Xa10与AvrXa10之间的分子相互作用

摘要

本发明提供了用于赋予植物中对细菌疾病抗性的核酸及方法。本发明还提供了用于在转基因植物中控制表达的启动子及启动子序列。

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发明背景

本发明一般而言涉及植物分子生物学和遗传学，以及赋予植物细菌性 疾病抗性的方法。本发明还涉及可用于控制在转基因植物中表达的启动子 和启动子序列。

本发明中说明本发明背景或者关于实施本发明提供另外的详细描述的 出版物及其它材料并入本文作参考，方便起见分别在参考文献中示出。

革兰氏阴性致病菌使用III型分泌系统(TTSS)将效应蛋白转位进植物细 胞中，在此其调节宿主细胞功能以有益于侵入过程(He et al.,2004)。黄单胞 菌(Xanthomonas)和青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的致病变型具有 大的AvrBs3效应子(effector)家族(Schornack et al.,2006;Heuer et al.,2007)。 AvrBs3-样效应子，也称作转录激活子样(TAL)III型效应子(Yang et al., 2006)，是显著相似的。每个均具有重复数目不同的34个氨基酸序列的中 心近完美重复，不完美的七个一组的亮氨酸拉链(LZ)重复，三个高保守的 C-末端核定位信号(NLS)，以及C-末端酸性转录激活子样结构域(AAD)。一 些研究表明来自稻黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv oryzae) (Xoo)和野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变之种(Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria)(Xcv)的TAL效应子特异性激活关联宿主基因以促进疾病易感 性(Yang et al.,2006;Sugio et al.,2007;Kay et al.,2007)或者引发疾病抗性 (Gu et al.,2005;Romer et al.,2007)。近来，TAL效应子的DNA结合特异性 的密码被破解，其基于来自胡椒(Capsicum annuum)的关联Bs3和upa基因 的启动子中保守的AvrBs3结合位点以及一些其它TAL效应子结合位点的 详细鉴定(Kay et al.,2009;Romer et al.,2009a;Boch et al.,2009)。根据建议的 模型，包括最C-末端半重复(most C-terminal half repeat)的每个TAL效应子 重复，其在位置12和13示出超变氨基酸，特异性识别宿主基因启动子的 DNA结合位点中的一个核苷酸及在5’末端的保守的T(Boch et al.,2009)。

由Xoo导致的稻细菌枯萎病(bacterial blight)是稻的最具破坏性的细菌 性疾病之一，在全亚洲的灌溉和降雨低地稻生长区域中流行(Mew,1987)。 宿主遗传抗性的利用是控制这种疾病的最经济有效的途径。在栽培的和野 生的稻中鉴别了超过30个对Xoo具有种族特异性抗性的抗性(R)基因或基 因座(Nino-Liu et al.,2006)。其中六个已经被克隆，其基因产物示出显著多 样性(Chu et al.2006;Gu et al.2005;Iyer and McCouch,2004;Song et al., 1995;Sun et al.,2004;Yoshimura et al.,1998)。发现R基因Xa27(Gu et al., 2005)和疾病易感基因Os8N3或者隐性R基因xa13的易感等位基因(Yang et  al.,2006)分别被TAL效应子AvrXa27和PthXo1特异性诱导。近来鉴别了 其关联宿主基因的启动子中两个TAL效应子的结合位点(Romer et al., 2009b;Boch et al.,2009).近来的遗传学研究表明一般性转录因子 OsTFIIAγ5是AvrXa27完全激活稻中的Xa27转录及Xa27-介导的对细菌枯 萎病的疾病抗性所需的(Gu et al.2009)。

细菌枯萎病R基因Xa10最初从稻栽培种Cas209中鉴别(Mew et al., 1982；Yoshimura et al.,1983)，随后渐渗入易感稻品种IR24中(Ogawa et al., 1988)。来自Xoo菌株PXO86的关联avrXa10基因编码TAL III型效应子 的一个成员(Hopkins et al.,1992)。Xa10基因座最初作图到染色体11的长臂 (11L)，在近端(proximal)RAPD标记O072000(5.3cM)与远端(distal)RFLP标 记CDO365(16.2cM)之间的区域中(Yoshimura et al.,1995)。近来其被作图 到近端标记M491与远端标记M419之间的遗传距离0.28cM，并且与标记 S723和M604共分离(Gu et al.,2008)。

因此，希望揭示赋予稻及其它植物细菌性疾病抗性的核酸和方法。也 希望揭示可用于稻及其它植物物种的遗传工程中的分离的启动子或启动子 序列。

发明概述

本发明一般性涉及植物分子生物学和遗传学，及涉及赋予植物细菌性 疾病抗性的核酸及方法。本发明还涉及可用于在转基因植物中控制表达的 启动子和启动子序列。根据本发明，描述了编码抗性基因Xa10的基因的克 隆和鉴定，其赋予细菌枯萎病抗性。在一个实施方案中，所述抗性是针对 由黄单胞菌导致的细菌枯萎病。在另一个实施方案中，所述植物是稻。在 进一步的实施方案中，所述植物是大麦、燕麦、小麦、玉米、甘蓝、花椰 菜、马铃薯、番茄、胡椒、辣椒、大豆或油菜籽。

因此，第一方面，本发明提供了分离的核酸，其编码：具有SEQ ID  NO:37所示氨基酸序列的Xa10多肽，或者(ii)与所述Xa10多肽具有至少 50%相同性的多肽，其中(ii)的多肽当转染进植物中时为植物提供了黄单胞 菌抗性。在一个实施方案中，(ii)的多肽具有至少60%相同性。在另一个实 施方案中，(ii)的多肽具有至少70%相同性。在另一个实施方案中，(ii)的多 肽具有至少80%相同性。在进一步的实施方案中，(ii)的多肽具有至少90% 相同性。在另一个实施方案中，(ii)的多肽具有至少95%相同性。在再一个 实施方案中，(ii)的多肽具有至少98%相同性。在进一步的实施方案中，(ii) 的多肽具有至少99%相同性。在一个实施方案中，编码Xa10多肽的核酸具 有SEQ ID NO:35所示核苷酸序列。在另一个实施方案中，编码Xa10多肽 的核酸具有SEQ ID NO:36所示核苷酸序列。在再一个实施方案中，编码 Xa10多肽的核酸具有SEQ ID NO:36的第54-437位核苷酸所示核苷酸序 列。在进一步的实施方案中，编码Xa10多肽的核酸具有SEQ ID NO:35的 第2423-3234位核苷酸所示核苷酸序列。在另一个实施方案中，编码(i)或(ii) 的多肽的分离的核酸可以与编码如本文所述一异源多肽的核酸可操纵地连 接。本发明还提供了如本发明所述的Xa10多肽。此外，本发明提供了包含 所述分离的核酸的植物细胞及包含所述植物细胞的对黄单胞菌抗性的转基 因植物。

第二方面，本发明提供了包含分离的核酸的载体，所述核酸编码(i)具 有SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的Xa10多肽，或者(ii)与所述Xa10多肽 具有至少50%相同性的多肽，其中(ii)的多肽当如本发明所述转染进植物中 时提供了对黄单胞菌抗性的植物。在一个实施方案中，所述载体进一步包 含植物启动子，其与所述分离的核酸可操纵地连接。在另一个实施方案中， 所述启动子选自组织特异性启动子，组成性启动子和可诱导启动子。在再 一个实施方案中，启动子选自具有SEQ ID NO:38所示核苷酸序列的Xa10 启动子，具有SEQ ID NO:38的第1-2422位核苷酸所示核苷酸序列的Xa10 启动子，及具有SEQ ID NO:39所示核苷酸序列的Xa10启动子。在进一步 的实施方案中，启动子选自含有具有SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的 AvrXa10框(box)的启动子，及含有AvrXa10框的衍生物的启动子，其中所 述AvrXa10框的衍生物选自：具有SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的衍生 物，具有SEQ ID NO:28所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO:30所 示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO:31所示核苷酸序列的衍生物，具 有SEQ ID NO:68所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO:72所示核苷 酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO:73所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ  ID NO:74所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO:82所示核苷酸序列 的衍生物，具有SEQ ID NO:83所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID  NO:84所示核苷酸序列的衍生物及具有SEQ ID NO:85所示核苷酸序列的 衍生物。本发明还提供了包含所述载体的植物细胞及包含所述植物细胞的 对黄单胞菌抗性的转基因植物。在另一个实施方案中，所述载体中编码(i) 或(ii)的多肽的分离的核酸如本发明所述可以与编码异源多肽的核酸可操纵 地连接。

第三方面，本发明提供了(i)使植物对黄单胞菌有抗性的方法，(b)增强 植物中黄单胞菌抗性的方法，及(c)赋予植物黄单胞菌疾病抗性的方法。这 些方法每种均包括将本发明所述分离的核酸或载体转染至一个或多个植物 细胞中，以及使所转染的一个或多个植物细胞生长植物的步骤，其中所述 分离的核酸在所述植物中表达。将所述核酸或载体转染进植物细胞中在本 发明中有时也称作用核酸或载体转化植物细胞。

第四方面，本发明提供了分离的核酸，其在植物中具有启动子活性。 在一个实施方案中，所述核酸具有SEQ ID NO:38所示核苷酸或者SEQ ID  NO:38的第1-2422位核苷酸所示核苷酸序列序列。在另一个实施方案中， 所述核酸具有SEQ ID NO:39所示核苷酸序列。在进一步的实施方案中，所 述核酸包含含有SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的植物可操纵的启动子，在 另一个实施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的植 物可操纵的启动子。在再一个实施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID  NO:28所示核苷酸序列的植物可操纵的启动子。在进一步的实施方案中， 所述核酸包含含有SEQ ID NO:30所示核苷酸序列的植物可操纵的启动子。 在另一个实施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID NO:31所示核苷酸序列的 植物可操纵的启动子。在再一个实施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID  NO:68所示核苷酸序列的植物可操纵的启动子。在进一步的实施方案中， 所述核酸包含含有SEQ ID NO:72所示核苷酸序列的植物可操纵的启动子。 在另一个实施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID NO:73所示核苷酸序列的 植物可操纵的启动子。在进一步的实施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID  NO:74所示核苷酸序列的植物可操纵的启动子。在另一个实施方案中，所 述核酸包含含有SEQ ID NO:82所示核苷酸序列的植物可操纵的启动子。在 再一个实施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID NO:83所示核苷酸序列的植 物可操纵的启动子。在进一步的实施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID  NO:84所示核苷酸序列的植物可操纵的启动子。在另一个实施方案中，所 述核酸包含含有SEQ ID NO:85所示核苷酸序列的植物可操纵的启动子。本 发明还提供了核酸构建体，其包含与编码感兴趣的核酸的第二种核酸可操 纵地连接的具有启动子活性的核酸。此外，本发明提供了转基因植物细胞 或转基因植物，在其基因组中含有所述核酸构建体。本发明进一步提供了 产生转基因植物细胞或转基因植物的方法。转基因植物细胞通过将所述核 酸构建体转移进植物细胞中而产生。转基因植物通过从转基因植物细胞再 生植物而产生。

第五方面，本发明提供了在转基因植物中控制基因表达的应用和方法。 在一个实施方案中，本发明描述的具有启动子活性的分离的核酸用于在转 基因植物中控制基因表达。在另一个实施方案中，编码具有SEQ ID NO:54 所示氨基酸序列的AvrXa10多肽的核酸用于在含有具有本文所述启动子活 性的分离的核酸的转基因植物中控制基因表达。在进一步的实施方案中， 具有SEQ ID NO:54所示氨基酸序列的AvrXa10多肽用于在含有具有本文 所述启动子活性的分离的核酸转基因植物中控制基因表达。在一个实施方 案中，编码AvrXa10多肽的核酸具有SEQ ID NO:57所示核苷酸序列。在 另一个实施方案中，编码AvrXa10多肽的核酸具有GenBank登录号U50552 所示核苷酸序列。

