应用盐酸小檗碱分子印迹色谱柱分离盐酸小檗碱的方法

摘要

本发明公开一种应用盐酸小檗碱分子印迹色谱柱分离盐酸小檗碱的方法，按照如下步骤进行：（1）制备样品溶液：取适量样品，用有机溶剂溶解，配制成每1L含盐酸小檗碱1.0×10

说明书

技术领域

本发明属于高效液相色谱法领域，特别是一种应用盐酸小檗碱分子印迹色谱柱分离盐酸小檗碱的方法。

背景技术

盐酸小檗碱，化学结构式：

，是天然药物黄连中主要成分小檗碱的盐酸盐，不仅具有清热燥湿、泻火解毒之功效，还有抗菌、降血糖、抗肿瘤和抗心律失常等药理活性，对肺结核、猩红热、急性扁桃腺炎和呼吸道感染也有一定疗效。

分子印迹技术是将被分离检测的物质作为模板分子，将其固定在高交联度的聚合物中，除去模板分子后，留下与模板分子立体构型互补的空间结构，对模板分子具有高度的特异识别能力。目前，分子印迹聚合物在色谱中对映体和异构体的分离、药物分析、传感器、模拟酶、固相萃取和催化剂等领域应用广泛。

液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术，是色谱法中最古老的一种，但通过改进填料的粒度及柱压，在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论，在技术上采用了高压输液泵，高效固定相和高灵敏度的检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化，这种色谱技术被称为高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，简称HPLC）。HPLC有以下特点：速度快—通常分析一个样品在15~30min，有些样品甚至在5min内即可完成从；分辨率高—可对差异性很小的物质对如手性物质进行分离分析；灵敏度高—紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg；柱子可反复使用，用一根色谱柱可分离不同的化合物；样品量少，容易回收；样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

目前，关于盐酸小檗碱高效液相色谱分离法的报道，我们查到如下一些文献：

1.申请号：200710017585.8，发明名称：一种治疗中老年眼部疾病中药制剂的质量检测方法，其中提到盐酸小檗碱含量测定，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以43∶57的乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相；检测波长为265nm；理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于2000；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。

2.李建勋，张亮，王淑珍.HPLC法同时测定三黄片中盐酸小檗碱与黄岑苷的含量.中国药师.2005，8（6）：479-480；采用高效液相色谱法，用C₁₈色谱柱（150mm×4.6mm，5μm），以甲醇-0.05mol·L^-1磷酸二氢钾溶液-冰乙酸（40∶60∶1）为流动相，流速为1.0ml·min^-1，检测波长333nm。

    关于应用盐酸小檗碱分子印迹色谱柱分离盐酸小檗碱，到目前为止未见报道。

发明内容

本发明的目的在于解决上述存在的问题，提供一种应用盐酸小檗碱分子印迹色谱柱分离盐酸小檗碱的方法，该方法灵敏度高、操作简单，不会对药物和保健品造成二次污染。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种应用盐酸小檗碱分子印迹色谱柱分离盐酸小檗碱的方法，按照如下步骤进行：

（1）制备样品溶液：取适量样品，用有机溶剂溶解，配制成每1L含盐酸小檗碱1.0×10^-5-3.0×10^-4mol的样品溶液；所述样品为盐酸小檗碱与盐酸川芎嗪或延胡索乙素其中一种的混合物；

（2）设定参数：将盐酸小檗碱分子印迹色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.1-1mL/min，检测波长345nm，柱温箱30±10℃；

（3）分离：启动进样阀使流动相将样品溶液带入盐酸小檗碱分子印迹色谱柱中，实现盐酸小檗碱的分离。

作为进一步的说明，以上所述盐酸小檗碱分子印迹色谱柱，其装填料为盐酸小檗碱分子印迹聚合物；所述盐酸小檗碱分子印迹聚合物为球形多孔材料，其粒径为50~180μm，平均孔径为2~100nm。

