一种治疗猪的子宫内膜炎和阴道炎的灌注液、其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种治疗猪的子宫内膜炎和阴道炎的灌注液，其有效成分为苦豆子总碱。本发明还提供其制备方法和应用。本发明的灌注液具有抗菌、消炎、低毒、无残留、不易产生耐药性等优点，刺激性小，成本较低，能够有效治疗因细菌、真菌、滴虫引起的猪的子宫内膜炎、阴道炎等疾病，特别是靶向治疗猪的子宫内膜炎、阴道炎。本发明具有单味中药的提取物，有利于产品的稳定性和质量可控性；靶向制剂在猪的子宫内膜和阴道内释放，减少消化道的吸收，在病变区直接释放且可以较高浓度分散于猪的子宫内膜和阴道内，对疾病的治疗更有效、确切；靶向制剂减少药物对上消化道的刺激，不良反应少，使用方便，顺应性好。使猪的养殖企业获得良好的经济效益。

说明书

技术领域

本发明涉及一种药液，具体地，涉及一种治疗猪的子宫内膜炎和阴道炎的灌注液。

背景技术

猪的阴道炎、子宫内膜炎在养猪生产中是一种常见的主要生殖器官疾病，绝大多数病猪是体外侵入病原体而感染，如分娩时产道损伤污染，胎衣碎片残存，子宫弛缓时恶露滞留，人工授精消毒不严，自然交配时公猪生殖器官或精液内有炎性分泌物等。其病原有双球菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，多由阴道炎进而发展为子宫内膜炎。据临床统计，母猪发情不正常或延迟，屡配不孕的母猪80%以上是患子宫内膜炎，这样会给养母猪户带来惨重的经济损失。该病在临床上发病率高、难防治，给猪的养殖业造成巨大的经济损失。

目前猪的子宫内膜炎、阴道炎防治措施很多，如抗菌消炎、增强机体抵抗力，并以疫苗免疫和良好的管理饲养等，但是猪的子宫内膜炎、阴道炎发病几率还是特别高。特别是临床普遍采用的抗生素和化药治疗猪的子宫内膜炎、阴道炎，首先是猪的子宫内膜炎、阴道炎的临床症状消失，但很容易复发；其次抗生素和化药抗菌的耐药性普遍存在，使用抗生素和化药的剂量在不断加大，但临床疗效不好，再加上抗生素残留，直接危害人类健康。

苦豆子为多年生豆科草本植物，苦豆子的干燥全草及种子。苦豆子广泛分布于甘肃、宁夏、新疆、西藏、内蒙古等地。全草夏季采收，种子春季采收，干燥。全草生用，种子炒用。近年来国家将苦豆子列入重点保护的六大地道药材之一，纳入国家中药现代化科技产业行动计划中，对于生产基地建设和深层次开发都有长足的发展。

苦豆子味极苦、性寒有毒，具有清热解毒，抗菌消炎、止痛杀虫等作用。民间用根治疗喉痛、咳嗽、痢疾及湿疹等。目前用于药物开发的主要有8种生物碱：槐果碱，苦参碱，氧化苦参碱，氧化槐果碱一，槐胺碱，槐定碱，莱曼碱，苦豆碱。

苦豆子生物碱的药理作用：1、抗菌作用，目前已经成功研制出治疗痢疾药苦豆子片及治疗妇科炎症药妇炎栓（苦豆子）栓；2、对心血管系统的作用，体现在抗心律失常、正性肌力作用，降压和降低心率作用，对心肌缺血和梗塞的保护作用，降血脂作用；3、抗病毒、抗炎及免疫抑制作用，苦豆子总碱能抑制多种病毒繁殖．增强免疫调节功能和免疫促进作用；4、抗肿瘤作用，对肝癌细胞抑制作用明显，对宫颈癌、淋巴肉瘤、肺癌也有抑制作用；5、对平滑肌的作用，苦豆子总碱和一些单体生物碱均能对抗由炎症介质诱导的离体回肠收缩，对支气管平滑肌具有松弛作用，对整体模型也有作用：6、目前临床应用苦豆子浸膏片、苦豆碱治疗急性菌痢，槐果碱片治疗支气管哮喘，苦参碱治疗妇科炎症、苦参素注射液治疗慢性乙型病毒性肝炎均取得很好的疗效。

