一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法

摘要

本发明涉及一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法。DNA提取量小且有重金属离子，PCR扩增结果低，不适用于进行分子生物学研究。本发明先将标本皮张在常温下用酒精浸泡，再用蒸馏水冲洗至无杂物，用Na2HPO4溶液在不断振荡条件下处理20~28小时，用蒸馏水冲洗2~3遍；将标本用浸泡液浸泡1.5~2.5小时，置于离心管内，向离心管内加入500μl消化液，再进行离心分离、沉淀；二次抽提时加入7uL完全悬浮的DNAIQTM系统中的DNAIQTM树脂，高速涡旋振荡数秒钟，并进行磁分离，分离结束后，将DNA溶液小心地转移到容器中。本发明可有效去除重金属离子，产品浓度大，纯度高，适用于所有经过鞣制处理的标本皮张。

说明书

技术领域

本发明涉及生物DNA技术领域，具体涉及一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法。

背景技术

随着科技的发展，DNA分子标记技术已广泛应用于生物基因组研究，生物的遗传育种、起源进化、分类、医学及法医破案等诸多方面，并成为现代分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。这些都是针对DNA的研究，所以提取到高纯度，高浓度的DNA是所有研究的基础。对于动物DNA的提取，最常见的是从肌肉、血液以及各种内脏中获得，因为这些组织的DNA含量多，组织处理较容易，提出的DNA片段较完整，适用于各种分子生物学研究。但是野生动物的分子遗传学研究经常受到个体数量、样品来源地的空间分布、样品采集时间跨度等的限制。要获得一些动物的肌肉、血液，或者内脏等实验材料都是非常困难的，对于一些己经灭绝的动物来说，这根本就是不可能的。因此在进行分子生物学研究时，需要馆藏鞣制动物标本来补充野外标本收集的不足。

目前鞣制动物标本皮张DNA的提取采用的是常规的动物DNA的提取方法，但是实践证明从标本中提取DNA往往是不可行的。因为这些标本大多都经过各种处理，含有大量水溶性重金属离子、鞣剂等酶抑制剂等，对DNA提取会有一定程度的干扰，导致从这些样品中提取的DNA量一般都比较少，在进行PCR扩增检查DNA提取时，仅有不到10%能够扩增出条带，显示提取到DNA。因此现有技术存在的问题是：DNA提取量小且有重金属离子，PCR扩增结果低，不适用于进行分子生物学研究。

发明内容：

本发明的目的是要提供一种高效的鞣制动物标本皮张DNA的提取方法，以克服现有技术存在的DNA提取量小且有重金属离子，PCR扩增结果低，不适用于进行分子生物学研究的问题。

本发明的目的是这样实现的，一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法，依次包括下述步骤：

1）原料的处理：

①将经过鞣制处理的动物标本皮张在常温下用酒精浸泡，再用蒸馏水冲洗至无杂物备用；

②剪取皮张，用Na₂HPO₄溶液在不断振荡条件下处理20~28小时，用蒸馏水冲洗2~3遍；

2）消化：

  将标本用浸泡液浸泡1.5~2.5小时，弃浸泡液，用剪刀尽量剪碎，置于离心管内，向离心管内加入500μl 消化液，24ul 0.5mol/L EDTA，6ul 20mg/ml蛋白酶K，在55℃下存放 3-5小时；离心分离，取200μl上清液于另一离心管中；

所述浸泡液为10mmol/L Tris - HCl、100mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl，pH8.0； 

3）分离、沉淀：

向离心管中加入200μlTris-饱和酚(pH8.0)，轻轻地摇动混合8~12分钟，离心分离，重复此步骤一次；将上清移至一个新的离心管中，再加入200μl氯仿，轻轻地摇动混合8~12分钟，离心分离，取上清并重复此步骤一次；取上清移入一个新的离心管中，加入2.5倍体积的冷无水乙醇，轻轻地摇动片刻，置于冰箱中于- 20 ℃条件下冷冻25~35分钟；离心分离，小心弃去上清；吸取200μL70%乙醇洗涤片刻，离心分离，小心弃去上清，室温下打开离心管盖，使乙醇蒸发10-20分钟；用30μl TE （10 mmol/L Tris - HCl、10 mmol/L EDTA，pH8.0）缓冲液室温下溶解DNA沉淀；

4）二次抽提：

向提取好的DNA溶液中加入7uL完全悬浮的DNA IQ^TM系统中的DNA IQ^TM树脂，高速涡旋振荡数秒钟，并进行磁分离，分离结束后，将DNA溶液小心地转移到容器中。

上述步骤2）中消化液为Promega公司生产的Nuclei Lysis Sol’n试剂。

上述步骤4）中的磁分离步骤包括下述步骤：

①将管子放在磁分离架上，磁分离立刻进行。小心去除所有溶液，不要触碰管壁上的树脂，加入100μL裂解缓冲液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡数秒，将管子放回到磁分离架上，并去除所有的裂解液；

