用于梨树多倍体试管苗试管外嫁接成苗的方法

摘要

一种用于梨树多倍体试管苗试管外嫁接成苗的方法，其步骤是：把梨树多倍体试管苗在装有增殖培养基的培养瓶中进行继代增殖培养，得到高度在1.5cm以上的中间绿苗，再把中间绿苗在装有生根培养基的培养瓶中进行壮苗培养，得到梨树多倍体接穗苗；在装有营养土的盆中种植梨种子，得到茎为幼嫩或半木质化的砧木苗；在温室中把梨树多倍体接穗苗嫁接到砧木苗上，通过30天的培育，就得到用于种植在田间的梨树多倍体苗，由于设计了对梨树多倍体试管苗进行了先期培养，对砧木苗进行了田间种植培养，通过嫁接方式保持梨树多倍体苗的成活率，不再使用梨树多倍体试管苗直接生根培育，因此提高了梨树多倍体苗的田间成活率，加快了梨树的优化。

说明书

技术领域

本发明涉及一种试管外嫁接成苗的方法，尤其是一种用于梨树多倍体试管苗试管外嫁接成苗的方法。

背景技术

在实验室中通过人工诱变获得梨树多倍体，是获得梨树新品种和对梨树进行育种的重要方法，为了把实验室中的梨树多倍体试管苗成功移栽到田地，因此用于梨树多倍体试管苗试管外嫁接成苗的方法是一种重要的果树栽培方法，现还没有一种用于梨树多倍体试管苗试管外嫁接成苗的方法。

发明内容

为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种用于梨树多倍体试管苗试管外嫁接成苗的方法，因此提高了梨树多倍体苗的田间成活率，加快了梨树的优化。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：一种用于梨树多倍体试管苗试管外嫁接成苗的方法，其步骤是：把梨树多倍体试管苗在装有增殖培养基的培养瓶中进行继代增殖培养，得到高度在1.5 cm以上的中间绿苗，再把中间绿苗在装有生根培养基的培养瓶中进行壮苗培养，得到梨树多倍体接穗苗；在装有营养土的盆中种植梨种子，得到茎为幼嫩或半木质化的砧木苗；在温室中把梨树多倍体接穗苗嫁接到砧木苗上，通过30天的培育，就得到用于种植在田间的梨树多倍体苗。

由于设计了对梨树多倍体试管苗进行了先期培养，对砧木苗进行了田间种植培养，通过嫁接方式保持梨树多倍体苗的成活率，不再使用梨树多倍体试管苗直接生根培育，因此提高了梨树多倍体苗的田间成活率，加快了梨树的优化。

本发明设计了，增殖培养基设置为：QL基本培养基附加 0.5~1.2 mg/L 6-BA、0.1－0.5mg/L IBA和3%蔗糖，生根壮苗培养基设置为：1/2QL基本培养基附加0.3－0.5 mg/L IBA和2%蔗糖，营养土设置为包含有草炭：蛭石：珍珠岩=2.8-3.1：0.8-1.2：1。

本发明设计了，增殖培养基设置为：QL基本培养基附加 0.87 mg/L 6-BA、0.47mg/L IBA和3%蔗糖，生根壮苗培养基设置为：1/2QL即QL培养基的大量元素减半培养基为基本培养基附加0.32 mg/L IBA和2%蔗糖，营养土设置为包含有草炭：蛭石：珍珠岩=2.89： 1.15：1。

本发明设计了，一种用于梨树多倍体试管苗试管外嫁接成苗的方法，其步骤是：

一、接穗苗培养

1、在超净工作台上，把梨树多倍体试管苗从试管中取出，按试管苗切段和分株的方法转移到装有增殖培养基的培养瓶中进行继代增殖培养，每4~6周继代次，继代培养3~5次，得到高度在1.5 cm以上的中间绿苗；

2、在超净工作台上，把中间绿苗转移到装有生根培养基的培养瓶中进行壮苗培养，培养2~4周，得到中间壮苗，把中间壮苗放自然光下进行3~7天炼苗培养，得到梨树多倍体接穗苗。

