一种促使光合细菌菌株快速繁殖的促生长剂及其使用方法

摘要

本发明涉及一种促使光合细菌菌株快速繁殖的促生长剂及其使用方法，其促生长剂按重量份比将1份山梨酸、山梨酸钾或者山梨酸钠中的一种或者混合物，加入到1-4份乙醇中，搅拌、混合溶解处理，得到本产品促生长剂；将促生长剂加入到配制好的光合细菌液体培养基中，搅拌至充分溶解，接入活化的光合细菌菌种，装入密闭或半开放透光容器中，25～32℃下，1500-6000lux光照培养，所述光合细菌液体培养基中加入促生长剂的山梨酸根的浓度控制在0.005～1.0mmol/L范围内，本发明的优点是使用简便，用量少，成本低，可促进光合细菌菌体快速繁殖，而且使用安全，对生态环境友好，具有广阔的市场前景。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种促使光合细菌菌株快速繁殖的 促生长剂及其使用方法。

背景技术

光合细菌(Photosynthetic Bacteria简称PSB)生态分布极为广泛，主要分布在 海洋、江河、湖沼、活性污泥和土壤中，是一类水生、水圈微生物。光合细菌 以太阳光作为能源，以醋酸钠、乳酸钠、甘露醇、苹果酸、柠檬酸、葡萄糖、 甘油等多种有机物为碳源和氮源，具有生长繁殖速度快、培养基来源广泛、代 谢产物营养丰富等特点。光合细菌菌体含有丰富的蛋白质、氨基酸、生物必需 的维生素、抗病毒活性因子、辅酶Q10以及多种生理活性物质，能够提供生物 体所必需的营养，促进动植物生长，增强其抗病机能，减少疾病的发生，提高 生物存活率。其产品能广泛用于饲料工业、农业生产、环境保护等诸多方面， 愈来愈受到科技工作者和企业界人士重视。

光合细菌产品重要的指标为菌体细胞数量和纯度。现有的光合细菌生产工 艺大都采用开放式或半开放式液体光照培养，通过改进培养基营养成分、增加 光照强度、提高pH值、创造相对厌氧的培养环境来抑制杂菌生长。然而过高的 pH值会抑制光合细菌本身的生长，使最终的菌体细胞数量偏少；而且在以工农 业废水为原料（培养基）培养光合细菌的过程中，由于水体大多呈微酸性，消 耗大量碱液调高pH值不但成本高，而且污染环境，在这种微酸或者中性有氧环 境中，杂菌的感染也将不可避免，不利于光合细菌优势种群的建立。总之，现 有的光合细菌生产工艺在菌株生长速度、含有的菌体细胞数量、菌体纯度方面， 远远不能满足生产应用的要求。

发明内容

本发明为解决现有技术中的问题，提供一种能促使光合细菌菌株快速生长 繁殖、大大提高菌体细胞数量的促生长剂及其使用方法。

本发明采用以下技术方案予以实现：

一种促使光合细菌菌株快速繁殖的促生长剂，所述促生长剂为：按重量份 比将1份山梨酸、山梨酸钾或者山梨酸钠中的一种或者混合物，加入到1-4份乙醇 中，搅拌、混合溶解处理，得到本产品促生长剂；