发明内容

本发明提供了一种治疗猪的子宫内膜炎和阴道炎的灌注液，是以苦豆子总碱为原料，具有很好的治疗效果，且不易复发；因为使用的是纯天然的植物药，所以也不存在抗药性的问题。本发明还提供该灌注液的制备方法和应用。

本发明提供了一种治疗猪的子宫内膜炎和阴道炎的灌注液，所述灌注液的有效成分为苦豆子总碱。

优选地，所述灌注液含有质量百分比3-8%的苦豆子总碱。

优选地，所述灌注液由以下步骤制备而成：

1）制备苦豆子总碱：取苦豆子种子粉碎至50-80目，加入体积百分比为50%-90%的乙醇水溶液进行超声波提取，超声频率20KHz，5000W，过滤后回收乙醇，加入2%盐酸调pH为2-5，加入乙醚洗涤2次，得到滤液沉淀，再加入氯仿萃取三次沉淀，减压回收氯仿得到苦豆子总碱；

2）制备灌注液：在步骤1）得到的苦豆子总碱中加入注射用水定容，苦豆子总碱和注射用水的质量比为（3-8）：（92-97），采用流通蒸汽灭菌30-40min,在无菌条件下进行灌装得到灌注液。

本发明还提供一种治疗猪的子宫内膜炎和阴道炎的灌注液的制备方法，步骤如下：

1）制备苦豆子总碱：取苦豆子种子粉碎至50-80目，加入体积百分比为50%-90%的乙醇水溶液进行超声波提取，超声频率20KHz，5000W，过滤后回收乙醇，加入2%盐酸调pH为2-5，加入乙醚洗涤2次，得到滤液沉淀，再加入氯仿萃取三次沉淀，减压回收氯仿得到苦豆子总碱；

2）制备灌注液：在步骤1）得到的苦豆子总碱中加入注射用水定容，苦豆子总碱和注射用水的质量比为（3-8）：（92-97），采用流通蒸汽灭菌30-40min,在无菌条件下进行灌装得到灌注液。

其中，苦豆子总碱可以选择市售的产品。

本发明的第三个目的是提供一种苦豆子总碱的制备方法，步骤如下：取苦豆子种子粉碎至50-80目，加入体积百分比为50%-90%的乙醇水溶液进行超声波提取，超声频率20KHz，5000W，过滤后回收乙醇，加入2%盐酸调pH为2-5，加入乙醚洗涤2次，得到滤液沉淀，再加入氯仿萃取三次沉淀，减压回收氯仿得到苦豆子总碱。

本发明的第四个目的是提供苦豆子总碱在治疗猪的子宫内膜炎和阴道炎中的应用。

本发明的第五个目的是提供苦豆子总碱灌注液在治疗猪的子宫内膜炎和阴道炎中的应用。

优选地，所述苦豆子总碱灌注液中苦豆子总碱的质量百分含量为3-8%。

优选地，是将苦豆子总碱灌注液灌注到猪的子宫中，每次用量100毫升，每天一次。

本发明的灌注液具有抗菌、消炎、低毒、无残留、不易产生耐药性等优点，而且刺激性小，成本较低，能够有效治疗因细菌、真菌、滴虫引起的猪的子宫内膜炎、阴道炎等疾病，特别是靶向治疗猪的子宫内膜炎、阴道炎。本发明具有单味中药的提取物，有利于产品的稳定性和质量可控性；靶向制剂在猪的子宫内膜和阴道内释放，减少消化道的吸收，在病变区直接释放且可以较高浓度分散于猪的子宫内膜和阴道内，对疾病的治疗更有效、确切；靶向制剂减少药物对上消化道的刺激，不良反应少，使用方便，顺应性好。使猪的养殖企业获得良好的经济效益。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中使用的苦豆子总碱，也可以选择市售的，其效果与本申请人自制的苦豆子总碱相同。

实施例一 牛津杯法测定苦豆子总碱的体外抗菌活性

采用牛津杯法测定了苦豆子总碱对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、双球菌的抗菌活性。试验结果表明，苦豆子总碱浓度为5mg/ml时，金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、双球菌、大肠杆菌的抑菌圈直径分别为10.05mm、6.89mm、10.66mm、9.94mm。在20mg/ml时抑菌圈直径分别为13.98mm、12.93mm、19.61mm、19.30mm。可以看出随着浓度的升高，苦豆子总碱对大肠杆菌和双球菌的抑制作用明显高于对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌。其中对双球菌的抑制作用最强，对无乳链球菌的抑制作用相对其它三种菌最弱。