附图简述

图1A-1D示出基于作图的Xa10基因的克隆。图1A:Xa10基因座的遗 传学图和物理图(physical map)。上部分是使用分子标记M491、S723和M419 确定的Xa10基因座的遗传学图，如先前Gu et al.(2008)所述。44M10是BAC 克隆，通过标记M491和S723而鉴别。在下面示出了用于互补检测的二元 载体pC1300中44M10的亚克隆。垂直线连接M491和Xa10基因座的遗传 位置与其在物理图的位置。产生细菌枯萎病(BB)抗性植物的亚克隆用“+”表 示，其它的标示为“-”。Xa10基因的位置用箭头表示转录方向的短粗线表示。 图1B:在用稻黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv oryzae)(Xoo)菌 株接种后两周野生型和转基因植物的表型。L1，用PXO99接种的IR24； L2，用PXO99(pHM1avrXa10)接种的IR24；L3，用PXO99接种的IRBB10A； L4，用PXO99(pHM1avrXa10)接种的IRBB10A；L5，用PXO99接种的 Nipponbare；L6，用PXO99(pHM1avrXa10)接种的Nipponbare；L7，用PXO99 接种的Xa10转基因品系L198；L8，用PXO99(pHM1avrXa10)接种的L198. 图1C:Xa10基因的基因结构。图中示出了编码区(黑色条)，5'和3'UTR的 位置(阴影框)，翻译起始密码子(ATG)，翻译终止密码子(TGA)，5'和3'剪接 点(ga和cg)。数字表示每个子结构的碱基对。图1D:推定的Xa10基因的 氨基酸序列(SEQ ID NO:37)。推定的信号肽以下划线示出。

图2示出在不同的稻栽培种中Xa10基因的检测。将大约5μg的稻基因 组DNA用HindIII消化，并用于在每个泳道中进行Southern印迹分析。 Southern滤膜用来自Xa10编码区的探针检测，使用引物SP1F和SP1R。M， 用HindIII消化的Lambda DNA标记。

图3A和3B示出Xa10的异位表达提供了对相容的稻黄单胞菌稻致病 变种(Xanthomonas oryzae pv oryzae)菌株的增强的抗性。图3A:用Xoo菌株 接种后两周的IRBB10A和转基因植物的表型。L1，用PXO99接种的 IRBB10A；L2，用PXO99(pHM1avrXa10)接种的IRBB10A；L3，用PXO99 接种的Nipponbare；L4，用PXO99(pHM1avrXa10)接种的Nipponbare；L5， 用PXO99接种的转基因品系L198；L6，用PXO99(pHM1avrXa10)接种的 转基因品系L198；L7，用PXO99接种的转基因品系L162；L8，用 PXO99(pHM1avrXa10)接种的转基因品系L162。图3B:在未接种的和接种 的植物中Xa10的实时PCR分析。稻遍在蛋白1基因的表达用作内部对照。 结果以在用PXO99(pHM1avrXa10)接种后(HAI)12小时根据IRBB10A标准 化的相对值示出。Xa10的引物是10RT F2和10RT R2，稻遍在蛋白1基因 的引物是RBQ3和RBQ4。UI，未接种的植物；“-”，在12HAI用PXO99 浸润的植物；“+”，在12HAI用PXO99(pHM1avrXa10)浸润的植物。

图4A和4B示出XA10中跨膜螺旋的预测。图4A:从"DAS" –Transmembrane Prediction server(http://www.sbc.su.se/～miklos/DAS/)预测 XA10中的跨膜区的输出。图4B:从TMHMM Server v.2.0(http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测XA10中的跨膜螺旋的输出。

图5A和5B示出在XA10的N末端区域信号肽的预测。XA10的氨基 酸序列中的信号肽的预测通过SignalP-NN预测(图5A)和SignalP-HMM预 测(图5B)进行。信号肽的裂解位点位于29和30位置之间。将XA10的全 长氨基酸序列提交给SignalP3.0服务器(http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)以预测真核细胞的信号肽。神经网络和隐 蔽Markov模型方法均用于预测。选择标准输出形式。图5A和5B中的氨 基酸序列由SEQ ID NO:37的1-70位氨基酸组成。

图6A-6C示出来自稻黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv  oryzae)的AvrXa10对Xa10的特异性诱导。图6A:在用Xoo菌株 PXO99(pHM1avrXa10)接种后不同小时(HAI)IRBB10A中Xa10的诱导。稻 遍在蛋白1基因在叶中的表达用作内部对照。图6B:在用Xoo菌株 PXO99(pHM1avrXa10)接种后不同HAI测量的IRBB10A中的Xa10转录物 的实时PCR分析。遍在蛋白1基因在叶中的表达用作内部对照。结果以Xa10 超过稻遍在蛋白1基因表达的相对值表示。Xa10的引物是10RT F2和10RT  R2，稻遍在蛋白1基因的引物是RBQ3和RBQ4。图6C:在12HAI时用表 达AvrXa10或其突变体的Xoo菌株PXO99对IRBB10A中Xa10的诱导。 UI，未接种的IRBB10A；PXO99，用PXO99接种的IRBB10A； PXO99/AvrXa10，用PXO99(pHM1avrXa10)接种的IRBB10A； PXO99/AvrXa10NLS，用PXO99(pHM1avrXa10NLS)接种的IRBB10A； PXO99/AvrXa10AD，用PXO99(pHM1avrXa10AD)接种的IRBB10A。

图7A-7D示出AvrXa10对Xa10的诱导需要稻转录因子OsTFIIAγ5。 图7A:在用Xoo菌株PXO99(pHM1avrXa10)接种后两周稻的细菌枯萎病的 表型。L1，IRBB5；L2，IRBB10A；L3，IRBB5×IRBB10A的双纯合体 (Xa10Xa10xa5xa5)。图7B:在14天中用PXO99(pHM1avrXa10)叶修剪 (leaf-clipped)接种的IRBB5、IRBB10A及双纯合体的叶中的细菌群。图7C: IRBB5、IRBB10A及双纯合体中Xa10的表达。进行Northern印迹分析的 mRNA分离自未接种的植物(在接种后0小时或0HAI)或者在12HAI(12 HAI)分离自用PXO99(pHM1avrXa10)浸润的植物。图7D:IRBB5、IRBB10A 及双纯合体中Xa10的转录水平。转录水平通过实时PCR测量。总RNA分 离自未接种的植物(0HAI)或者在12HAI(12HAI)用PXO99(pHM1avrXa10) 浸润的植物。稻遍在蛋白1基因的表达用作内部对照。结果以Xa10超过稻 遍在蛋白1基因的表达的相对值表示。Xa10的引物是10RT F2和10RT R2， 稻遍在蛋白1基因的引物是RBQ3和RBQ4。

图8A-8C示出Xa10基因的启动子中AvrXa10框候选。图8A:AvrXa10 含有中心串联重复、核定位信号(NLS)及酸性转录激活结构域(AD)。图8B: 示出在15.5AvrXa10重复的位置12和13的超变氨基酸。“-”表示这个重复 中第13位氨基酸缺失。图8C:Xa10启动子(-220至ATG)(SEQ ID NO:41) 和AvrXa10框候选的核苷酸序列。基于TAL效应子的DNA-靶特异性模型 推测AvrXa10框候选(框1至框12)(Boch et al.,2009)。在每个候选中，匹配 该模型的核苷酸用大写字母表示，其它的用小写字母表示。Xa10的转录起 始位点用“+1”表示。5’非翻译区(5'UTR)以斜体字示出，Xa10的起始密码子 以下划线示出。在标为-220、-215、-177、-139、-110、-72、-36、+1和+39 的行中显示的Xa10启动子序列(-220至ATG)是SEQ ID NO:41。其余序列 如下所示：框1:SEQ ID NO:16；框4:SEQ ID NO:19；框7:SEQ ID  NO:22；框10:SEQ ID NO:25；框2:SEQ ID NO:17；框5:SEQ ID NO:20； 框8:SEQ ID NO:23；框11:SEQ ID NO:26；框3:SEQ ID NO:l8；框6: SEQ ID NO:21；框9:SEQ ID NO:24；及框12:SEQ ID NO:27。

图9A和9B示出GUS报道基因构建体。图9A:GUS报道基因构建体 的示意图。图9B:GUS报道基因构建体中GATEWAY重组位点之间的DNA 序列。AvrXa10框候选插入在最小番茄Bs4启动子序列5’末端的“TAL效应 子框”位置中(pBs4；-50至+25)(Boch et al.,2009)，通过GATEWAY重组转 移进根癌农杆菌T-DNA载体pCGWGUSint中，构建与无启动子的含有内 含子的β-葡糖苷酸酶(GUSPlus)基因的融合体。attB1和attB2，GATEWAY 重组位点；无启动子的GUSPlus-Tnos，GUSPlus(包括内含子)的编码序列 及来自pC1305.1的胭脂碱合成酶(nos)基因的终止子；LB，左边界；RB， 右边界。“attB1”与“TAL效应子-框”之间的上游pENTER/D-TOPO序列是 SEQ ID NO:42。“TAL效应子-框”与“attB2”之间的序列是SEQ ID NO:43。

图10A和10B示出AvrXa10框的鉴别和鉴定。图10A：AvrXa10框及 其衍生物。图10B：AvrXa10框由AvrXa10的特异性可诱导性。GUS报道 构建体经根癌农杆菌分别与35S-驱动的avrXa10(+)和空T-DNA载体(-)共输 送进烟草(N.benthamiana)叶细胞(误差杆显示SD；n=3个样品)。在 pC1305.1中的35S::GUSPlus(p35S)作为对照。为定性测定，叶盘用 X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-P-D-葡糖苷酸)染色。为定量测定，GUS活性用 MUG(4-甲基-伞形酮-P-D-葡糖苷酸)作为底物而检测。4-MU,4-甲基-伞形 酮。序列如下：pXa10-220:SEQ ID NO:39；AvrXa10框(框8):SEQ ID  NO:23；框80dT:SEQ ID NO:40；框5:SEQ ID NO:20；框11:SEQ ID  NO:26；框8d15:SEQ ID NO:28；框8d14:SEQ ID NO:30；框8d13:SEQ  ID NO:31；框8d12:SEQ ID NO:32；框8d11:SEQ ID NO:33.