所述搅拌、混合溶解处理的温度为-10～45℃，时间为1～10min；

所述乙醇为医用75-95%乙醇。

一种促使光合细菌菌株快速繁殖的促生长剂的使用方法：

将促生长剂加入到配制好的光合细菌液体培养基中，搅拌至充分溶解，接入 10-30%的活化的光合细菌菌种，装入密闭或半开放透光容器中，25～32℃下，光 照培养；

所述光合细菌液体培养基中加入促生长剂的山梨酸根的浓度控制在 0.005～1.0mmol/L范围内。

优选的，所述光合细菌液体培养基中加入促生长剂的山梨酸根的浓度为： 0.01～0.5mmol/L。更优选的为：0.03～0.1mmol/L。

所述光合细菌液体培养基是指实验室常用种子发酵培养基或按常规方式综 合处理的城市有机工业废水、农副产品废弃物或工业下脚料。

所述实验室常用种子发酵培养基组成如下：

氯化铵1.0g、醋酸钠1.0g、硫酸镁0.2g、碳酸氢钠1.0g、氯化钠0.5g、磷 酸氢二钾0.2g、柠檬酸铁0.005g、酵母膏1.0g、蛋白胨1.0g、无机盐类溶液10mL、 生长辅助因子0.01g、蒸馏水1000mL，PH=6.5～8.0；

其中生长辅助因子包括：维生素B1、氨基苯甲醇、生物素中的一种或几种 物质；

其中无机盐类溶液是指：每升蒸馏水中含有柠檬酸铁5mg、硫酸钙0.05mg、 硼酸1mg、二氯化锰0.05mg、硫酸锌1mg。

所述活化的光合细菌菌种的制备方法为：

将配制好的光合细菌实验室常用种子发酵培养基，装入150ml容量的透明 玻璃厌氧瓶中，经115℃高压灭菌30分钟，冷却后，严格无菌操作，接入沼泽 红假单胞菌Rhodopeudomonas palustris菌种，菌种保藏号CGMCC1.2180， 1500-6000lux光照培养3-5天，培养温度28-32℃，制得活化的光合细菌菌种。

菌种保藏号为CGMCC1.2180的沼泽红假单胞菌Rhodopeudomonas palustris 菌种是国家菌种保藏中心购买的菌种。

本发明与现有技术相比具有以下显著的优点：

1．促进光合细菌快速繁殖。在相同的适应生长条件下，应用本发明使光合 细菌生长繁殖快，较不添加该光合细菌促进剂繁殖速度快1～2天，大大提高产 品菌体细胞浓度。

2．添加量少，使用安全。该促使光合细菌菌株快速繁殖的生长剂属于食品 中允许使用的添加物，添加量少，属于安全添加范围，可用于农业、环保、医 药等诸多方面。

3．适用的培养基原料来源广泛。本发明适用的培养基原料可以是实验室常 用种子培养基；大批量生产光合细菌时，可以城市有机工业废水、工业下脚料、 农副产品废弃物经综合处理后为原料，接种光合细菌后进行发酵培养；在医药 业等方面应用，可以分析纯无机盐类化学试剂为原料，制成培养基，接种、培 养、提纯、精制制成光合细菌产品。

4．抑制杂菌生长。山梨酸可以抑制霉菌、酵母和好气性腐败菌生长，而不 抑制光合细菌生长，尤其在酸性条件下，0.02mmol/L的山梨酸即可起到抑菌作 用；以经过发酵处理的有机废水为原料进行光合细菌培养时，可抑制杂菌生长， 促进光合细菌生长，使光合细菌成为优势菌群，发挥更大的净水或积累有效物 质的作用。

5.菌体适应性好。本发明对市售多种光合细菌菌株均有促生长作用，对液 体培养基没有特殊要求，使用安全，对生态环境友好。

附图说明

图1为不同浓度光合细菌促生长剂对光合细菌生长的促进作用图

具体实施方式

下面参照附图对本发明具体实施方式进行详细说明。

实施例1

按下列步骤操作：

(1)光合细菌菌种活化（室内）：

配制光合细菌实验室常用种子发酵培养基，装入150ml容量的透明玻璃厌 氧瓶中，经115℃高压灭菌30分钟。冷却后，严格无菌操作，接入购买的沼泽 红假单胞菌（Rhodopeudomonas palustris菌种保藏号CGMCC1.2180）菌种，在 白炽灯光照2500lux下进行连续光照培养3～5天，培养温度28-32℃，制得经过 活化的光合细菌菌种。显微镜下检查光合细菌菌体健壮、运动活泼，无污染。