作为进一步的说明，以上所述盐酸小檗碱分子印迹色谱柱，柱径与柱高比值为1∶1-300，柱内管径在1-100mm，柱高10-300mm。

作为进一步的说明，以上所述盐酸小檗碱分子印迹色谱柱，柱管两端外侧设有内螺纹与管路相连，两端内侧有设筛板防止固体填料外漏，但可以使液体通过。

作为进一步的说明，以上所述有机溶剂为甲醇。

作为进一步的说明，以上所述流动相为乙酸-甲醇混合溶液，所述乙酸和甲醇的体积比为0.01-1∶100。

本发明所使用的盐酸小檗碱分子印迹聚合物，是通过如下方法制备的出来的：

(1)向溶剂中加入模板分子、功能单体、交联剂、溶剂、引发剂和致孔剂，每加入一种化学试剂超声波促溶5分钟，溶解完全后即为油相；向三口烧瓶中加入去离子水、分散剂，待分散剂完全溶解后即为水相；在搅拌下将油相缓慢加入水相中，通过悬浮聚合法制备得到分子印迹聚合物。

(2)步骤（1）中所述模板分子为盐酸小檗碱，功能单体为甲基丙烯酸，交联剂为复合交联剂由马来松香丙烯酸乙二醇酯（交联剂Ⅰ）和二甲基丙烯酸乙二醇酯（交联剂Ⅱ）组成，溶剂为乙酸乙酯，引发剂为偶氮二异丁腈，致孔剂为花生油，分散剂为十二烷基硫酸钠和聚乙烯醇；所述模板分子、功能单体、交联剂Ⅰ、交联剂Ⅱ、偶氮二异丁腈、花生油、乙酸乙酯的质量比为(0.034~3.4)︰(0.25~25)︰12︰(2.4~36)︰(0.1~0.7)︰(3~20)︰(20~100)，去离子水、十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇的质量比为100︰(0.022~0.11)︰(0.011~0.088)，油相和水相的质量比为1︰(2~9)，搅拌速度为200~600r/min，采用程序升温55~80℃反应20~90min，80~100℃反应60~180min，得到盐酸小檗碱分子印迹聚合物。

(3)步骤(2)所得的分子印迹聚合物，筛分后经乙酸-甲醇溶液（体积比3:1）洗脱，直到洗脱液经紫外检测不再含有盐酸小檗碱，再用水蒸气蒸馏法除去聚合物中乙酸、甲醇，得到分子印迹聚合物。非分子印迹聚合物的制备除了不加模板分子外，其他条件完全相同。

本发明制备出的盐酸小檗碱分子印迹聚合物，膨胀度小、比表面积大，可用于分离提取植物中的有效成分，并可在有机溶剂中使用，不会因膨胀而破坏分子印迹聚合物的网络结构，导致识别能力丧失。以盐酸小檗碱分子印迹聚合物为填料制备的盐酸小檗碱分子印迹色谱柱，因富含大小不一的孔结构，具有通透性好、背压低、高效和高通量等优点，在较高的流速和压力下，没有出现压塌的现象，可以在高流速下使用。并且，稳定性好，可重复使用，长时间使用后，色谱柱里的填料仍没有破坏、溶解。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：（1）本发明所使用的色谱柱，结合分子印迹技术，对目标分子盐酸小檗碱有特异识别能力，可以预测洗脱顺序；（2）松香基聚合物以天然产物松香的衍生物为原料，廉价易得，机械强度高，安全无毒；（3）HPLC灵敏度高，操作简单。

附图说明

图1为本发明实施例4对盐酸小檗碱（b）与盐酸川芎嗪（a）混合溶液的分析图；

图2为本发明实施例5对盐酸小檗碱（b）与盐酸川芎嗪（a）混合溶液的分析图；

图3为本发明实施例6对盐酸小檗碱（b）与延胡索乙素（c）混合溶液的分析图；

图4为本发明中流速—压力曲线表；

图5为本发明盐酸小檗碱分子印迹色谱柱结构示意图。

附图标记：

1-内螺纹，2-筛板，3-柱管，4-柱头。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。

实施例1：

（1）将0.034g盐酸小檗碱与0.25g甲基丙烯酸依次加入50mL烧杯中，待模板分子与盐酸小檗碱混合均匀后，再依次加入12g马来松香丙烯酸乙二醇酯与2.4g二甲基丙烯酸乙二醇酯、3g花生油、20g乙酸乙酯、0.01g偶氮二异丁腈，超声波促溶，形成均匀的油相。