图11A和11B示出AvrXa10和AvrXa27分别对AvrXa10框和AvrXa27 框的识别特异性。图11A：AvrXa10和AvrXa27的超变氨基酸12和13及 其靶DNA。AvrXa10框(SEQ ID NO:23)和AvrXa27框(Boch et al.,2009； Romer et al,2009a)(SEQ ID NO:44)克隆在最小Bs4启动子之前进入含有 内含子的GUS(GUSPlus)报道载体。图11B：AvrXa10和AvrXa27对AvrXa10 框和AvrXa27框的特异性可诱导性。GUS报道构建体经根癌农杆菌分别 与35S-驱动的avrXa10(AvrXa10)、avrXa27(AvrXa27)和空T-DNA载体(-) 共输送进烟草叶细胞(误差杆显示SD；n=3个样品)。35S::GUSPlus作为对 照。为定性测定，叶盘用X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-P-D-葡糖苷酸)染色。 为定量测定，GUS活性用MUG(4-甲基-伞形酮-P-D-葡糖苷酸)作为底物而 检测。4-MU,4-甲基-伞形酮。

图12A-12C示出AvrXa10和AvrXa27分别特异性结合酵母中的 AvrXa10框和AvrXa27。图12A在用于酵母单杂交测定的选择性培养基上 的酵母生长。分别使用4个串联拷贝的有义AvrXa10框和AvrXa27框(4* AvrXa10框和4x AvrXa27框)作为诱饵。与SV40NLS-GAL4AD融合的 AvrXa10和AvrXa27分别作为猎物。小鼠p53蛋白的GAL4-AD融合体和 含有其靶序列的诱饵(p53DBS)作为对照。50μl单个转化体在SD液体培养 基中的系列稀释液(10^-2,10^-3,10^-4,10^-5)加到含有亮氨酸(L)或200ng/ml金 担子素A(AbA200)的SD培养基上。每个实验分析两个转化体。实验重复 两次，具有相似结果。图12B使用寡核苷酸pAbAi F2和pAbAi R2验证诱 饵质粒插入物(AvrXa10框:1418bp；AvrXa27框:1422bp；p53DBS:1400bp) 的酵母菌落PCR。图12C:使用α-GAL4AD抗体的Western印迹显示 GAL4-AD融合猎物蛋白质。SV40NLS-GAL4AD-HA与AvrXa10(135kDa), AvrXa27(139kDa)和p53(61kDa)融合。

图13示出用于电动性迁移测定(electromobility shift assay,EMSA)中的 纯化的6xHis表位标记的AvrXa10和AvrXa27蛋白质。蛋白质浓度通过 Bradford测定确定。1.5和3μg纯化的6xHis::AvrXa10(117.5kDa)、 6xHis::AvrXa27(121.0kDa)和BSA在8%SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，并 且用考马斯亮蓝染色。星号分别标出6xHis::AvrXa10和6xHis::AvrXa27。

图14A-14D示出在电动性迁移测定(EMSA)中，AvrXa10特异性结合 AvrXa10框而不结合AvrXa27框。图14A:用于EMSA中的AvrXa10框探 针的DNA序列(SEQ ID NO:34)和AvrXa27框探针的DNA序列(SEQ ID  NO:45)。在探针中的AvrXa10框和AvrXa27框是粗体字。图14B:AvrXa10 以高亲和性结合AvrXa10框探针，而AvrXa27以高亲和性结合AvrXa10 框探针和AvrXa27框探针两者。使用AvrXa10或AvrXa27及生物素标记 的AvrXa10框或AvrXa27框探针的EMSA在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶中 分离。图14C:AvrXa10与AvrXa10框探针的结合可以被未标记的 (cold)AvrXa10框探针胜过(out-competed)但不被未标记的AvrXa27框探针 胜过。生物素标记的AvrXa10框探针和不同量的(以fmol表示)未标记的竞 争探针之间的竞争实验在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶中分离。图14D: AvrXa27与AvrXa10框或AvrXa27框探针的结合被未标记的AvrXa27框探 针高度竞争胜过。生物素标记的AvrXa10框或AvrXa27框探针和不同量的 (以fmol表示)未标记的竞争探针之间的竞争实验在6%非变性聚丙烯酰胺 凝胶中分离。结合的和游离的探针的位置在左侧示出。

图15A-15C示出在电动性迁移测定(EMSA)中AvrXa10框的缺失突变 体的鉴定。图15A:EMSA中使用的AvrXa10框及其缺失突变体的探针的 DNA序列。图15B:AvrXa10对AvrXa10框及其缺失突变体的特异性可诱 导性。GUS报道构建体经根癌农杆菌分别与35S-驱动的avrXa10(+)和空 T-DNA载体(-)共输送进烟草叶细胞(误差杆显示SD；n=3个样品)。 pC1305.1中的35S::GUSPlus(p35S)作为对照。定量GUS活性用MUG(4- 甲基-伞形酮-P-D-葡糖苷酸)作为底物而检测。4-MU,4-甲基-伞形酮。图15C: AvrXa10以高亲和性结合AvrXa10框缺失突变体的一些探针。使用AvrXa10 和AvrXa10框或其缺失突变体的生物素标记的探针的EMSA在6%非变性 聚丙烯酰胺凝胶中分离。大约200ng的AvrXa10被用于EMSA。结合的(用 箭头(dart)表示)和游离的探针的位置示于左侧。序列如下：AvrXa10框:SEQ  ID NO:34；框80dT:SEQ ID NO:46；框81dA:SEQ ID NO:47；框82dT: SEQ ID NO:48；框83dA:SEQ ID NO:49；框84dT:SEQ ID NO:50；框8 5dA:SEQ ID NO:51；框86dC:SEQ ID NO:52；框87dA:SEQ ID NO:53； 框88dC:SEQ ID NO:58；框89dA:SEQ ID NO:59；框810dC:SEQ ID  NO:60；框811dG:SEQ ID NO:61；框812dT:SEQ ID NO:62；框813dT: SEQ ID NO:63；框814dC:SEQ ID NO:64；框815dA:SEQ ID NO:65；框 816dC:SEQ ID NO:66.

图16A和16B示出AvrXa10对AvrXa10框、框7及它们的突变体被 识别特异性。图16A:EMSA中使用的AvrXa10框、框7及它们的突变体 的探针的DNA序列。突变的碱基粗体字表示。图16B:AvrXa10对AvrXa10 框、框7及它们的突变体的特异性可诱导性。GUS报道构建体经根癌农杆 菌分别与35S-驱动的avrXa10(+)和空T-DNA载体(-)共输送进烟草叶细胞 (误差杆显示SD；n=3个样品)。35S::GUSPlus作为对照。为定性测定，叶 盘用X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-P-D-葡糖苷酸)染色。定量GUS活性用 MUG(4-甲基-伞形酮-P-D-葡糖苷酸)作为底物而检测。4-MU,4-甲基-伞形 酮。序列如下：AvrXa10框:SEQ ID NO:23；框8M1:SEQ ID NO:67；框7: SEQ ID NO:22；框7M:SEQ ID NO:68；框7M1:SEQ ID NO:69；框7M2: SEQ ID NO:70；框7M3:SEQ ID NO:71；框7M4:SEQ ID NO:72；框7M5: SEQ ID NO:73；框7M6:SEQ ID NO:74.

图17A-17D示出在电动性迁移测定(EMSA)中AvrXa10结合AvrXa10 框、框7及它们的突变体。图17A:EMSA中使用的AvrXa10框、框7及 它们的突变体的探针的DNA序列。图17B:AvrXa10以高亲和性结合 AvrXa10框、框7及它们的突变体的探针。使用AvrXa10和生物素标记的 AvrXa10框、框7及它们的突变体探针的EMSA在6%非变性聚丙烯酰胺 凝胶中分离。图17C:AvrXa10与AvrXa10框探针的结合被AvrXa10框、 框8M1、框7或框7M的未标记的探针竞争胜出。AvrXa10框和不同量的 (以fmol表示)未标记的竞争探针之间的竞争实验在6%非变性聚丙烯酰胺 凝胶中分离。图17D:AvrXa10与框8M1、框7或框7M的探针的结合被 未标记的AvrXa10框探针竞争胜出。框8M1,框7或框7M和不同量的(以 fmol表示)未标记的竞争探针之间的竞争实验在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶 中分离。结合的和游离的探针的位置在左侧示出。序列如下：AvrXa10框: SEQ ID NO:34；框8M1:SEQ ID NO:75；框7:SEQ ID NO:76；框7M:SEQ  ID NO:77.

图18A-18C示出在酵母中AvrXa10结合框7、AvrXa10框及它们的 突变体。图18A:用于酵母单杂交测定的选择性培养基上的酵母生长。使用 4个串联拷贝的有义框7、AvrXa10框或者它们的突变体(4x框7,4x框 7M,4x AvrXa10框和4x框8M1)作为诱饵。与SV40NLS-GAL4AD融合 的AvrXa10作为猎物。小鼠p53蛋白的GAL4-AD融合体和含有其靶序列 的诱饵(p53DBS)作为对照。50μl单个转化体在SD液体培养基中的系列稀 释液(10^-2,10^-3,10^-4,10^-5)加到含有亮氨酸(+L)或200ng/ml金担子素A (aureobasidin A)(+AbA200)的SD培养基上。每个实验分析两个转化体。实 验重复两次，具有相似结果。图18B：使用引物pAbAi F2和pAbAi R2验 证诱饵质粒插入物(框7:1418bp；框7M:1418bp；AvrXa10框:1418bp； 框8M1:1422bp；p53DBS:1400bp)的酵母菌落PCR。图18C:使用抗GAL4 AD抗体的Western印迹显示GAL4-AD融合猎物蛋白质。SV40NLS-GAL4 AD-HA与AvrXa10(135kDa)和p53(61kDa)融合。

发明详述

本发明一般性地涉及植物分子生物学和遗传学及赋予植物细菌性疾病 抗性的核酸和方法。本发明还涉及可用于控制在转基因植物中表达的启动 子和启动子序列。根据本发明，描述了编码抗性基因Xa10的基因的克隆和 鉴定，其赋予对细菌枯萎病的抗性。在一个实施方案中，所述抗性是针对 由黄单胞菌导致的细菌枯萎病(blight disease)。在另一实施方案中，所述植 物是稻。在进一步的实施方案中，所述植物是大麦、燕麦、小麦、玉米、 甘蓝、花椰菜、马铃薯、番茄、胡椒、大豆或油菜籽。

黄单胞菌(Xanthomonas spp)的转录激活物样(TAL)III型效应子通过靶 向宿主基因启动子及激活宿主基因表达而导致发病。根据本发明，描述了 稻细菌枯萎病抗性基因Xa10的分离及Xa10与来自稻黄单胞菌稻致病变种 (Xanthomonas oryzae pv oryzae)(Xoo)的TAL III型效应子AvrXa10之间分子 识别的鉴定。如本发明所描述，Xa10基因是通过定位克隆策略和遗传转化 分离自含有Xa10的稻品系。所述Xa10基因编码未知的跨膜蛋白。Xa10 被携带AvrXa10基因的Xoo菌株特异性诱导。AvrXa10中核定位信号(NLS) 基序的突变或者在其C-末端区域的转录激活结构域(AD)的缺失消除了其激 活Xa10的功能。Xa10表达由AvrXa10的激活需要稻转录因子OsTFIIAγ5。 通过候选方法在Xa10启动子中鉴别了17-bp的AvrXa10框。在瞬时测定中 所述AvrXa10框在烟草(Nicotiana benthamiana)中由AvrXa10特异性识别， 这种识别激活报道基因表达。AvrXa10框与AvrXa10之间的特异性相互作 用在酵母中通过酵母单杂交测定及在体外通过电动性迁移测定(EMSA)证 实。在0-11位的任一核苷酸的缺失均削弱AvrXa10活性。AvrXa10框中前 四个核苷酸(TATA)的任一个缺失在EMSA中也消除AvrXa10与突变探针 的结合，表明AvrXa10框中前四个核苷酸是AvrXa10与Xa10启动子结合 所必需的。位置13-17的任一核苷酸的缺失在EMSA中不影响Avrxa10框 活性，也不影响AvrXa10与突变探针的结合。在AvrXa10框中位置13-17 的后四个核苷酸的缺失也不显著影响AvrXa10框的通过AvrXa10诱导报道 基因的活性。在AvrXa10框中位置9-11的核苷酸“CAC”是通过AvrXa10 激活转录必需的。“CAC”突变为“TCA”完全消除了AvrXa10活性，而框7 中“TCA”改变为“CAC”增加了突变的框7(框7M)的AvrXa10活性。这些 结果表明AvrXa10框可具有两个功能中心：前四个核苷酸(TATA)作为 AvrXa10结合中心，转录激活中心在位置9-11(CAC)。Xa10与AvrXa10以 及经鉴别由TAL III型效应子靶向的其他宿主基因之间的分子相互作用的 鉴别使得可以对由黄单胞菌(Xanthomonas spp)导致的细菌疾病的广谱和长 期抗性工程化。