二、砧木苗的培养

选择种仁饱满无病虫害的梨种子种植在装有营养土的盆中，在温室培养 成盆栽苗，待苗高生长至10 cm以上，茎为幼嫩或半木质化时，得到砧木苗。

三、嫁接

1、将砧木苗的顶端截掉，用手术刀片从茎的中间从上向下切一垂直切口，切口的长度比梨树多倍体接穗苗的契形面长0.1~0.5 cm；

2、在温室中，打开培养瓶，用镊子取出梨树多倍体接穗苗，将茎底部切平，将茎基部削成契形，切口长约1~2 cm，两个契面都要平，用右手将切好的砧木苗切口掰开，左手拿切好的梨树多倍体接穗苗，将契形部分沿砧木苗的切口向下插入，使梨树多倍体接穗苗契形的长面与砧木苗的形成层对齐，然后用预先剪好的parafilm膜进行绑缚。

四、培育

1、用喷水壶对刚接的接穗进行弥雾喷水，然后用透明塑料袋罩住单个嫁接苗盆，独立保湿，或把所有嫁接苗盆放入带有遮荫措施的塑料小拱棚内，群体保湿，每天喷水1次；

2、嫁接10天左右，接穗开始抽生新梢，以后每隔3－5天喷水1次，

3、嫁接20天左右，将拱棚两头逐渐打开进行通风，或在塑料袋顶端剪口；

4、嫁接30天左右，揭去棚上塑料膜或去掉盆上塑料袋，继续在盆中生长，或从盆中移出种植于大田。

本发明设计了，上述用于梨树多倍体试管苗试管外嫁接成苗的方法，在梨树多倍体试管苗到田间栽植的应用。

本发明设计了，应用在梨树六倍体的嵌合体试管苗在田间的栽植方法。。

在本技术方案中，为了克服梨树多倍体试管苗的生根难不利于在田间栽植的技术难题，设计了在增殖培养基和生根壮苗培养基进行木质培养和上述方法在梨树多倍体试管苗在田间栽植的应用的技术特征，在用于梨树多倍体试管苗试管外嫁接成苗的方法的技术领域中，具有新颖性、创造性和实用性。1/2QL是指QL培养基的大量元素减半的培养基。

附图说明

图1A 为本发明的二倍体试管苗试管外嫁接的刚嫁接时的试管苗状的图：

图1B 为本发明的二倍体试管苗试管外嫁接的嫁接10天后成活生长试管苗状的图：

图2A 为本发明的多倍体试管苗试管外嫁接的刚嫁接试管苗状的图：

图2B 为本发明的多倍体试管苗试管外嫁接的嫁接10天后成活生长试管苗状的图；

图3不同多倍体无性系试管苗试管外嫁接后在盆中的生长的图；

图4为本发明的不同多倍体无性系试管苗试管外嫁接后在田间生长的图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步描述，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。本发明的第一个实施例，其步骤是：

一、接穗苗培养

1、在超净工作台上，把梨树多倍体试管苗从试管中取出，按试管苗切段和分株的方法转移到装有增殖培养基的培养瓶中进行继代增殖培养，每4周继代1次，继代培养3次，得到高度在1.5 cm以上的中间绿苗；

2、在超净工作台上，把中间绿苗转移到装有生根培养基的培养瓶中进行壮苗培养，培养2周，得到中间壮苗，把中间壮苗放自然光下进行3天炼苗培养，得到梨树多倍体接穗苗。

二、砧木苗的培养

选择种仁饱满无病虫害的梨种子种植在装有营养土的盆中，在温室培养 成盆栽苗，待苗高生长至10 cm以上，茎为幼嫩或半木质化时，得到砧木苗。

三、嫁接

1、将砧木苗的顶端截掉，用手术刀片从茎的中间从上向下切一垂直切口，切口的长度比梨树多倍体接穗苗的契形面长0.1 cm；

2、在温室中，打开培养瓶，用镊子取出梨树多倍体接穗苗，将茎底部切平，将茎基部削成契形，切口长约1 cm，两个契面都要平，用右手将切好的砧木苗切口掰开，左手拿切好的梨树多倍体接穗苗，将契形部分沿砧木苗的切口向下插入，使梨树多倍体接穗苗契形的长面与砧木苗的形成层对齐，然后用预先剪好的parafilm膜进行绑缚。