所述实验室常用种子发酵培养基的组成如下：

氯化铵1.0g、醋酸钠1.0g、硫酸镁0.2g、碳酸氢钠1.0g、氯化钠0.5g、磷 酸氢二钾0.2g、柠檬酸铁0.005g、酵母膏1.0g、蛋白胨1.0g、无机盐类溶液10mL、 生长辅助因子0.01g、蒸馏水1000mL，PH=7.0。

其中生长辅助因子包括：维生素B1、氨基苯甲醇、生物素等细菌培养常用 物质。

其中无机盐类溶液是指：微量的无机盐类溶液，每升蒸馏水中含有柠檬酸 铁5mg、硫酸钙0.05mg、硼酸1mg、二氯化锰0.05mg、硫酸锌1mg。

(2)不同浓度光合细菌促生长剂对光合细菌生长的促进作用（室内）：

在实验室条件下，进行光合细菌促生长剂添加浓度的优选。配制含有不同 浓度光合细菌促生长剂的光合细菌实验室常用种子发酵培养基，分别加入250ml 容量的透明玻璃厌氧瓶中，装量为180ml，经115℃高压灭菌30分钟，冷却备 用。

不同浓度光合细菌促生长剂的成分组成见设计方案表1，共设11个处理， 编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11（对照），将活化好的光合细菌菌 种按照10%接种量，接入到冷却好的含有光合细菌促生长剂的实验室常用种子 发酵培养基中，在白炽灯光照2500lux下进行连续光照培养(温度28-32℃)4天， 测定光合细菌菌数。

表1

试验中不同浓度光合细菌促生长剂配制方法为：

称量表1所示计算量的山梨酸和乙醇，放入烧杯，室温下搅拌3分钟，混合 溶解，加入光合细菌实验室常用种子发酵培养基中，充分搅拌溶解。

试验结果：如表2、图1所示。

图1是不同浓度光合细菌促生长剂对光合细菌生长的促进作用图，纵坐标 为菌数（亿/ml），横坐标为不同的光合细菌浓度。

表2

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11（对照） 菌数（亿/ml） 16.2 16.8 18.7 19.8 20.3 19.8 19.3 17.7 16.8 16.6 15.1

试验结果（表2）表明，试验各浓度山梨酸和乙醇混合物均可促进光合细菌 的生长，其中菌数较高的取值范围为0.01～0.5mmol/L（3～8号处理），菌数更高 的取值范围为0.03～0.1mmol/L（4～7号处理），其中以5号处理加入添加剂量（0.05 mmol/L）菌数最高。

实施例2

对本发明可按下列步骤操作：

(1)光合细菌菌种活化：同实施例1(1)；

(2)方法同实施例1(2)。

不同之处在于，加入的光合细菌促生长剂的成分组成见设计方案表3，

加入不同浓度的乙醇(其加入量见设计方案表3)，共设7个处理，编号为1、 2、3、4、5、6、7（对照）。

表3

编号 1 2 3 4 5 6 7 山梨酸（mmol/L） 0.05 0.08 0 0 0 0 0 山梨酸钾（mmol/L） 0 0 0.05 0.08 0 0 0 山梨酸钠（mmol/L） 0 0 0 0 0.05 0.08 0 乙醇（mmol/L） 0.15 0.20 0.15 0.20 0.15 0.20 0

试验结果：如表4所示。

试验结果表明，实验室常用种子培养基中分别添加0.05mmol/L或0.08 mmol/L的山梨酸、山梨酸钾、山梨酸钠与乙醇的混合物，均可促进光合细菌的 生长，提高光合细菌菌数。

表4

编号 1 2 3 4 5 6 7 菌数（亿/ml） 19.7 19.2 19.9 20.5 20.4 20.8 16.3

实施例3

对本发明可按下列步骤操作：

(1)光合细菌菌种活化：同实施例1(1)；

(2)光合细菌促生长剂在不同pH值条件下培养对生长的影响（在实验室条 件下）：操作方法同实施例1(2)；

不同之处在于，实验室常用种子培养基中加入的光合细菌促生长剂的成分 组成为0.05mmol/L的山梨酸和0.2mmol/L的乙醇，调节pH值分别为6.5、7.0、 7.5、8.0。