如本文所用，术语“植物细胞”是指涵盖衍生自植物包括未分化的组织 如愈伤组织和悬浮培养物以及植物种子、花粉或植物胚的任何细胞。适合 转化的植物组织包括叶组织，根组织，分裂组织，原生质体，胚轴，子叶， 盾片，苗端，根，不成熟胚，花粉和花药。本发明描述了可用于转化植物 和植物细胞的方法的非限制性实例。可用于本发明的植物例如包括稻、大 麦、燕麦、小麦、玉米、甘蓝、花椰菜、马铃薯、番茄、胡椒、辣椒、大 豆、油菜籽及对黄单胞菌易感的任何其他植物。

如果一单核苷酸或核酸在其天然状态或当通过本领域技术人员熟知的 方法处理时可以被转录和/或翻译以产生mRNA和/或多肽或其片段时，称 其“编码”该多肽。

“分离的”或“基本纯的”核酸(例如RNA，DNA或者混合的聚合物)或者 多肽是与天然伴随天然人序列或蛋白质的其他细胞成分基本分离的核酸或 多肽，如核糖体，聚合酶，许多其他人基因组序列和蛋白质。该术语包含 已经从其天然发生环境中去除的核酸序列或蛋白质，及包括重组或克隆的 DNA分离物及化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。

本发明的多核苷酸组合物包括RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式， 及可以被化学或生物化学修饰，或者可含有非天然的或衍生的核苷酸碱基， 这些易于为本领域技术人员意识到。这种修饰包括例如标记，甲基化，用 类似物取代一或多个天然发生的核苷酸，核苷酸间修饰如不带电键合(例如 甲基磷酸酯，磷酸三酯，氨基磷酸酯，氨基甲酸酯等)，带电荷的键合(例如 硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)，悬垂部分(pendent moieties)(例如多肽)，嵌 入剂(例如吖啶，补骨脂素等)，螯合剂，烷化剂，及修饰的键合(例如α端基 异构体核酸等)。也包括模拟多核苷酸通过氢键及其他化学相互作用结合指 定序列的合成分子。这种分子为本领域已知，包括例如其中肽键取代分子 主链中磷酸键的那些分子。本发明的多核苷酸可以是分离的或基本纯的。

本发明提供了重组核酸。所述重组构建体在宿主细胞中能自主复制。 或者，所述重组构建体可以整合进宿主细胞染色体DNA中。这种重组多核 苷酸包含基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，通过其来源或操 作，其1)与其天然相关的全部或部分多核苷酸不相关；2)与除了与其天然 连接的多核苷酸之外的多核苷酸连接；或者3)不天然发生。因此，本发明 提供了包含不是天然发生的序列的重组核酸。尽管可以使用描述的序列， 但其通常如通过缺失、取代或插入而改变。

本发明提供了本发明所述野生型和突变多肽或其片段的“蛋白质修饰 或片段”，其与一级结构序列实质上同源，但是包括例如体内或体外化学或 生物化学修饰，或者掺入非寻常氨基酸。这种修饰包括例如乙酰化，羧化， 磷酸化，糖基化，遍在蛋白化，标记如用放射性核素标记，以及各种酶修 饰，这些为本领域技术人员熟知。可用于这种目的的标记多肽的各种方法 及各种取代基或标记为本领域技术人员熟知，包括放射性同位素，如P， 结合标记的抗配体(如抗体)的配体，荧光团，化学发光剂，酶，及可作为标 记的配体的特异性结合配对成员的抗配体。标记的选择依赖于要求的敏感 性，与引物缀合的方便性，稳定性需求，以及可利用的仪器设备。

除了基本全长的蛋白质之外，本发明提供了多肽的生物活性片段。显 著的生物活性包括蛋白质的配体结合，免疫活性及其他生物活性特征。如 本文所用，术语“多肽”是指全长蛋白质及作为多肽片段的蛋白质的一部分。 多肽“片段”、“部分”或“节段”是至少大约5-7个连续氨基酸的一段氨基酸残 基序列，通常是至少大约7-9个连续氨基酸，典型为至少大约9-13个连续 氨基酸，最优选至少大约20-30个或更多个连续氨基酸。

本发明还提供了融合多肽，其包含本发明所述多肽及其片段以及本领 域已知的其他蛋白质的多肽或片段。同源多肽可以是两或多个多肽序列之 间或者本发明所述序列与相关蛋白质之间的融合。同样，异源融合可以是 这样构建的，其呈现出衍生的蛋白质的性质或活性的组合。例如，配体结 合或其他结构域在不同的新融合多肽或片段之间可以“交换”。这种同源或 异源融合多肽可以展示例如改变的结合强度或特异性，及可包括例如配对 体如免疫球蛋白、细菌β-半乳糖苷酶，trpE，蛋白质A，β-内酰胺酶，α淀 粉酶，醇脱氢酶及酵母α交配因子。融合蛋白典型是通过如下文所述重组核 酸方法产生，或者可化学合成。合成多肽的技术为本领域技术人员熟知。

其它蛋白质修饰包括氨基酸取代。取代变体典型含有在蛋白质内的一 或多个位点一个氨基酸置换为另一个氨基酸，及可以设计为调节所述多肽 的一或多种性质，如针对蛋白酶解的稳定性，不丧失其它功能或性质。氨 基酸取代可以基于涉及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/ 或两亲性性质的相似性进行。优选地取代是保守的，即一个氨基酸由相似 形状和电荷的氨基酸置换。保守取代为本领域技术人员熟知，典型包括但 不限于在如下基团内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨 酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸， 精氨酸；及酪氨酸，苯丙氨酸。

蛋白质结构中的某些氨基酸可以被取代为其他氨基酸，而不显著丧失 与如抗体的抗原结合区或底物分子上结合位点或者与多肽相互作用的蛋白 质上结合位点等结构的相互作用结合能力。因为这是定义蛋白质生物功能 活性的蛋白质的相互作用能力和性质，因此某些氨基酸取代可以在蛋白质 序列及其潜在的DNA编码序列中进行，仍然获得具有同样性质的蛋白质。 在产生这种改变中，可以考虑氨基酸的亲水(hydropathic)指数。疏水性氨基 酸指数在赋予蛋白质的相互作用生物功能中的重要性通常为本领域已知。 或者，氨基酸取代可以基于亲水性而有效进行。亲水性在赋予蛋白质的相 互作用生物功能中的重要性通常为本领域已知(见例如美国专利 4,554,101)。疏水性指数或者亲水性在设计多肽中的应用在美国专利 5,691,198中进一步论述。

“重组核酸”是非天然发生的核酸，或者是通过人工组合序列的两个其 它分离的节段而产生。这种人工组合通常通过化学合成方式实现，或者通 过人工操纵核酸的分离的节段实现，例如通过遗传工程技术进行。这个短 语也涵盖从其正常调节表达限制中除去的基因，在这种情况中及基因产物 由于存在所述基因的多个拷贝或者正调节的启动子或增强子信号而过表 达，增加的mRNA或蛋白质半衰期等。

本发明的大量单核苷酸可以由用编码本发明的突变的或艺术性蛋白质 的核苷酸序列转化的合适的宿主细胞产生。编码所述肽或希望的片段的天 然或合成的单核苷酸片段可以掺入能导入原核细胞或真核细胞中及在其中 复制的重组多核苷酸构建体(载体)中，通常为DNA构建体。通常地，所述 载体适于在单细胞宿主如酵母或细菌中复制，但是也可用于导入(整合或不 整合在基因组内)培养的哺乳动物或植物或其它真核细胞系中。最常用的原 核宿主是大肠杆菌，但是也可以使用其它原核生物如枯草杆菌或假单胞菌 属。哺乳动物或其它真核宿主细胞，如酵母、丝状真菌、植物、昆虫或两 栖动物或禽类动物，也可以用于产生本发明的蛋白质。正如相关领域所熟 知，调节多核苷酸表达可以导致由所述多核苷酸编码的多肽的调节。

载体，如克隆和表达载体，包括合适的启动子及在选择的宿主中起作 用的其它必需的载体序列，如本文所述那些序列。适当地可包括与本发明 描述的核酸和蛋白质表达天然关联的那些序列，及可包括与所述核酸可操 纵地连接的可选的或其它的调节序列，以控制该核酸的表达，这些为本领 域熟知。许多可用的载体为本领域已知，可得自商家。“可操纵地连接”是 指并置，其中所述成分处于使其以指定方式起作用的关系。例如，启动子 如果影响编码序列的转录或表达，则该启动子与所述编码序列式可操纵地 连接的。所述载体也可包含选择标记基因，如本发明所述。

第一方面，本发明提供了分离的核酸，其编码：(i)具有SEQ ID NO:37 所示氨基酸序列的Xa10多肽，或者(ii)与所述Xa10多肽具有至少50%相同 性的多肽，其中(ii)的多肽当转染进植物中时提供黄单胞菌抗性植物。如本 发明所述，所述Xa10多肽提供了表达这种蛋白质的对黄单胞菌具有抗性的 植物。在一个实施方案中，(ii)的多肽具有至少60%相同性。在另一个实施 方案中，(ii)的多肽具有至少70%相同性。在再一个实施方案中，(ii)的多肽 具有至少80%相同性。在进一步的实施方案中，(ii)的多肽具有至少90%相 同性。在另一个实施方案中，(ii)的多肽具有至少95%相同性。在再一个实 施方案中，(ii)的多肽具有至少98%相同性。在进一步的实施方案中，(ii) 的多肽具有至少99%相同性。在一个实施方案中，编码Xa10多肽的核酸具 有SEQ ID NO:35所示核苷酸序列。在另一个实施方案中，编码Xa10多肽 的核酸具有SEQ ID NO:36所示核苷酸序列。在再一个实施方案中，编码 Xa10多肽的核酸具有SEQ ID NO:36的第54-437位核苷酸所示核苷酸序 列。在进一步的实施方案中，编码Xa10多肽的核酸具有SEQ ID NO:35的 第2423-3234位核苷酸所示核苷酸序列。

在另一个实施方案中，编码(i)或(ii)的多肽的分离的核酸可以与编码异 源多肽的核酸可操纵地连接。异源多肽可包括R基因的蛋白质或者来自稻 或本领域技术人员已知的其它植物的防御基因的蛋白质。非限制性实例可 包括稻细菌枯萎病R蛋白质Xa1，Xa2，Xa5，Xa13，Xa21，Xa26，Xa27， 或者防御蛋白质如来自稻的PR1。

本发明还提供了本发明所述Xa10多肽。此外，本发明提供了包含所述 分离的核酸的植物细胞及包含所述植物细胞的黄单胞菌抗性转基因植物。

第二方面，本发明提供了包含分离的核酸的载体，所述核酸编码(i)具 有SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的Xa10多肽，或者(ii)与所述Xa10多肽 具有至少50%相同性的多肽，其中(ii)的多肽当转染进本发明所述植物中时 提供黄单胞菌抗性植物。在一个实施方案中，所述载体进一步包含与所述 分离的核酸可操纵地连接的植物启动子。在另一实施方案中，所述启动子 选自组织特异性启动子，组成性启动子和可诱导启动子。在进一步的实施 方案中，所述启动子是Xa10启动子或者衍生自Xa10启动子或者含有Xa10 启动子的一部分，包括本发明描述的启动子。在一个实施方案中，所述载 体也可以包含如本发明所述其它调节序列。在另一个实施方案中，如本发 明所述，编码(i)或(ii)的多肽的分离的核酸可以与编码异源多肽的核酸可操 纵地连接。