1  材料与方法

1.1  材料与试剂

供试菌：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、双球菌，均由兰州畜牧与兽药研究所兽药研究室提供。

供试样：苦豆子总碱，由广东海纳川药业股份有限公司生产，制备方法与实施例二中相同，用注射用水溶解后配制成不同浓度的供试液。

1.2  仪器与设备

KH-300DB型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；

RE-201D旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司；

电热恒温培养箱，上海鸿都电子科技有限公司DNP-9272A型；

恒温振荡器，美国精骐有限公司IS-RDV1；

生物安全柜，上海申力科学仪器有限公司HFsafe-1500。

1.3  菌悬液的制备

将活化培养好的菌液分别接入无菌生理盐水中，依次进行梯度稀释，使菌悬液中的细菌数为10⁷cfu/ml。

1.4  牛津杯法测定抗菌活性

将已融化的培养基20ml加入高压灭菌过的培养皿内，凝固后吸取200微升菌悬液加入其中，用涂布器将菌液涂布均匀，制成带菌平皿，用无菌镊子夹取已高压蒸汽灭菌并烘干的牛津杯，轻轻平置于已涂布菌液的培养皿表面，每个培养皿十字对称放置4个牛津杯，用无菌移液枪分别移取200微升不同质量浓度的供试样到牛津杯中，将培养皿缓慢移入恒温培养箱，37℃培养18h，取出观察各培养皿菌落生长情况，并用游标卡尺测定抑菌圈直径，记录数据，供试样的浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml。

2   结果

通过以上方法测定，结果如下表1。

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3   结论

苦豆子总碱对猪的子宫内膜炎、阴道炎的主要几种致病菌均有抑制作用，并在一定的范围内随着苦豆子总碱浓度的升高抑制作用也逐步增强，其中对双球菌的抑制作用最强，对无乳链球菌的抑制作用相对其它三种菌最弱。可以进一步研究苦豆子总碱对其它细菌的抑制作用，为苦豆子总碱的开发利用提供参考依据。

实施例二：苦豆子总碱对小鼠急性毒性试验研究

采用改良寇氏法测定苦豆子总碱对小鼠腹腔注射的急性毒性，评价其安全性，为临床安全用药提供依据。试验时，给试验组小鼠灌服不同浓度的苦豆子总碱，观察给药后小鼠的活动与死亡情况，采用改良寇氏公式计算LD₅₀及LD₅₀的95%可信限，结果表明，苦豆子总碱经腹腔注射的LD₅₀为559.24mg/kg，LD₅₀的95%可信限为471.95mg/kg～663.59ma/kg。试验结果初步提示，苦豆子总碱的毒性较低，临床安全用药可靠。

1   材料与方法

1.1  材料

1.1.1  试验动物

昆明系清洁级健康小鼠，雌雄各半，体重（20±2）ｇ,购自兰州大学试验动物中心（甘医动字14-005）。

1.1.2  受试药物

苦豆子总碱，由广东海纳川药业股份有限公司提取制备。

1.2  方法

1.2.1  苦豆子总碱的提取

取苦豆子种子粉碎至50-80目，加入体积百分比为50%-90%的乙醇水溶液进行超声波提取，超声频率20KHz，5000W，过滤后回收乙醇，加入2%盐酸调pH为2-5，加入乙醚洗涤2次，得到滤液沉淀，再加入氯仿萃取三次沉淀，减压回收氯仿得到苦豆子总碱，经检测，苦豆子总碱的纯度为98%，检测仪器是高效液相色谱检测仪检测。

检测方法如下：6%苦豆子总碱灌注液（以苦豆子总碱计）；槐定碱对照品（批号：11060901，含量≥98%）、槐果碱对照品（批号：11052422，含量≥98%）购自成都曼思特生物科技有限公司；苦参碱对照品（批号：110805-200508）购自中国药品生物制品检定所；乙腈为色谱纯，购自山东双双化工有限公司，其他试剂均为分析纯。色谱柱： Y M C - p a c k e d O D S - A 柱（ 1 5 0 m m × 4 . 6 m m ， 5 μ m ） ， 流动相为V 1（ 乙腈） ∶ V 2（ 0 . 0 5 m o l / L K H ₂P O ₃） ∶ V 3（三乙胺）=8∶92∶0.18，检测波长220nm，流速1.0mL/min的条件下进行检测。