四、培育

1、用喷水壶对刚接的接穗进行弥雾喷水，然后用透明塑料袋罩住单个嫁接苗盆，独立保湿，或把所有嫁接苗盆放入带有遮荫措施的塑料小拱棚内，群体保湿，每天喷水1次；

2、嫁接10天左右，接穗开始抽生新梢，以后每隔3天喷水1次，

3、嫁接20天左右，将拱棚两头逐渐打开进行通风，或在塑料袋顶端剪口；

4、嫁接30天左右，揭去棚上塑料膜或去掉盆上塑料袋，继续在盆中生长，或从盆中移出种植于大田。

在本实施例中，增殖培养基设置为：QL基本培养基附加 0.5 mg/L 6-BA、0.1mg/L IBA和3%蔗糖。生根壮苗培养基设置为：1/2QL即QL培养基的大量元素减半培养基为基本培养基附加0.3 mg/L IBA和2%蔗糖，营养土设置为包含有草炭：蛭石：珍珠岩=2.8：0.8：1。

在本实施例中，梨树多倍体试管苗设置为梨树三倍体试管苗。

在本实施例中， 在增殖培养基上获得足够数量的生长高度在1.5  cm以上的正常生长的绿苗，要求有一定的生长高度是转移到生根培养基上诱导生根的基础，因为在生根培养基上绿苗几乎不表现伸长生长。正常生长绿苗的获得是培养壮苗和试管外嫁接成活的保证。弱苗和非正常的玻璃化苗不能生根也不能嫁接成活。切取在增殖培养基上生长高度在 1.5 cm以上的正常生长的绿苗，转移到生根培养基上进行培养，目的是使绿苗生长的更健壮，如茎加粗，叶变大等。在生根培养基上培养2~4周后，将培养瓶置于自然散射光下炼苗3~7天。目的是提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能力，提高其从无菌环境的异养到有菌环境的自养的适应性。

在本实施例中，试管苗嫁接的具体操作步骤：在超净工作台上，按试管苗切段和分株的方法转移到增殖培养基上进行继代增殖培养，每4~6周继代1次。继代培养3~5次，把高度在1.5 cm以上的绿苗转移到生根培养基上进行壮苗培养，培养2~4周。把经过生根壮苗培养的培养瓶转到自然光下进行炼苗培养。

把经过炼苗的培养瓶运送到温室，在荫凉处用镊子从培养瓶中取出无根试管苗绿梢，切去绿梢底部愈伤或膨大部分，把底部切平，把绿梢基部削切成契形，切口长约1~2cm。切好的接穗放在用水饱和的吸水纸上。 把盆栽砧木苗搬到荫凉处，在茎幼嫩或半质化处把顶部截掉（截头），用手术刀片从茎的中间从上向下切一垂直切口，切口的长度应掌握在比接穗的契形面长0.1~0.5 cm。用右手将切好的砧木切口掰开，左手拿切好的接穗，将契形部分沿砧木的切口向下插入，使契形的长面与砧木的形成层对齐，然后用预先剪好的parafilm封口膜从下向上进行绑缚。 用喷水壶对刚接的接穗进行弥雾喷水，然后用透明塑料袋罩住单个嫁接苗盆，独立保湿，或把所有嫁接苗盆放入带有遮荫措施的塑料小拱棚内，群体保湿。每天喷水1次。嫁接10天左右，接穗开始抽生新梢，以后每隔3~5天喷水1次。嫁接20天左右，将拱棚两头逐渐打开进行通风，或在塑料袋顶端剪口。 嫁接30天左右，揭去棚上塑料膜或去掉盆上塑料袋。继续在盆中生长，或从盆中移出种植于大田。实现了从无根试管苗到有根植株试管外生长的成功转变。