许多启动子均可用于实施本发明。所述启动子是基于希望的结果选择 的。也就是说，所述核酸可以与组成型、组织优选的或者其它启动子组合 以在感兴趣的宿主细胞中表达。这种组成性启动子包括例如Rsyn7的核心 启动子(WO99/48338和美国专利No.6,072,050)，核心CaMV35S启动子 (Odell et al.,1985)，稻肌动蛋白(McElroy et al.,1990)，遍在蛋白 (Christensen and Quail,1989and Christensen et al.,1992)，pEMU(Last et al., 1991)，MAS(Velten et al.,1984)，ALS启动子(美国专利No.5,659,026)等。 其它组成性启动子包括例如在美国专利No.5,608,149、5,608,144、 5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463和5,608,142中揭示 的那些。

其它启动子包括可诱导启动子，特别是来自病原体的可诱导启动子。 这种启动子包括来自发病相关的蛋白质(PR蛋白质)的那些启动子，其在病 原体感染后被诱导，例如PR蛋白，SAR蛋白，β-1,3-葡聚糖酶，壳多糖酶 等。其它启动子包括在病原体感染部位局部或附近表达的那些启动子。在 进一步的实施方案中，所述启动子可以是伤口可诱导的启动子。在其它实 施方案中，化合物调节的启动子可用于在植物中调节基因表达，通过应用 外源化学调节剂进行。所述启动子可以是化学可诱导的启动子，其中化合 物的应用诱导基因表达，或者所述启动子可以是化合物可抑制的启动子， 其中化合物的应用抑制基因表达。此外，组织优选的启动子可用于在特定 植物组织内靶向增强感兴趣的单核苷酸的表达。每一个这些启动子均在美 国专利No.6,506,962、6,575,814、6,972,349和7,301,069及在美国专利申请 出版物No.2007/0061917和2007/0143880中描述。

在再一个的实施方案中，启动子选自具有SEQ ID NO:38所示核苷酸 序列的Xa10启动子，具有SEQ ID NO:38的第1-2422位核苷酸所示核苷酸 序列的Xa10启动子及具有SEQ ID NO:39所示核苷酸序列的Xa10启动子。 在进一步的实施方案中，启动子选自含有具有SEQ ID NO:23所示核苷酸 序列的AvrXa10框的启动子，及含有AvrXa10框衍生物的启动子，其中所 述AvrXa10框的衍生物选自如下衍生物：具有SEQ ID NO:26所示核苷酸 序列的衍生物，具有SEQ ID NO:28所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ  ID NO:30所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO:31所示核苷酸序列 的衍生物，具有SEQ ID NO:68所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID  NO:72所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO:73所示核苷酸序列的 衍生物，具有SEQ ID NO:74所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID  NO:82所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO:83所示核苷酸序列的 衍生物，具有SEQ ID NO:84所示核苷酸序列的衍生物，及具有SEQ ID  NO:85所示核苷酸序列的衍生物。本发明还提供了包含所述载体的植物细 胞及包含所述植物细胞的黄单胞菌抗性转基因植物。在优选的实施方案中， 本发明的核酸被稳定整合进转基因植物细胞或转基因植物的基因组中。

第三方面，本发明提供了如下方法：(i)使植物对黄单胞菌有抗性的方 法，(b)增强植物对黄单胞菌抗性的方法，及(c)赋予植物黄单胞菌疾病抗性 的方法。每一种这些方法均包括将本发明所述分离的核酸或载体转染至一 个或多个植物细胞中，并使所转染的一个或多个植物细胞生长为植物，由 此所述分离的核酸在该植物中表达。将核酸或载体转染进植物细胞中在本 发明中有时也称作用所述核酸或载体转化植物细胞。在优选的实施方案中， 本发明的核酸被稳定整合进转基因植物细胞或转基因植物的基因组中。

第四方面，本发明提供了在植物中具有启动子活性的分离的核酸。在 一个实施方案中，所述核酸具有SEQ ID NO:38所示核苷酸序列或者SEQ ID  NO:38的第1-2422位核苷酸所示核苷酸序列。在另一实施方案中，所述核 酸具有SEQ ID NO:39所示核苷酸序列。在进一步的实施方案中，所述核酸 包含植物可操纵的启动子，其含有SEQ ID NO:23所示核苷酸序列。对于这 个实施方案及如下实施方案合适的植物可操纵的启动子包括本发明所述那 些启动子，及为本领域技术人员熟知的那些启动子。在另一实施方案中， 所述核酸包含植物可操纵的启动子，其含有SEQ ID NO:26所示核苷酸序 列。在再一个实施方案中，所述核酸包含植物可操纵的启动子，其含有SEQ  ID NO:28所示核苷酸序列。在进一步的实施方案中，所述核酸包含植物可 操纵的启动子，其含有SEQ ID NO:30所示核苷酸序列。在另一实施方案中， 所述核酸包含植物可操纵的启动子，其含有SEQ ID NO:31所示核苷酸序 列。在再一个实施方案中，所述核酸包含植物可操纵的启动子，其含有SEQ  ID NO:68所示核苷酸序列。在进一步的实施方案中，所述核酸包含植物可 操纵的启动子，其含有SEQ ID NO:72所示核苷酸序列。在另一个实施方案 中，所述核酸包含植物可操纵的启动子，其含有SEQ ID NO:73所示核苷酸 序列。在进一步的实施方案中，所述核酸包含植物可操纵的启动子，其含 有SEQ ID NO:74所示核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述核酸包含植 物可操纵的启动子，其含有SEQ ID NO:82所示核苷酸序列。在再一个实施 方案中，所述核酸包含植物可操纵的启动子，其含有SEQ ID NO:83所示核 苷酸序列。在进一步的实施方案中，所述核酸包含植物可操纵的启动子， 其含有SEQ ID NO:84所示核苷酸序列。在另一实施方案中，所述核酸包含 植物可操纵的启动子，其含有SEQ ID NO:85所示核苷酸序列。本发明还提 供了核酸构建体，其包含含有启动子活性的与编码感兴趣的核酸的第二个 核酸可操纵地连接的核酸。此外，本发明提供了在其基因组中含有核酸构 建体的转基因植物细胞或转基因植物。本发明进一步提供了产生转基因植 物细胞或转基因植物的方法。所述转基因植物细胞是通过将所述核酸构建 体转染进植物细胞中而产生的。所述转基因植物是通过从转染的植物细胞 再生植物而产生的。

本发明的启动子可特别用于制备转基因植物，包括本发明描述的那些， 以含有感兴趣的核酸或DNA。插入植物中的核酸或DNA(感兴趣的核酸或 DNA)对于转化过程不是关键的。通常地，导入植物中的DNA是构建体的 一部分。所述DNA可以是感兴趣的基因，例如蛋白质编码序列，或者其可 以是能调节基因表达的序列，如反义序列，有义阻抑序列，转录后基因沉 默序列(RNAi序列如siRNA，shRNA或dsRNA)或者micro-RNA(miRNA) 序列。所述构建体典型包括调节区，其与感兴趣的DNA的5’侧和/或感兴 趣的DNA的3’侧可操纵地连接。含有所有这些元件的盒(cassette)在本发明 也称作表达盒。所述表达盒可在表达盒构建体另外含有5’前导序列。所述 调节区(即启动子，转录调节区和翻译终止区)和/或编码信号锚的多核苷酸 对于宿主细胞或者彼此可以是天然/类似(analogous)的。在此鉴别的启动子 可特别用于制备转化本发明所述植物物种的构建体。或者，所述调节区和/ 或编码信号锚的单核苷酸对于宿主细胞或者彼此是异源的异源的。见美国 专利No.7,205,453和美国专利申请出版物No.2006/0218670、2006/0248616 和20090100536及其中列举的参考文献所述。所述表达盒在表达盒构建体 中可另外含有5’前导序列。这种前导序列可增强翻译。翻译前导序列为本 领域已知，及包括在国际出版物No.WO2008/094127及其中列举的参考文 献中描述的那些序列。

在如本发明所述的启动子控制下的感兴趣的DNA可以是如本发明所 述任何DNA，及可用于改变其被导入之中的植物物种的任何特性或性状。 在一个实施方案中，感兴趣的DNA被导入植物中以增强植物的性状。在另 一个实施方案中，增强的农艺学性状可以通过增强的植物形态学、生理学、 生长和发育、产量、营养增加、疾病或病虫害抗性、或者环境或化学耐受 性而鉴定。在一些方面中，增强的性状选自增强的水使用效力，增强的温 度耐受性，增加的产量，增强的氮使用效力，增加的种子蛋白质，增加的 种子油及增加的生物量。增加的产量可包括在非应激(non-stress condition) 条件下增加的产量，及在环境应激条件下增加的产量。应激条件可包括例 如干旱，阴暗(shade)，真菌性疾病，病毒性疾病，细菌性疾病，昆虫虫害， 线虫虫害，极端温度暴露(冷或热)，渗透性应激，降低的氮养分有效性，降 低的磷养分有效性，以及高植物密度。在一些实施方案中，感兴趣的DNA 可用于修饰代谢途径，如种子中脂肪酸生物合成或者脂质生物合成途径， 或者在植物物种中修饰病原体抗性，特别是黄单胞菌抗性。本发明的启动 子可以由本发明所述AvrXa10蛋白或者编码这个蛋白质的核酸诱导或激 活。

通常，所述表达盒可另外包含选择标记基因以选择转化的细胞。选择 标记基因用于选择转化的细胞或组织。通常地，植物选择标记基因编码抗 生素抗性，及合适的基因包括至少一系列的编码抗生素奇霉素抗性的基因， 编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(spt)基因，编码卡那霉素或遗传霉素 抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因，编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶 (hpt或aphiv)基因，乙酰乳酸合酶(als)基因。或者，植物选择标记基因编码 除草剂抗性，如磺脲型除草剂、草铵膦(glufosinate)、草甘膦(glyphosate)、 铵、溴苯腈(bromoxynil)、咪唑啉酮类和2,4-二氯苯氧乙酸酯(2,4-D)抗性， 包括编码除草剂抗性的基因，其作用是抑制谷氨酰胺合酶如草丁膦 (phosphinothricin)或Basta的作用(如bar基因)。通常见国际出版物No.WO 02/36782，美国专利No.7,205,453及美国专利申请出版物No. 2006/0218670、2006/0248616、2007/0143880和20090100536及其中列举的 参考文献所述。列举的选择标记基因不是限制性的。可以使用任何选择标 记基因。所述选择标记基因也在载转化的植物物种中可操纵的启动子控制 下。这种启动子包括在国际出版物No.WO2008/094127及其中列举的参考 文献中描述的那些启动子。

在适当情况中，感兴趣的DNA可以被优化以增加在转化的植物表达。 即所述编码序列可以使用植物优选的密码子合成以改良表达。本领域可获 得合成植物优选的基因的方法。见例如美国专利No.5,380,831、5,436,391 和7,205,453及美国专利申请出版物No.2006/0218670和2006/0248616。

在制备表达盒中，可以处理多种DNA片段，以正确方向及在适当情况 中以正确读框提供DNA序列。为此，可以使用适体或接头以连接DNA片 段，或者可包括其它操作以提供便利的限制位点，除去过多的DNA，除去 限制位点等。为此目的，可以包括体外诱变，引物修复，限制，退火，再 取代，例如转换和颠换。

一旦核酸已经克隆进表达载体中，可以使用常规的转化方法将其导入 植物细胞中。术语“植物细胞”是指涵盖衍生自植物包括未分化的组织如愈 伤组织和悬浮培养物以及植物种子、花粉或植物胚的任何细胞。适于转化 的植物组织包括叶组织，根组织，分裂组织，原生质体，胚轴，子叶，盾 片，苗端，根，未成熟的胚，花粉及花药。“转化”是指通过外部应用来自 不同基因型的另一细胞的重组DNA直接修饰细胞基因组，使其吸收剂整合 进所述细胞基因组中。以此方式，可获得遗传修饰的植物、植物细胞、植 物组织、种子等。