1.2.2  预试验

预试验前对小鼠进行7d的喂养观察，观察期内，小鼠自由采食，饮水，淘汰自然死亡小鼠。预试验期内选取健康小鼠25只，雌雄各半，随机分为5组。每组5只，试验前禁食8小时，将苦豆子总碱配制成5个浓度，各组等浓度腹腔注射给药，确定正式试验的剂量范围。

1.2.3  正式试验

根据预试验，确定Dn和Dm，在Dn和Dm之间设6个剂量组，每组10只小鼠，雌雄各半。试验前禁食8小时，自由饮水。腹腔注射给药后立即观察和记录小鼠的行为状态和死亡情况，观察期为7天，根据实验结果计算半数致死量（LD₅₀），对死亡小鼠及时解剖，记录病变情况，观察小鼠腹腔和实质性器官的病理变化。

1.2.4  LD₅₀的计算方法

采用改良寇氏法计算LD₅₀及LD₅₀的95%可信限，计算公式如下：

LD₅₀=lg^-1[Xm-?(Σp-0.5)]

Sx₅₀=?

LD₅₀的95%可信限=lg^-1（lgLD₅₀±1.96×Sx₅₀）

式中：?为组距，即相邻2组剂量的对数剂量之差；Xm为最大死亡率组剂量对数；Σp为各剂量组死亡率之和；p为各剂量组死亡率；q为各剂量组存活率；n为各组动物数；Sx₅₀为lgLD₅₀的标准误。

2    结果与分析

2.1  预试验结果

苦豆子总碱对小鼠急性毒性预试验结果如表2所示。由预试验结果得出，Dn与Dm分别为200mg/kg和1000mg/kg。根据预试验结果确定正式试验分为6个剂量组，按下式求出剂量比：

r=(N-1)

式中，r为相邻两组剂量的比值；N为正式试验所需组数。计算得出正式试验的r=0.707。

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根据预试验结果，设为200mg/kg、276.24mg/kg、381.55mg/kg、527.00mg/kg、727.90mg/kg、1000mg/kg体重6个给药剂量组，进行急性毒性试验。结果如表3所示。根据表3中的数据，由公式算出，苦豆子总碱对小鼠的半数致死量LD₅₀=559.24mg/kg，LD₅₀的95%可信限为471.95mg/kg～663.59mg/kg。因此判定苦豆子总碱对小鼠经腹腔注射LD₅₀大于500mg/kg，根据我国动物毒理急性毒性分级法，苦豆子总碱属于低毒物质。

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2.3    苦豆子总碱对小鼠急性毒性试验临床观察

小鼠一次性腹腔注射给药，剂量为200mg/kg时，在试验期内小鼠无死亡现象，2小时未死亡小鼠症状逐渐减轻，12小时后基本恢复正常，能正常进食和饮水；剂量为276.24mg/kg时，在1小时内小鼠死亡一只；剂量为381.55mg/kg时，在15分钟之内小鼠死亡2只；剂量为527.00mg/kg时，在10分钟内小鼠死亡3只；剂量为727.90mg/kg时，在10分钟内小鼠死亡6只；剂量为1000mg/kg时，在5分钟内小鼠全部死亡。

小鼠在腹腔注射给药后的主要中毒症状表现为精神萎靡，拱背，全身抽搐，前爪挠嘴，并有间断性兴奋。临死前多呈现出跳跃动作，继而四肢呈游泳状，随后死亡。

2.4  急性毒性试验死亡小鼠剖检结果

对死亡小鼠解剖发现腹腔中有少量积液，心脏色泽暗淡，肝脏有轻微的肿大，肾脏眼观无明显变化，其他脏器无明显眼观病变。对存活小鼠及空白对照组小鼠6天后处死并解剖观察，未发现腹腔积液，其他脏器无明显眼观病变。

3   结果

试验结果表明，苦豆子总碱对小鼠腹腔注射的半数致死量LD₅₀为559.24mg/kg，LD₅₀的95%的可信限为471.95mg/kg～663.59ma/kg，符合低毒物质分级标准。