    试管苗难生根和不能生根是组培快繁中的主要障碍。生根的失败给组培快繁造成巨大的经济损失。因此有效的生根是组培快繁中非常重要的一步。但是试管苗的生根特别是木本的果树不同品种间其生根能力差异很大，有的容易生根，有的很难生根。根据试管苗生根反应的不同，分为难生根的品种和易生根的品种。容易生根的品种利用常规的生根方法，如在培养基中添加适宜的生长素种类（IBA、IAA、NAA等）和浓度（生长素种类和浓度因不同品种而不同），并加适宜的光培养条件（光培养、暗培养一定时间后再转光下培养）（光培养条件因不同品种而异）就可获得很高的生根率。而难生根的品种，在所实验的任何条件下都很难生根或生根率很低，通常在20%以下。而当一个材料数量非常少而又非常宝贵时，组培快繁是快速获得足够数量的有效方法。组织培养也是利用现代生物技术育种手段进行植物品种改良的重要基础。因此组织培养的最终目的仍是把试管苗移出瓶外栽植于温室或大田。当前解决试管苗难生根的问题通常采用试管内微嫁接（吴彩红等，2006；郭启高和郭晋太，2004）或试管外生根方法。试管微嫁接的方法，是指在无菌条件下把不易生根的优良品种的试管苗嫁接在易生根砧木的试管苗上，得到试管内生根小植株。试管微嫁接的方法虽然可以得到有根的植株，但仍存在着：（1）无菌条件下操作难度大，嫁接速度慢；（2）嫁接成活低；（3）对接穗和砧木苗的要求要高，二者茎粗要相似；（4）生根植株移栽时仍然要经历从试管内的无菌环境到试管外的有菌环境的炼苗驯化，移栽成活需时较长等缺点。试管外生根的方法，是指将组织培养中茎芽的生根诱导同驯化培养结合在一起，直接将茎芽扦插到试管外的有菌环境中，边诱导生根边驯化培养。试管外生根把试管苗的生根阶段和驯化阶段结合起来，省去了用来提供营养物质并起支持作用的培养基，以及芽苗试管内生根的传统程序。这一试管外生根技术虽然具有简化组培程序，降低生产成本等的优点，但并不是所有物种都适宜利用这一技术，目前只在杨树、桦木等少数林木树种上能成功利用这一技术。花卉杜鹃的试管苗嫩茎的试管外生根效果也比较好。关于多年生木本的梨树试管苗试管外生根成功的研究尚未见报道。因此针对不同的难生根试管苗材料，应选择不同的生根方法。组培条件下，通过人工离体体细胞诱变获得的梨多倍体新种质，材料比较少，通过快繁获得一定数量后，需移出瓶外种植于田间才能评价其农艺学性状和经济学性状，确定其育种和生产利用价值。但在我们的研究中发现多倍体和二倍体试管苗的生根能力差异很大，二倍体生根较易，多倍体生根较难，有的多倍体无性系甚至不能生根。不能生根意味着该多倍体无性系不能移出瓶外，不能对其进行田间栽培性状的评价，那么人工诱变获得的新种质也无任何实践意义。因此如何把试管内不能生根的梨多倍体新材料移出瓶外获得田间植株是当前利用试管内诱变技术产生新种质急需解决的问题。因为获得的新种质能否成功移栽到田间，决定了人工离体诱变这一先进的生物技术育种方法在果树育种中的应用价值。因此迫切需要一个有效的方法，把已成功离体诱变获得的多倍体新种质从试管内移到试管外，不能使已成功获得的变异新种质夭折在生根这一阶段上。离体条件下，人工诱变获得的梨多倍体新种质，可为实现梨品种的更新和梨育种的可持续发展提供基因资源储备，对梨育种和生产都具有重要意义。研究发现，离体条件下，人工诱变获得的系列梨多倍体无性系中，多倍体的生根率低于其亲本二倍体，有的多倍体无性系甚至不能生根，造成其不能移栽成苗，只能在试管内保存，使获得的新种质无法进行田间栽培性状评价。采用试管内微嫁接方法，操作比较麻烦，而且多倍体的茎比二倍体的茎要粗，劈接困难，嫁接成活率低；采用试管外生根也无效。本专利的发明目的就是解决试管内不能生根或难生根梨树多倍体试管苗如何在试管外成苗的问题。使试管内获得的多倍体变异无性系转变成能在试管外成活并能在田间健康生长的植株。为田间选优提供试材。