含有本发明启动子的DNA构建体可用于转化任何植物，包括本发明所 述那些植物。所述构建体可以通过各种常规技术导入希望的植物宿主的基 因组中。转化多种高等植物物种的技术为本领域熟知并在技术和学术文献 中描述。转化方案可根据靶向转换的植物或植物细胞的类型而不同，即单 子叶或双子叶植物，这些为本领域技术人员熟知。例如，所述DNA构建体 可以直接导入植物细胞的基因组DNA中，使用如植物细胞原生质体的电穿 孔和显微注射等技术进行，或者所述DNA构建体可以直接导入植物组织 中，使用冲击(ballistic)方法进行，如DNA微粒轰击。或者，所述DNA构 建体可以组合合适的T–DNA侧翼区，及导入常规的根癌农杆菌宿主载体 中。当植物细胞被根癌农杆菌感染时，根癌农杆菌宿主的毒力功能将指导 所述构建体和相邻标记插入该植物细胞DNA中。因此，可以使用提供有效 转化/转染的任何方法。见例如美国专利No.7,241,937、7,273,966和7,291,765 及美国专利申请出版物No.2007/0231905和2008/0010704及其中列举的参 考文献所述。也见国际公开申请No.WO2005/103271和WO2008/094127 及其中的参考文献所述。

在一个实施方案中，外植体组织可以与携带含有感兴趣的基因或核酸 的DNA构建体的农杆菌菌株共培养，使用本领域熟知的技术进行。转化的 组织可以使用本领域熟知的常规技术选择。在另一实施方案中，胚性液体 悬浮培养物可以与携带含有感兴趣的基因或核酸的DNA构建体的农杆菌 菌株共培养，使用本领域熟知的技术进行。转化的组织可以使用本领域熟 知的常规技术选择。在进一步的实施方案中，所述DNA可以通过使用常规 技术如微粒轰击技术导入外植体组织或胚性液体悬浮培养物的细胞中。转 化的组织可以使用本领域熟知的常规技术选择。转化或转基因的植物可以 使用本领域熟知的方法再生。

可以培养通过上述任何转化技术衍生的转化的植物细胞以再生具有转 化的基因型及因此希望的表型的整个植物，如转基因植物。“转基因植物” 是其中导入外来DNA的植物。“转基因植物”涵盖所有后代、杂种及其杂交 体，无论是有性还是无性繁殖的，其继续携带所述外来DNA。再生技术依 赖于在组织培养生长培养基中某些植物激素的处理，典型依赖于已经与希 望的核苷酸序列一起导入的生物杀灭剂(biocide)和/或除草剂标记。见例如 国际公开的申请No.WO2008/094127及其中列举的参考文献。

如下转化方法典型用于产生其中稳定掺入所述表达盒的转基因品种。 在所述表达盒稳定掺入转基因植物中后，可以通过有性杂交将其转移至其 它植物。在一个实施方案中，所述转基因品种可以与另一(非转化的或转化 的)品种杂交，以产生新的转基因品种。或者，通过使用前述转化技术已经 工程化进特定棉花品系中的遗传性状可以通过使用植物育种领域熟知的传 统回交技术移至另一品系中。例如，回交方法可用于将工程化的性状从公 开的非良种(non-elite variety)中移至良种(elite variety)中，或者从其基因组中 含有外来基因的品种中移至不含有该基因的品种中。如本发明所用，“杂交” 可以根据情况是指简单的X与Y杂交，或者回交。根据杂交的物种，可以 使用任何标准栽培技术。

一旦产生转基因植物，可以根据常规方法栽培所述植物自身。当然， 可以从所述转基因植物中收获转基因种子。然后将这些种子种植在土壤中， 使用常规方法栽培以产生转基因植物。

第五方面，本发明提供了在转基因植物中控制基因表达的应用和方法。 在一个实施方案中，本发明所述的具有启动子活性的分离的核酸用于在转 基因植物中控制基因表达。在另一实施方案中，编码具有SEQ ID NO:54 所示氨基酸序列的AvrXa10多肽的核酸用于在含有本发明所述具有启动子 活性的分离的核酸的转基因植物中控制基因表达。在进一步的实施方案中， 具有SEQ ID NO:54所示氨基酸序列的AvrXa10多肽用于在含有本发明所 述具有启动子活性的分离的核酸的转基因植物中控制基因表达。在一个实 施方案中，编码AvrXa10多肽的核酸具有SEQ ID NO:57所示核苷酸序列。 在另一个实施方案中，编码AvrXa10多肽的核酸具有GenBank登录号 U50552所示核苷酸序列。本发明进一步提供了产生具有本发明的启动子及 具有编码AvrXa10多肽的核酸的转基因植物细胞或转基因植物的方法。所 述转基因植物细胞是通过将含有所述启动子的核酸构建体转染至一个或多 个植物细胞中而产生。在一个实施方案中，与本发明所述启动子可操纵地 连接的编码AvrXa10多肽的核酸也被转染进一个或多个植物细胞中。所述 转基因植物是通过从转染的植物细胞中再生植物而产生的。在第二个实施 方案中，产生第一个转基因植物，其含有具有在植物细胞中的启动子的核 酸构建体，及产生第二个转基因植物，其含有编码AvrXa10多肽的与启动 子可操纵地连接的核酸。然后使第一个和第二个转基因植物杂交产生既含 有具有启动子的核酸构建体也含有编码AvrXa10多肽的与启动子可操纵连 接的核酸的转基因植物。

除非特别指出，实施本发明使用常规的化学、分子生物学、微生物学、 重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学技术， 这些技术为本领域技术人员已知。见例如Maniatis et al,1982,Molecular  Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New  York)、Sambrook et al,1989,Molecular Cloning,2nd Ed.(Cold Spring Harbor  Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)、Sambrook and Russell, 2001,Molecular Cloning,3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold  Spring Harbor,New York)、Ausubel et al,1992),Current Protocols in  Molecular Biology(John Wiley & Sons,including periodic updates)、Glover, 1985,DNA Cloning(IRL Press,Oxford)、Russell,1984,Molecular biology of  plants:a laboratory course manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold  Spring Harbor,N.Y.)、Anand,Techniques for the Analysis of Complex  Genomes,(Academic Press,New York,1992)、Guthrie and Fink,Guide to  Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press,New York,1991)、 Harlow and Lane,1988,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New York)、Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&  S.J.Higgins eds.1984)、Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J. Higgins eds.1984)、Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc., 1987)、Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)、B.Perbal,A  Practical Guide To Molecular Cloning(1984)、Methods In Enzymology  (Academic Press,Inc.,N.Y.)、Methods In Enzymology,Vols.154and155 (Wu et al.eds.),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)、Handbook Of  Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell, eds.,1986)、Riott,Essential Immunology,6th Edition,Blackwell Scientific  Publications,Oxford,1988、Fire et al,RNA Interference Technology:From  Basic Science to Drug Development,Cambridge University Press,Cambridge, 2005、Schepers,RNA Interference in Practice,Wiley-VCH,2005、Engelke, RNA Interference(RNAi):The Nuts & Bolts ofsiRNA Technology,DNA Press, 2003、Gott,RNA Interference,Editing,and Modification:Methods and  Protocols(Methods in Molecular Biology),Human Press,Totowa,NJ,2004、 Sohail,Gene Silencing by RNA Interference:Technology and Application, CRC,2004。

实施例

通过如下实施例描述本发明，所述实施例只是举例说明本发明，不以 任何形式限制本发明。使用本领域熟知的标准技术或下文特别描述的技术。 实施例1：材料和方法

稻品系和生长条件：IRBB10携带在IR24遗传背景中的细菌枯萎病抗 性基因Xa10(Ogawa et al.,1988)。IRBB10A是在IR24遗传背景中的Xa10 的改良的近等基因品系(near-isogenic line)(Gu et al.,2008)。Nipponbare是日 本产稻品种，其易感于大多数Xoo菌株。IRBB5携带在IR24背景中的隐性 细菌枯萎病抗性基因xa5(Ogawa et al,1988)。稻植物在温室中在32℃温度 生长12.5小时(光照)及11.5小时(黑暗处)。

细菌枯萎病接种：将稻黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv  oryzae)菌株在补加适当抗生素的蛋白胨蔗糖琼脂(PSA)平板上培养。根据剪 叶法(leaf-clipping method)(Kauffman et al,1973；Gu et al.,2008)进行细菌枯 萎病接种。如先前所述检测量疾病评分(Gu et al.,2004；2008)。

稻转化：将Xa10基因的亚克隆克隆进二元载体pC1300(CAMBIA, Canberra,Australia)中，并将该二元构建体转移至根癌农杆菌AGL1中。根 据如Yin et al.(2000)所述方法进行农杆菌介导的Nipponbare转化。

BAC文库构建：构建Xa10的细菌人工文库(BAG)，根据D.G.Peterson  et al.(http://www.ncgr.org/research/jag/paper300/indexpage300.html)所述方案 进行。简而言之，将IRBB10植物在温室中生长7-10天。分离高分子量(HMW) 核DNA，并包埋进低熔点琼脂糖塞中，用HindIII部分消化。然后将部分 消化的HMW DNA使用Pulse-Field Gel Electrophoresis(PFGE)装置(CHEF  Mapper II,Bio-Rad)进行大小分级分离。经大小分级分离的DNA(100-300kb) 通过电洗脱(Strong et al.,1997)从低熔点琼脂糖凝胶中回收，与HindIII消 化的去磷酸化BAC载体pIndigoBAC-5(EPICENTRE,Madison,WI53713, USA)连接。使用Cell-Porator系统(GIBCO-BRL)将连接混合物电穿孔进大 肠杆菌DH10B细胞中。人工挑取BAC克隆，在每孔具有60μl冷冻培养基 的384孔平板中排成阵列。将BAC克隆在37℃培养14-16小时，在-80℃ 贮存。所述BAC文库由大约50,000个克隆组成，插入体大小在30-60kb 范围，平均大小为40kb。这个文库的规模是稻基因组的至少3倍。

Southern印迹分析：根据标准程序进行Southern印迹分析(Sambrook et  al.1989)。将大约2-5μg稻基因组DNA用合适的限制酶消化，并在0.8% 琼脂糖凝胶中分离。将Southern印迹与用³²P-dCTP标记的DNA探针杂交 (GE Healthcare,Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)。

Northern印迹分析：根据标准程序进行Northern印迹分析(Sambrook et  al.1989)。使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)从叶中分离 总RNA。在northern印迹分析中每条泳道使用5μg信使RNA(mRNA)。通 过将RNA印迹与稻遍在蛋白基因1(Ubi)杂交评估RNA荷载。进行northern 印迹分析的DNA探针用³²P-dCTP标记(GE Healthcare,Little Chalfont, Buckinghamshire,UK)。

实时PCR分析：将大约1μg的DNase I-处理的总RNA转变为单链 cDNA，使用iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad,USA)进行。在IQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad,USA)上使用SsoFast  EvaGreen supermix(Bio-Rad,USA)进行定量反应。反应混合物(15μL)含有2 ×SsoFast EvaGreen supermix，0.9μM每种正向和反向引物，及1μL模板 cDNA。在如下条件下进行PCR扩增：95℃进行30秒，随后40次如下循 环：95℃进行5秒，60℃进行10秒。在扩增后立即进行解链曲线方案，即 加热10秒，自65℃开始，每次增加0.5℃。稻遍在蛋白1基因用作内部对 照。在这项研究中使用的所有引物在表1中示出。

表1：DNA寡聚物

cDNA末端的快速扩增(RACE)：使用SMART RACE^TMcDNA扩增试 剂盒(Clontech)分离Xa10cDNA。根据厂商指导进行5'RACE和3'RACE。 将PCR产物克隆进pGEM T-easy载体(Promega)中并测序。用于5'和3' RACE的第一链cDNA合成的引物分别是5'-CDS和Oligo-dT-anchor(表1)。 5'RACE的特异性引物是Xa10RT-F2、RGP6-F和Xa10RT-F3(表1)。5'RACE 的锚定引物是NUP(表1)。3'RACE的特异性引物是GS4R1(表1)。3'RACE 的锚定引物是ANCHOR(表1)。