试验结果：不同pH值培养条件的培养结果如表5。

表5

pH值 6.5 7.0 7.5 8.0 光合细菌促生长剂（亿/ml） 19.2 20.8 20.2 18.6 对照（亿/ml） 16.5 16.3 15.6 14.8

试验结果表明，pH值在6.5～8.0范围内，添加0.05mmol/L的山梨酸和 9mmol/L的乙醇均可不同程度促进光合细菌生长，经过4天的培养，大大提高 菌体细胞浓度。

实施例4

(1)光合细菌菌种活化：同实施例1(1)；

(2)扩大发酵培养：

配置实验室常规种子发酵培养基（pH7.5）10L，加入0.015g山梨酸钾（相 对于0.1mmol/L）和0.5ml乙醇的混合物，搅拌溶解，方法同实施例1(2)，以不 加山梨酸钾和乙醇实验室常规种子发酵培养基为对照，按30％接种量接入经过 活化的光合细菌菌种，装入5000毫升透明的玻璃瓶(也可以采用白色塑料桶)内 (培养基量为70％)，置于自然太阳光下照射培养(温度25-32℃范围内)，8天扩大 发酵培养成熟。

结果表明：经过8天的培养，光合细菌菌体细胞数量达到18亿/毫升以上， 添加山梨酸可以促进光合细菌的生长，较不添加山梨酸的对照组菌数高17.8%。 显微镜下检查光合细菌运动活泼，菌体健壮，无污染、无异常现象，可应用于 蔬菜或中药等作物的施肥，也可用于畜禽养殖。

实施例5

(1)光合细菌菌种活化：同实施例1(1)；

(2)扩大发酵培养：

将光合细菌种子发酵培养液(活跃的光合细菌数，每m1达到10亿个以上)， 按20％转接到扩大发酵培养基中扩繁，本扩大用发酵培养基选用啤酒废水，用 氢氧化钠调节pH值为6.5～7.0，在10公斤白色塑料桶中装啤酒废水8公斤，每 升加入0.1mmol/L的山梨酸钾和0.5ml乙醇的混合物，搅拌混合溶解。转接后的 白色塑料桶可放在自然太阳光照下培养，10天成熟，其技术指标可达到如表6。

表6

实施例6

对本发明可按下列步骤操作：

(1)光合细菌菌种活化：同实施例1(1)；

(2)扩大发酵培养：将光合细菌种子发酵培养液(含活跃的光合细菌数， 每m1达到10亿个)，按30％接种量转接到扩大发酵培养基中扩繁，本扩大发酵 培养基选用养猪场有机废水（pH7.0），在10公升白色塑料桶中装有养猪场有机 废水7公斤，每升再添加一定量的山梨酸钾（详细添加量见表7）和1ml乙醇的 混合物，然后放在自然太阳光照下培养(温度25～33℃)10天，其光合细菌含量可 达到如下表7。

表7

试验结果表明，添加山梨酸钾有利于复杂微生物环境下光合细菌的生长。

本发明实施例中所采用的光合细菌菌种均可市购获得，对其并无特殊要求。

试验中若使用山梨酸钾、山梨酸钠等可溶性盐，可将乙醇和山梨酸盐直接加 入光合细菌液体培养基中，搅拌至充分溶解。

本发明应用时扩大发酵培养基的选取原则为：

在农业、畜禽业、环保业应用，可以城市有机工业废水、工业下脚料、农副 产品废弃物经综合处理后为原料，再加入添加剂；在医药业等方面应用，则应 以分析纯无机盐类化学试剂为原料，制成培养基，接种、培养。

本发明添加剂对于优势的光合细菌菌种，其应用效果更为显著。