本实施例的技术效果在于：是对那些难生根和根本不能生根的梨树多倍体新种质的试管苗，能成功实现试管外成株，嫁接成活率高，可用于和组织培养相结合进行新种质创制的研究，如离体诱变和转基因的研究，也可为其他不能生根试管苗提供参考。而试管内嫁接，操作麻烦，并且仍然要经历从试管内到试管外的炼苗和移栽过程，费时费工，使组培程序复杂化，不是解决试管苗生根难题的理想方法。本技术的另一个优点是操作简单，在试管外嫁接，把炼苗和成株结合起来，简化了组培程序，降低了成本。

本发明的第二个实施例，其步骤是：

一、接穗苗培养

1、在超净工作台上，把梨树多倍体试管苗从试管中取出，按试管苗切段和分株的方法转移到装有增殖培养基的培养瓶中进行继代增殖培养，每6周继代1次，继代培养5次，得到高度在1.5 cm以上的中间绿苗；

2、在超净工作台上，把中间绿苗转移到装有生根培养基的培养瓶中进行壮苗培养，培养4周，得到中间壮苗，把中间壮苗放自然光下进行7天炼苗培养，得到梨树多倍体接穗苗。

二、砧木苗的培养

选择种仁饱满无病虫害的梨种子种植在装有营养土的盆中，在温室培养 成盆栽苗，待苗高生长至10 cm以上，茎为幼嫩或半木质化时，得到砧木苗。

三、嫁接

1、将砧木苗的顶端截掉，用手术刀片从茎的中间从上向下切一垂直切口，切口的长度比梨树多倍体接穗苗的契形面长0.5 cm；

2、在温室中，打开培养瓶，用镊子取出梨树多倍体接穗苗，将茎底部切平，将茎基部削成契形，切口长约2 cm，两个契面都要平，用右手将切好的砧木苗切口掰开，左手拿切好的梨树多倍体接穗苗，将契形部分沿砧木苗的切口向下插入，使梨树多倍体接穗苗契形的长面与砧木苗的形成层对齐，然后用预先剪好的parafilm膜进行绑缚。

四、培育

1、用喷水壶对刚接的接穗进行弥雾喷水，然后用透明塑料袋罩住单个嫁接苗盆，独立保湿，或把所有嫁接苗盆放入带有遮荫措施的塑料小拱棚内，群体保湿，每天喷水1次；

2、嫁接10天左右，接穗开始抽生新梢，以后每隔5天喷水1次，

3、嫁接20天左右，将拱棚两头逐渐打开进行通风，或在塑料袋顶端剪口；

4、嫁接30天左右，揭去棚上塑料膜或去掉盆上塑料袋，继续在盆中生长，或从盆中移出种植于大田。

在本实施例中，增殖培养基设置为：QL基本培养基附加1.2 mg/L 6-BA、0.5mg/L IBA和3%蔗糖。生根壮苗培养基设置为：1/2QL即QL培养基的大量元素减半培养基为基本培养基附加0.5 mg/L IBA和2%蔗糖，营养土设置为包含有草炭：蛭石：珍珠岩=3.1： 1.2：1。

在本实施例中，梨树多倍体试管苗设置为梨树四倍体试管苗。

本发明的第三个实施例，其步骤是：

一、接穗苗培养

1、在超净工作台上，把梨树多倍体试管苗从试管中取出，按试管苗切段和分株的方法转移到装有增殖培养基的培养瓶中进行继代增殖培养，每5周继代1次，继代培养4次，得到高度在1.5 cm以上的中间绿苗；