GUS报道基因构建体：GUS报道基因构建体基于pCAMBIA载体 pC1305.1(Wu et al.,2008)和pANDA载体pANDA35HK(Miki and  Shimamoto,2004)及最小Bs4启动子(Boch et al.,2009)。简而言之，pC1305.1 中35S启动子通过用HindIII和NcoI消化除去，填补载体片段并自身连接 以产生pC1305.1(-35S)。pC1305.1(-35S)中的2151bp XhoI-XbaI片段由潮霉 素抗性基因编码序列和另一35S启动子组成，将该片段用来自pANDA35H 的attR元件的1787-bp XhoI-SpeI片段置换，产生pCGWGUSint。最小Bs4 启动子通过PCR扩增，并插入pENTR/DTOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA, USA)中，其在5’末端具有靶DNA框(Boch et al.,2009)。将启动子衍生物克 隆进含有来自pC1305.1的无启动子的GUSPlus基因的pCGWGUSint中。

农杆菌浸润及定性β-葡糖苷酸酶(GUS)测定：将携带TAL效应子构建 体或GUS报道基因构建体的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) C58C1(GV3101)菌株在28℃在补加适当抗生素和10mM2-(N-吗啉)乙磺酸 (MES)的LB中生长。收集两个菌株，在浸润培养基(10mM MgCl2，5mM  MES，150μΜ乙酰丁香酮，pH5.3)中重悬浮及1:1混合。如先前所述使用 1ml无针注射器将OD600为0.8的细菌溶液接种于烟草叶背轴面中(Kay et  al.,2007)。将接种的植物在温室中在25℃光照生长16小时。对于定性GUS 测定，在浸润后(dpi)两天取叶盘样品，在5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸 (X-Gluc)染色溶液中保温，在乙醇中脱色，干燥。对于定量测定，将来自2 dpi的两个不同植物的两个叶盘(1-cm直径)组合，在液氮中研磨。使用300μl GUS提取缓冲液(50mM磷酸钠(pH7.0)，10mM EDTA，10mMβ-巯基乙醇， 0.1%Triton-X100，0.1%SDS)提取蛋白质。在4℃离心收集上清。对于荧光 测定，将10μl测定缓冲液(GUS提取缓冲液补加10mM4-甲基-伞形酮-β-D- 葡糖苷酸(4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide,MUG)。将反应样品在37 ℃保温5分钟。通过将10μl反应样品与90μl0.2M碳酸钠(Na₂CO3，pH9.5) 混合结束反应。在平板阅读仪中在360nm(激发)和465nm(发射)进行测量， 使用4-甲基-伞形酮(MU)稀释液作为标准。蛋白质量通过Bradford测定 (BioRad,Hercules,CA,U.S.A.)量化。实验至少进行两次。

酵母单杂交研究：对于蛋白质-DNA相互作用研究，使用Matchmaker  Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System(Takara Bio Asia  Pacific/Clontech)，根据厂商方案进行实验。将诱饵DNA序列的1-4个拷贝 串联克隆进pAbAi载体中以产生诱饵构建体。将AvrXa10基因克隆进 pGADT7-Rec中，以产生猎物(prey)构建体，其中AvrXa10与作为诱饵的 SV40NLS-GAL4AD融合。鼠p53蛋白的GAL4-AD融合体和含有其靶序 列的诱饵(p53DBS)作为对照。将所述诱饵构建体用BstBI消化，转化进酵 母株Y1HGold中。通过菌落PCR证实转化体。然后将猎物构建体转化进 产生的在基因组中携带关联诱饵DNA序列的Y1HGold菌株中。将在30℃ 在选择性SD培养基上生长的转化体重悬浮于0.9%NaCl中，OD600为 0.002，或者大约2000个细胞/100μl。将在0.9%NaCl中的系列稀释液滴在 补加亮氨酸或200ng/ml金担子素A(AbA)的SD培养基上。通过菌落PCR 检查相同的转化体的诱饵质粒的存在情况，通过免疫印迹检查GAL4-AD- 融合蛋白的表达。

酵母菌落PCR：将单个酵母菌落重悬浮于20溶细胞酶(lyticase)缓冲液 (1.2M山梨糖醇，0.1M磷酸钠pH7.4，2.5mg/ml溶细胞酶(Sigma-Aldrich, INC.,Saint Louis USA))中，在37℃保温30分钟及在95℃保温10分钟。将 5μl的1:5稀释液以及寡核苷酸pAbAi-F2和pAbAi-R2(表1)用于PCR。

根据Kay et al.,(2009)所述方法进行Western印迹分析。将单个酵母菌 落重悬浮于含有组氨酸的SD液体培养基中，至OD₆₀₀=0.15，在30℃和150 rpm生长至OD₆₀₀=0.4-0.6。将3ml培养的细胞重悬浮于30μl裂化(cracking) 缓冲液(8M尿素，5%(w/v)SDS，40mM Tris-HCl pH6.8，0.1mM EDTA， 0.4mg/ml溴酚蓝，0.1%β-ΜΕ)中。将样品与玻璃珠(425-600μm；Sigma #G-8772)一起在20℃和14000rpm保温30秒，置于冰上30秒。重复这个 步骤三次。将样品在14000rpm和4℃离心10分钟。将上清在70℃变性5 分钟。将25μl蛋白质提取物在8%SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，使用抗 -GAL4AD(Sigma-Aldrich)和抗-兔IgG(Sigma-AIdrich)抗体进行免疫印迹 分析。通过推荐的增强的化学发光技术(Amersham)观测反应。

电动性迁移测定(EMSA)：根据Kay et al(2007)所述方法略加修改进行 EMSA。聚组氨酸标记的(6xHis)融合蛋白使用QIAexpressionist^TM试剂盒 (Qiagen,Chats-worth,CA)纯化自大肠杆菌M15。蛋白质浓度通过Bradford 测定(BioRad)确定。退火非标记的或者3’-生物素标记的寡核苷酸的互补对 (1^stBASE，Singapore)以获得双链DNA。使用Light Chemiluminescent  EMSA Kit(Pierce,Rockford,IL,USA)根据厂商指导进行EMSA。结合反应 含有12mM Tris-HCl(pH7.5)，60mM KC1，1mM DTT，2.5%甘油，5mM  MgCl₂，50ng/μl poly(dI·dC)，0.05%NP-40，0.2mM EDTA，20fmol生物 素标记的DNA，0-10pmol未标记的DNA，60-6000fmol6xHis融合蛋白。 将结合反应在冰上保持10分钟，之后加入生物素标记的DNA。将结合反 应在室温保温20分钟。在6%天然聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。在正电荷 的尼龙膜(Amersham)上印迹之后，通过装备254nm灯管的UV光交联仪以 120mJ/cm²交联所述DNA。 实施例2：Xa10编码新的跨膜蛋白

通过基于作图的克隆和遗传转化从Xa10品系IRBB 10A中分离Xa10 基因。Xa10两侧的标记M491和M419 (Gu et al. 2008)及Xa10共分离标记 S723用于筛选人工Xa10 BAG文库。通过M491和S723挑取BAG克隆 44M10(图1A)。对44M10中BAG插入体进行测序，其亚克隆用于转化易 感品种Nipponbare。9个44M10亚克隆有6个产生独立的对Xa10不相容的 Xoo菌株PXO99(pHM1AvrXa10)抗性的转基因植物(表2，图1A)。这些抗 性转基因品系赋予Xa10-不相容的Xoo菌株而非Xa10-相容菌株的种族特异 性抗性(表3和4，图1A和1B)。521-bp的Xa10 cDNA克隆(SEQ ID NO: 36) 通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及快速扩增5’互补DNA末端(5' RACE) 分离。对比Xa10 cDNA与其基因组序列(SEQ ID NO:35)鉴别了在其3’非翻 译区(3'UTR)的249 bp内含子(图1C)。在内含子剪接位点的供体和适体是 GA和CG，其不遵循在高等植物中针对内含子的一般的GT-AG原则(图 1C)。这种对比还鉴别了Xa10基因的启动子区域(SEQ ID NO:38)。使用来 自Xa10编码区的探针的Southern印迹分析表明Xa10基因仅存在于植物中， 但在易感稻品系中没有(图2)。Xa10编码序列在稻PR1启动子控制下的异 位表达，其不是由AvrXa10特异性激活的，提供了对Xa10相容和Xa10不 相容的Xoo菌株的非特异性抗性(表4；图3A)。这些结果表明是Xa10基因 产物提供Xoo抗性。

表2：Xa10转基因品系对Xoo菌株PXO99(pHM1avrXa10)的疾病评估总结

¹用于农杆菌介导的稻转化的在Xa10基因座的亚克隆。S18901，18901bp SpeI片段；A14799， 14799bp AvrII片段；ES11947，11947bp ECoRI-SpeI片段；EA9295，9295bp EcoRV-AvrII片段； SA4686，4686bp SacI-AvrII片段；PX3834，3834bp PmlI-XbaI片段；SX10761，10761bp SpeI-XhoI 片段；EN6879，6879bp EcoRV-NruI片段；B6804，6804bp BamHI片段。

表3：Xa10转基因品系对细菌枯萎病的疾病评估¹

¹6周龄X10转基因植物和野生型植物稻黄单胞菌稻致病变种菌株PXO99(pHM1avrX10)接种。接种 植物的损害长度及疾病表型在接种后两周进行评分。

²转基因在Nipponbare中的拷贝数。N.A.，不适用。N.D.，未检测

³损害长度(L.L.)及平均值标准误差是16个感染叶的平均值。对于评分：R，抗性，0cm≤L.L.≤3.0cm； MR，中等抗性(moderately resistant)，3.0cm≤L.L.≤6.0cm；MS,中等易感，6.0cm<L.L.≤9.0cm；S， 易感的，L.L.>9.0cm。

表4：野生型植物和纯合转基因品系L198和L162对不同 稻黄单胞菌稻致病变种菌株的疾病评估¹

¹6周龄植物用Xoo接种。对于每个菌株，接种来自4个个体植物的至少16片叶。转基因品系L198 携带Xa10亚克隆SA4686，而L162携带P_PR1:Xa10:T_Nos基因。

²损害长度(L.L.)及平均值标准误差是16个感染叶的平均值。对于评分：R，抗性，0cm≤L.L.≤3.0cm； MR，中等抗性，3.0cm≤L.L.≤6.0cm；MS,中等易感，6.0cm<L.L.≤9.0cm；S，易感的，L.L.>9.0cm。

Xa10基因编码由126个氨基酸残基组成的小蛋白质(XA10；SEQ ID NO: 37)(图1D)。XA10示出与稻假设蛋白(hypothetical protein)Os11g37620(163 aa)的50%相同性(54/108)及与另一稻假设蛋白Os11g37570(134aa)的34% 相同性(38/109)。这两种假设蛋白可以是稻基因组中XA10的旁系同源基因。 编码这两个假设蛋白的基因位于稻染色体10的长臂上，但是其无一与Xa10 基因座是等位的。在XA10中通过DAS服务器(http colon//www dot sbc dot  su dot se/～miklos/DAS/)或TMHMM服务器(http colon//www dot cbs dot dtu  dot dk/services/TMHMM/)预测了四个跨膜螺旋，表明XA10也许是跨膜蛋 白(图4)。使用SignalP3.0服务器(http colon//www dot cbs dot dtu dot  dk/services/SignalP/)在XA10的N末端区也预测了可裂解的信号肽(图5)。

