孵育袋中，加入一抗稀释液后，轻轻挤出袋中的气 泡，封口机封口。室温下摇床孵育3h，然后转入4℃冰箱过夜，第二天 将孵育袋从冰箱中取出后，再在室温下摇床孵育2h，TBST液漂洗3次， 每次10min。

9）孵育二抗：用TBST液稀释用辣根过氧化物酶标记的二抗，并按上述 方法做好抗体孵育袋，将PVDF膜转入到孵育袋中。加入二抗稀释液， 挤出气泡后封口。放置到摇床上室温孵育1h，再用TBST液漂洗。

10）化学发光，显影和定影：在暗室中取出适量ECL试剂盒中的A液和 B液到平皿中，以等体积混合1min。将PVDF膜放入平皿中，蛋白面朝上 ，用ECL工作液反复冲洗PVDF膜，5min后用滤纸轻轻吸净PVDF膜上多余 的ECL工作液，在显影夹中垫上一个剪好的PE手套，将PVDF膜转移到P E手套夹层中间，关掉红光灯观察条带的荧光强度。用剪刀剪X-光片至 适当大小后，打开显影夹将X-光片放置到PE手套膜上后关闭显影夹， 开始计时。根据条带的荧光信号强弱来调整曝光时间，一般为1min-3 min，如果荧光比较弱就延长曝光时间以达到最佳的效果。曝光完成后 ，取出X-光片，在显影液中显影5min-10min，然后用清水冲洗下，在 讲X-光片放到定影液中浸泡15min左右。收好X-光片，回收显影液和定 影液，即可出暗室观察Western Blot的结果（图7）。

通过实验证明细胞模型感染过程中细胞可以连续传代，不影响乙型肝 炎病毒的表达。去感染后96h（相当于感染120h）后，在细胞培养上清 中还可以检测中乙肝表面抗原和核心抗原的表达，细胞中也可以检测 到乙肝表面抗原和核心抗原。HBV可以在HepG2细胞复制，这与之前的 研究结果一致，但是在我们的实验中发现从去感染24h直到120h，都检 测到乙肝HBV-DNA，并且在去感染24h后在细胞培养上清中观察到了Da ne颗粒的存在，证实了在乙肝病毒在感染HepG2细胞后进入了细胞核。 这些结果显示用细胞模型体外感染细胞是可行的。