②加入100μL配制的１x 洗涤液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡数秒，将管子放回到磁分离架上，去掉所有洗涤液；打开盖子，将管子放在磁分离架上，空气中干燥，加入25-100μL洗脱液，盖上管盖并高速涡旋振荡数秒；

③65℃温育5~8分钟，取出温育的管子，高速涡旋振荡数秒，立即放到磁分离架上，分离结束。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1、本发明可有效去除重金属离子，产品浓度大，纯度高，可以用来做PCR扩增等分子实验，在进行PCR扩增检测DNA时，有85%以上的样品能够扩增出条带，显示提取到DNA。

2、本发明适用于所有经过鞣制处理的标本皮张，也可用于皮革制品的真假鉴定、非法贸易野生动物制品物种鉴定等也可用于皮革制品的真假鉴定、非法贸易野生动物制品物种鉴定等工作。

具体实施方式：

下面将结合实施例对本发明进行详细地说明。

实施例1：

一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法，依次包括下述步骤

1）原料的处理：

①将经过鞣制处理的林麝标本皮张在常温下用酒精浸泡半小时，再用蒸馏水冲洗至无杂物备用；

②剪取约0. 5 cm² 的皮张，用1ml 0.03M Na₂HPO₄溶液在不断振荡条件下处理24小时，用蒸馏水冲洗3遍；

2）消化：

  将标本用浸泡液（10mmol/L Tris - HCl、100mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl，pH8.0）浸泡2小时，弃浸泡液，用剪刀尽量剪碎，置于1. 5ml离心管内，向离心管内加入500μl 消化液（Promega公司生产的Nuclei Lysis Sol’n试剂），24ul 0.5mol/L EDTA，6ul 20mg/ml蛋白酶K，在55℃下存放 3小时；12000r/min离心5分钟，取200μl上清液于另一离心管中； 

3）分离、沉淀：

向离心管中加入200μlTris-饱和酚(pH8.0)，轻轻地摇动混10分钟，12000 r/min离心10分钟，重复此步骤一次；将上清移至一个新的1.5ml离心管中，再加入200μl氯仿，轻轻地摇动混合10分钟，12000 r/min离心10分钟，取上清并重复此步骤一次；取上清移入一个新的1.5ml离心管中，加入2.5倍体积的冷无水乙醇，轻轻地摇动片刻，置于冰箱中于- 20 ℃条件下冷冻30分钟；13000 r/min离心15 min，小心弃去上清；吸取200μL70%乙醇洗涤片刻，13000 r/min离心15分钟，小心弃去上清，室温下打开离心管盖，使乙醇蒸发20分钟；用30μl TE （10 mmol/L Tris - HCl、10 mmol/L EDTA，pH8.0）缓冲液室温下溶解DNA沉淀；

4）二次抽提：

向提取好的DNA溶液中加入7uL完全悬浮的DNA IQ^TM系统中的DNA IQ^TM树脂，高速涡旋振荡3秒钟，并进行磁分离，所述磁分离步骤包括下述步骤：

①将管子放在MagneSphere                                               磁分离架上，磁分离立刻进行，小心去除所有溶液，不要触碰管壁上的树脂，加入100μL裂解缓冲液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡2秒钟，将管子放回到磁分离架上，并去除所有的裂解液；

②加入100μL配制的１x 洗涤液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡2秒钟，将管子放回到磁分离架上，去掉所有洗涤液，打开盖子，将管子放在磁分离架上，空气中干燥5分钟，加入25μL洗脱液，盖上管盖并高速涡旋振荡2秒钟。

③65℃温育5分钟。取出温育的管子，高速涡旋振荡2秒钟，立即放到磁分离架上。

分离结束后，将DNA溶液小心地转移到选定的容器中。

进行PCR扩增检测DNA，显示提取到DNA。

实施例2：

一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法，依次包括下述步骤

1）原料的处理：

①将经过鞣制处理的斑羚标本皮张在常温下，用酒精浸泡40分钟、再用蒸馏水冲洗至无杂物备用；

②剪取约1 cm² 的皮张，用5ml 0.03M Na₂HPO₄溶液在不断振荡条件下处理28小时，用蒸馏水冲洗3遍；

2）消化：

  将标本用浸泡液（10mmol/L Tris - HCl、100mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl，pH8.0）浸泡2.5小时，弃浸泡液，用剪刀尽量剪碎，置于1. 5ml离心管内，向离心管内加入500μl 消化液（Promega公司生产的Nuclei Lysis Sol’n试剂），24ul 0.5mol/L EDTA，6ul 20mg/ml蛋白酶K，在55℃下存放5小时；12000r/min离心6分钟，取200μl上清液于另一离心管中； 