实施例3：AvrXa10特异性激活Xa10转录

Xa10在存在AvrXa10(SEQ ID NO:54)条件下被特异性诱导。在未接种 的IRBB10A植物中或者接种的IRBB10A植物中在用PXO99(pHM1avrXa10) 接种后(HAI)1.5小时检测到无Xa10转录体(图6A和6B)。在3HAI略微检 测到Xa10转录体，在6-12HAI达到最大值，在48HAI保持高水平(图6A 和6B)。NLS基序和AAD结构域均是TAL效应子起作用必需的。事实上， AvrXa10中三个NLS基序的突变(突变序列是SEQ ID NO:56)或者AvrXa10 中AAD结构域的缺失(突变序列是SEQ ID NO:55)消除了IRBB10A中Xa10 的诱导(图6C)。Xa10基因由AvrXa10的特异性诱导在携带Xa10基因的 4686-bp基因组克隆的转基因品系L198中也观测到(图3B)。品系L162中 由稻PR1启动子驱动的Xa10编码区的异位表达在未接种的植物中高度检 测到(图3B)。尽管用Xa10不相容的或Xa10相容的菌株进行细菌枯萎病接 种对其部分抑制，但是在接种的L162植物中的Xa10转录体仍与L198植 物中的相当，提供了对PXO99(pHM1AvrXa10)和PXO99的广谱抗性(图3 A；表4)。

实施例4：AvrXa10依赖于OsTFIIAγ5以激活Xa10转录

OsTFIIAγ5是稻通用转录因，由稻中隐性(recessive)抗性基因xa5编码 的其V39E取代在用Xa27不相容菌株接种时在xa5和Xa27双纯合体中极 大地弱化Xa27基因的诱导(Gu et al.,2009)。为了检测OsTFHAγ5是否是 AvrXa10诱导Xa10基因所必需的，从IRBB5(xa5/xa5)与IRBB10A (Xa10Xa10)之间杂交产生xa5和Xa10双纯合植物。用Xoo菌株PXO99 (pHM1avrXa10)接种的细菌枯萎病表明双纯合植物在接种后2周(WAT)示 出部分抗性表型(图7A)。植物的平均损害长度(损害长度=3.1±1.6cm)长于 IRBB10A植物(损害长度=0.8±0.4cm)(图7A)。双纯合植物中的细菌群比易 感IRBB5植物中低3-50倍，而IRBB10A植物中的细菌群比易感IRBB5植 物中低34-293倍(图7B)。与接种的IRBB10A植物中的Xa10基因的强诱导 比较，在接种的双纯合植物中所述基因仅被微弱诱导(图7C)。定量实时PCR 分析表明接种的双纯合植物中Xa10转录体仅是接种的IRBB10A植物中的 17%(图7D)。这些结果证实稻通用转录因子OsTFIIAγ5是AvrXa0激活Xa10 转录所必需的。xa5对Xa10介导的Xoo抗性抑制的鉴别提供了使用xa5 和Xa10栽培BB抗性的指导原则。

实施例5：Xa10启动子中AvrXa10结合位点的鉴别

AvrXa10靶DNA序列(AvrXa10框)通过候选方法鉴别。基于TAL效应 子的DNA-靶特异性模型，其中在TAL效应子的每个重复中位置12和13 的两个超可变氨基酸残基识别靶DNA中的一个碱基对(Boch et al.,2009)， 在220-bp Xa10启动子中预测12个AvrXa10框候选(图8)。重叠的框1、4、 7和10在220-bp Xa10启动子中重叠及复制一次，而重叠的框2、5、8和 11及框3、6、9和12分别形成其它两个框簇(图8)。将Xa10启动子和 AvrXa10框候选在最小Bs4启动子前面克隆进含有内含子的GUS (GUSPlus)报道载体中(图9)。AvrXa10对AvrXa10框的特异性可诱导性通 过经根癌农杆菌与35S-驱动的avrXa10基因共输送进烟草叶细胞的GUS报 道构建体的瞬时表达进行研究。最初的研究表明220-bp Xa10启动子(-1至 -220)(SEQ ID NO:39)是AvrXa10-可诱导的，应携带AvrXa10框(图10)。 进一步的研究证实框8和框11是AvrXa10-可诱导的(图10)。这两个候选 均携带AvrXa10框的核心序列，其包含在框8中位置0-12的13个碱基对 (图10)。框8此后在随后的研究中被命名为AvrXa10框。

实施例6：AvrXa10对AvrXa10框的特异性识别

来自Xoo菌株PXO99的TAL效应子AvrXa27特异性激活Xa27基因 的表达，这是稻中另一种细菌枯萎病抗性基因(Gu et al.,2005)。AvrXa27基 因的核苷酸序列和氨基酸序列分别是SEQ ID NO:79(GenBank登录号 AY986494)和SEQ ID NO:80(GenBank登录号AAY54168)。AvrXa27不能 激活Xa27基因的易感等位基因(xa27，其与Xa27共有相同产物，仅在启动 子区域示出多样性(Gu et al.,2005)。近来鉴别了AvrXa27靶DNA(UPT_AvrXa27框或AvrXa27框)(Romer et al,2009b)。由于迄今为止未鉴别Xa10基因的易 感等位基因，我们对比了AvrXa10与AvrXa27的DNA靶特异性。烟草叶 细胞中的瞬时表达测定表明AvrXa10框由AvrXa10特异性识别，而不由 AvrXa27特异性识别，反之亦然(图11)。通过酵母单杂交测定证实，AvrXa10 框由AvrXa10的识别或者AvrXa27框由AvrXa27的识别也发生在酵母中(图 12)。然后通过电动性迁移测定(EMSA)检测6xHis::AvrXa10(图13)与 AvrXa10框或者6xHis::AvrXa27(图13)与AvrXa27框之间的天然相互作用 (图14)。AvrXa10与AvrXa10框探针高度亲和性结合，但是与AvrXa27框 探针则不是如此(图14B)。重要地是，未标记的AvrXa10框探针可轻易地 胜过AvrXa10与AvrXa10框探针的结合，而即便是1000倍过量的未标记 AvrXa27框探针也不能胜过所述结合(图14C)。复杂地是，AvrXa27既结合 AvrXa10框探针也结合AvrXa27框探针(图14B)。1000倍过量的未标记 AvrXa27框探针的能够胜过AvrXa27与AvrXa10框探针或AvrXa27框探 针的结合，但是相同量未标记的AvrXa10框探针却不能(图14D)。这些数 据证实AvrXa10与Xa10启动子具有特异性高亲和性，而AvrXa27与DNA 序列以较低特异性结合，至少在EMSA中如此。此外，在EMSA中可以人 工结合AvrXa27与AvrXa10框探针，在酵母单杂交测定中证实因为 AvrXa27与AvrXa10框在酵母中不天然相互作用(图12)。

实施例7：鉴别AvrXa10框中AvrXa10结合及转录激活的关键核苷酸

为进一步研究AvrXa10框中每个核苷酸对AvrXa10结合的贡献，我们 制备了17个AvrXa10框缺失突变体，每个突变体具有一个核苷酸缺失(图 15A)。AvrXa10框中的前4个核苷酸(位置0至3)对于AvrXa10与AvrXa10 框或Xa10启动子的结合是关键的。在AvrXa10框中这4个核苷酸的任一 个的缺失均消除AvrXa10框活性并且损害或显著影响AvrXa10与EMSA中 突变体探针的结合(图15B和15C)。缺失位置4至11任一核苷酸也消除 AvrXa10框活性但是不显著影响AvrXa10与EMSA中突变体探针的结合 (图15B和15C)。先前的从AvrXa10框的3’的缺失表明位置12的核苷酸“T” 是AvrXa10框活性所需的(图10)。因此，缺失位置12和13的任一或两个 核苷酸不影响AvrXa10框活性及AvrXa10与两个突变体探针的结合(图 15B和15C)。最后，如预期的，AvrXa10框的最后3个核苷酸的任一个的 缺失(位置12至17)不显著影响突变体的AvrXa10框活性及AvrXa10与突 变体探针的结合(图15B和15C)。

上述缺失研究表明AvrXa10框的核心序列包含在位置0-12的13个碱 基对(TATATACACACGT；SEQ ID NO:81)(图15)。在这13个碱基对中， 框7和AvrXa10框显示在位置9-12的多态性(图16A)。先前研究还表明在 AvrXa10的预测靶DNA序列中的位置11“A”和“G”均是有功能的(Boch  et al.,2009；Dongsheng Tian and Zhongchao Yin,未公布的数据)。因此，在 AvrXa10框(CAC)和框7(TCA)的位置9-11的核苷酸可决定它们在转录 激活中的特异性。为证实这个假设，我们产生了AvrXa10框和框7的突变 体(图16A)。突变体框8M1在AvrXa10框背景中的位置9至11含有 "TCA"，而突变体框7M在框7背景中的相同位置携带"CAC"(图16A)。 在烟草叶细胞中的GUS活性的瞬时表达测定表明框8M1完全消除 AvrXa10框活性，而框7M显示在GUS报道基因诱导中的AvrXa10框活 性(图16B)。在框7中"TCA"的任一个核苷酸改变为AvrXa10框中的相应 核苷酸的突变体(框7M1,框7M2和框7M3)不显著增加它们诱导GUS报 道基因的能力(图16B)。但是，在框7中"TCA"的任两个核苷酸改变为 AvrXa10框中的相应核苷酸的突变体(框7M4,框7M5和框7M6)部分增 加它们诱导GUS报道基因的能力(图16B)。尽管框8M1和框7均不具有 AvrXa10框活性，但是EMSA证实AvrXa10以相似的高亲和性结合框8M1 和框7的探针，与结合AvrXa10框和框7M1的探针一样(图17)。AvrXa10 与AvrXa10框、框8M1、框7或框7M1之间的物理相互作用也在酵母中 观测到，由酵母单杂交测定证实(图18)。

这些结果表明AvrXa10框可能具有两个功能中心：前4个核苷酸(TATA) 是AvrXa10结合中心，位置9至11的3个核苷酸是AvrXa10转录激活中 心。两个中心是功能性AvrXa10框关键需要的。AvrXa10与不具有转录激 活中心的AvrXa10框样DNA元件的结合不足以导致基因转录激活。 AvrXa10框中的其它核苷酸可提供骨架，对AvrXa10结合和/或转录激活贡 献很小。

在描述本发明的上下文(特别是权利要求书上下文)中的术语“一个”和 “所述”或者相似对象被解释为包括单数和复数，除非本文另有指示或者 上下文明确相反。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释 为开放式(即表示“包括，但不限于”)，除非另有说明。本文数值范围的描 述仅仅是落入该范围的每个单独数值逐个指示的简写方法，除非本文另有 指示，并且每个单独数值引入在说明书中就像其在本文逐个描述。例如， 如果范围10-15被公开，则11、12、13和14也被公开。本文描述的所有 方法可以任何合适顺序进行，除非本文另有指示或者上下文清楚指示相反。 本文提供的任何和所有实施例或举例语言(例如，“如”)的使用仅仅是为了 更好示出本发明，不是对本发明范围的限制，除非另有声称。说明书中的 语言不应被理解为表明任何非声称的元素对于实施本发明是关键的。

应理解本发明的方法和组合物可以以各种实施方案形式引入本文，本 文公开了仅仅少数。本发明的实施方案在本文中描述，包括发明人已知的 进行本发明的最佳模式。那些实施方案的变化在本领域技术人员阅读前述 描述后可以显而易见。发明人预期本领域技术人员合适地可以采用这种变 化方案，本发明人意在本发明可以不同于本文具体描述的实施。因此，本 发明包括合适的法律允许的权利要求中描述的主题的所有修饰和等价物。 另外，上述元件在所有可能的变化方案中任何组合均包含在本发明中，除 非本文另有指示或者上下文清楚给出相反指示。

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