一次性小鼠腹腔注射给药后，存活小鼠12小时后基本恢复正常，6天后对存活小鼠进行解剖学观察，各脏器均未见明显眼观病变。说明试验后存活小鼠恢复较快，药物对其持续影响较小。

苦豆子总碱在人类临床医学上的研究与应用较多，但在畜牧业生产方面的研究与应用较少，本次试验通过对苦豆子总碱的急性毒性进行评价，为以后苦豆子总碱在畜牧业中的进一步开发研究应用做了准备工作。

实施例3 用苦豆子总碱灌注液治疗猪的子宫内膜炎、阴道炎，效果明确，治愈后不易反弹。

自2011到2012年我公司对苦豆子总碱灌注液治疗猪的子宫内膜炎、阴道炎进行临床试验。通过协商先后在白银靖远猪场选择了患子宫内膜炎、阴道炎的母猪作为试验对象。

其中，患慢性子宫内膜炎、阴道炎的母猪10头，临床症状表现为发情周情正常，屡配不孕，即使妊娠，大多数也流产，从阴门排出絮状物的混浊粘液，特别是发情或卧下时排出较多。严重时由阴门排出，带有恶臭味的灰白色或黄褐色的脓性渗出物或脓。有的食欲减退或废绝，体温升高。

患急性子宫内膜炎、阴道炎母猪10头，临床症状表现为黏液性及黏液脓性。病猪全身症状明显，精神沉郁，食欲下降甚至废绝，体温升高，一般为39.5℃～41.5℃，拱背，尿频，努责，从阴门中不断地排出灰红色或黄白色有臭味的黏液性或脓性分泌物，重者呈污红色或棕色，当其卧倒时排出较多，常混有胎衣碎片。

1. 试验用药品

苦豆子总碱灌注液：其中苦豆子总碱的含量为6%（质量百分比）。

注射用青霉素购自本地兽药店，由远征药业有限公司生产，批号为20110623，规格为5g/支。

2.试验

2.1 试验分组

2011年6月5日至19日，在该猪场把10头已出现临床症状的患病母猪作为第一组；6月25日至7月25日在同一牧场有22头出现临床症状的患病母猪，选出10头与第一组情况基本相似的患病母猪作为第二组；每组均包括5头慢性子宫内膜炎、阴道炎的母猪和5头急性子宫内膜炎、阴道炎的母猪，分别对二组分别给药苦豆子总碱灌注液、注射氨苄西林钠进行治疗。

2.2 试验方法

试验组采用苦豆子总碱灌注液进行治疗，每头母猪一剂，通过输精瓶或灌肠器或注射器（100ml）连接长约50cm简易输精管或胃导管进行子宫内灌注，每次用量100毫升，每天一次，连用5d为一个疗程；对照组采用注射用氨苄西林钠，子宫灌注每次50ml,每天一次，连用5d为一个疗程。

3结果

用药后治愈表现为从阴门中常排出脓性分泌物，呈灰色、黄褐色、灰白色分泌物消失，阴门周围皮肤及尾根上粘附着脓性分泌物消失。用苦豆子总碱灌注液治疗猪的子宫内膜炎、阴道炎的治愈率为80%，氨苄西林钠治疗猪的子宫内膜炎、阴道炎的治愈率为70%。

苦豆子总碱灌注液组的10头母猪在用药5d之后有8头母猪的子宫内膜炎、阴道炎消失或明显改变，治愈率为80%（8/10），子宫内膜炎、阴道炎没有复发。氨苄西林钠组的10头母猪在用药后五天之后有7头子宫内膜炎、阴道炎症状消失或明显改变，治愈率为70%（7/10），在治愈过程中有子宫内膜炎、阴道炎复发现象，治愈不彻底。苦豆子总碱灌注液组的治疗效果高于氨苄西林钠组。

4结论

苦豆子总碱灌注液、注射用氨苄西林钠治疗母猪子宫内膜炎、阴道炎分别是87.5% 和78%，在治愈率方面苦豆子总碱灌注液较高。在经济效益方面，注射用氨苄西林钠在治疗期间频繁使用容易造成耐药性，导致再次治疗更加困难；苦豆子总碱灌注液作为纯天然药物，具有毒副作用小，不易产生抗药性等优点，能显著的节省成本，而且中药疗法注重调理，有利于机体整体机能和体况的恢复。因此苦豆子总碱灌注液治疗母猪子宫内膜炎、阴道炎具有广阔的发展前景。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。