3）分离、沉淀：

向离心管中加入200μlTris-饱和酚(pH8.0)，轻轻地摇动混10分钟，12000 r/min离心8分钟，重复此步骤一次；将上清移至一个新的1.5ml离心管中，再加入200μl氯仿，轻轻地摇动混合8分钟，12000 r/min离心12分钟，取上清并重复此步骤一次；取上清移入一个新的1.5ml离心管中，加入2.5倍体积的冷无水乙醇，轻轻地摇动片刻，置于冰箱中于- 20 ℃条件下冷冻35分钟；13000 r/min离心12min，小心弃去上清；吸取200μL70%乙醇洗涤片刻，13000 r/min离心12分钟，小心弃去上清，室温下打开离心管盖，使乙醇蒸发15分钟；用30μl TE （10 mmol/L Tris - HCl、10 mmol/L EDTA，pH8.0）缓冲液室温下溶解DNA沉淀；

4）二次抽提：

向提取好的DNA溶液中加入7uL完全悬浮的DNA IQ^TM系统中的DNA IQ^TM树脂，高速涡旋振荡2秒钟，并进行磁分离，所述磁分离步骤包括下述步骤：

①将管子放在MagneSphere磁分离架上，磁分离立刻进行，小心去除所有溶液，不要触碰管壁上的树脂。加入100μL裂解缓冲液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡3秒钟，将管子放回到磁分离架上，并去除所有的裂解液；

②加入100μL配制的１x 洗涤液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡3秒钟，将管子放回到磁分离架上，去掉所有洗涤液，打开盖子，将管子放在磁分离架上，空气中干燥8分钟，加入100μL洗脱液，盖上管盖并高速涡旋振荡3秒钟；

③65℃温育8分钟。取出温育的管子，高速涡旋振荡3秒钟，立即放到磁分离架上。

分离结束后，将DNA溶液小心地转移到选定的容器中。

进行PCR扩增检测DNA，显示提取到DNA。

实施例3：

一种鞣制动物标本皮张DNA的提取方法，依次包括下述步骤

1）原料的处理：

①将经过鞣制处理的金丝猴标本皮张在常温下，用酒精浸泡25分钟、再用蒸馏水冲洗至无杂物备用；

②剪取约0.8 cm² 的皮张，用3ml 0.03M Na₂HPO₄溶液在不断振荡条件下处理24小时，用蒸馏水冲洗2遍；

2）消化：

  将标本用浸泡液（10mmol/L Tris - HCl、100mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl，pH8.0）浸泡1.5小时，弃浸泡液，用剪刀尽量剪碎，置于1. 5ml离心管内，向离心管内加入500μl 消化液（Promega公司生产的Nuclei Lysis Sol’n试剂），24ul 0.5mol/L EDTA，6ul 20mg/ml蛋白酶K，在55℃下存放3小时；12000r/min离心5分钟，取200μl上清液于另一离心管中； 

3）分离、沉淀：

向离心管中加入200μlTris-饱和酚(pH8.0)，轻轻地摇动混8分钟，12000 r/min离心8分钟，重复此步骤一次；将上清移至一个新的1.5ml离心管中，再加入200μl氯仿，轻轻地摇动混合8分钟，12000 r/min离心12分钟，取上清并重复此步骤一次；取上清移入一个新的1.5ml离心管中，加入2.5倍体积的冷无水乙醇，轻轻地摇动片刻，置于冰箱中于- 20 ℃条件下冷冻25分钟；13000 r/min离心12min，小心弃去上清；吸取200μL70%乙醇洗涤片刻，13000 r/min离心12分钟，小心弃去上清，室温下打开离心管盖，使乙醇蒸发15分钟；用30μl TE （10 mmol/L Tris - HCl、10 mmol/L EDTA，pH8.0）缓冲液室温下溶解DNA沉淀；

4）二次抽提：

向提取好的DNA溶液中加入7uL完全悬浮的DNA IQ^TM系统中的DNA IQ^TM树脂，高速涡旋振荡2秒钟，并进行磁分离，所述磁分离步骤包括下述步骤：

①将管子放在MagneSphere 磁分离架上，磁分离立刻进行，小心去除所有溶液，不要触碰管壁上的树脂。加入100μL裂解缓冲液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡3秒钟,将管子放回到磁分离架上，并去除所有的裂解液；

②加入100μL配制的１x 洗涤液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡3秒钟，将管子放回到磁分离架上，去掉所有洗涤液，打开盖子，将管子放在磁分离架上，空气中干燥8分钟，加入100μL洗脱液，盖上管盖并高速涡旋振荡3秒钟；

③65℃温育8分钟。取出温育的管子，高速涡旋振荡3秒钟，立即放到磁分离架上。

分离结束后，将DNA溶液小心地转移到选定的容器中。

进行PCR扩增检测DNA，显示提取到DNA。