2、在超净工作台上，把中间绿苗转移到装有生根培养基的培养瓶中进行壮苗培养，培养3周，得到中间壮苗，把中间壮苗放自然光下进行5天炼苗培养，得到梨树多倍体接穗苗。

二、砧木苗的培养

选择种仁饱满无病虫害的梨种子种植在装有营养土的盆中，在温室培养 成盆栽苗，待苗高生长至10 cm以上，茎为幼嫩或半木质化时，得到砧木苗。

三、嫁接

1、将砧木苗的顶端截掉，用手术刀片从茎的中间从上向下切一垂直切口，切口的长度比梨树多倍体接穗苗的契形面长0.3 cm；

2、在温室中，打开培养瓶，用镊子取出梨树多倍体接穗苗，将茎底部切平，将茎基部削成契形，切口长约1.5 cm，两个契面都要平，用右手将切好的砧木苗切口掰开，左手拿切好的梨树多倍体接穗苗，将契形部分沿砧木苗的切口向下插入，使梨树多倍体接穗苗契形的长面与砧木苗的形成层对齐，然后用预先剪好的parafilm膜进行绑缚。

四、培育

1、用喷水壶对刚接的接穗进行弥雾喷水，然后用透明塑料袋罩住单个嫁接苗盆，独立保湿，或把所有嫁接苗盆放入带有遮荫措施的塑料小拱棚内，群体保湿，每天喷水1次；

2、嫁接10天左右，接穗开始抽生新梢，以后每隔4天喷水1次，

3、嫁接20天左右，将拱棚两头逐渐打开进行通风，或在塑料袋顶端剪口；

4、嫁接30天左右，揭去棚上塑料膜或去掉盆上塑料袋，继续在盆中生长，或从盆中移出种植于大田。

在本实施例中，增殖培养基设置为：QL基本培养基附加 0.85 mg/L 6-BA、0.3mg/L IBA和3%蔗糖。生根壮苗培养基设置为：1/2QL即QL培养基的大量元素减半培养基为基本培养基附加0.4 mg/L IBA和2%蔗糖，营养土设置为包含有草炭：蛭石：珍珠岩=2.95： 1.0：1。

在本实施例中，梨树多倍体试管苗设置为梨树二倍体试管苗。

本发明的第四个实施例，在本实施例中，增殖培养基设置为：QL基本培养基附加 0.5 mg/L 6-BA、0.5mg/L IBA和3%蔗糖。生根壮苗培养基设置为：1/2QL即QL培养基的大量元素减半培养基为基本培养基附加0.5 mg/L IBA和2%蔗糖，营养土设置为包含有草炭：蛭石：珍珠岩=3.1：0.8：1。

在本实施例中，梨树多倍体试管苗设置为梨树四倍体的嵌合体及四倍体试管苗。

本发明的第五个实施例，

在本实施例中，增殖培养基设置为：QL基本培养基附加 0.87 mg/L 6-BA，0.47mg/L IBA和3%蔗糖。生根壮苗培养基设置为：1/2QL即QL培养基的大量元素减半培养基为基本培养基附加0.32 mg/L IBA和2%蔗糖，营养土设置为包含有草炭：蛭石：珍珠岩=2.89： 1.15：1。

在本实施例中，梨树多倍体试管苗设置为梨树六倍体的嵌合体试管苗。

通过对本实施例的八次并每次六个批次的试验，本实施例的梨树六倍体的嵌合体试管苗的成活率在98%以上。

本发明具有以下特点：

1、由于设计了对梨树多倍体试管苗进行了先期培养，对砧木苗进行了田间种植培养，通过嫁接方式保持梨树多倍体苗的成活率，不再使用梨树多倍体试管苗直接生根培育，因此提高了梨树多倍体苗的田间成活率，加快了梨树的优化。

2、由于设计了对梨树多倍体试管苗进行了先期培养,对梨树多倍体试管苗进行了第二次再培养，在增殖培养基和生根壮苗培养基作用下，进行木质转换，适合嫁接方法。

上述实施例只是本发明所提供的用于梨树多倍体试管苗试管外嫁接成苗的方法的一种实现形式，根据本发明所提供的方案的其他变形，增加或者减少其中的成份或步骤，或者将本发明用于其他的与本发明接近的技术领域，均属于本发明的保护范围。