向1000mL三口烧瓶中依次加入76g去离子水、0.0836g 十二烷基硫酸钠、0.0669g聚乙烯醇调节搅拌速度至600r/min，加热促使十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇完全溶解，待水相温度升至55℃后，将油相缓慢加入三口烧瓶中，预分散10min使油相在水相中形成均匀的小液滴，缓慢加热升温至85℃条件下自由基引发聚合1.5h。

（2）反应结束，将产物过筛，筛子的筛孔为60-120目，优选100目。筛分后经乙酸-甲醇溶液（体积比3:1）洗脱，直到洗脱液经紫外检测不再含有盐酸小檗碱，再用水蒸气蒸馏法除去聚合物中乙酸、甲醇，得到分子印迹聚合物。非分子印迹聚合物的制备除了不加模板分子外，其他条件完全相同。

 

实施例2

（1）将3.4g盐酸小檗碱与25g甲基丙烯酸按照500mL烧杯中，待模板分子与盐酸小檗碱混合均匀后，再依次加入12g马来松香丙烯酸乙二醇酯与36g二甲基丙烯酸乙二醇酯、20g花生油、100g乙酸乙酯、0.7g偶氮二异丁腈，超声波促溶，形成均匀的油相。

向3000mL三口烧瓶中依次加入1770g去离子水、0.3894g十二烷基硫酸钠、0.1947g 聚乙烯醇调节搅拌速度至200r/min，加热促使十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇完全溶解，待水相温度升至80℃后，将油相缓慢加入三口烧瓶中，预分散10min使油相在水相中形成均匀的小液滴，缓慢加热升温至95℃条件下自由基引发聚合4h。

（2）反应结束，将产物过筛，筛子的筛孔为60-120目，优选100目。筛分后经乙酸-甲醇溶液（体积比3:1）洗脱，直到洗脱液经紫外检测不再含有盐酸小檗碱，再用水蒸气蒸馏法除去聚合物中乙酸甲醇，得到分子印迹聚合物。非分子印迹聚合物的制备除了不加模板分子外，其他条件完全相同。

 

实施例3

（1）将0.7442g盐酸小檗碱与5g甲基丙烯酸加入150mL烧杯中，待模板分子与盐酸小檗碱混合均匀后，再依次加入30g马来松香丙烯酸乙二醇酯与10g二甲基丙烯酸乙二醇酯、20g花生油、120g乙酸乙酯、0.7875g 偶氮二异丁腈，超声波促溶，形成均匀的油相。

向2000mL三口烧瓶中依次加入600g去离子水、0.5325g 十二烷基硫酸钠、0.2663g 聚乙烯醇调节搅拌速度至500r/min，加热促使十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇完全溶解，待水相温度升至65℃后，将油相缓慢加入三口烧瓶中，预分散10min使油相在水相中形成均匀的小液滴，缓慢加热升温至85℃条件下自由基引发聚合3h。

（2）反应结束，将产物过筛，筛子的筛孔为60-120目，优选100目。筛分后经乙酸-甲醇溶液（体积比3:1）洗脱，直到洗脱液经紫外检测不再含有盐酸小檗碱，再用水蒸气蒸馏法除去聚合物中乙酸甲醇，得到分子印迹聚合物。非分子印迹聚合物的制备除了不加模板分子外，其他条件完全相同。

 

实施例4

将实施例1盐酸小檗碱分子印迹聚合物填装于色谱柱中，得到盐酸小檗碱分子印迹色谱柱。将所得分子印迹聚合物色谱柱用体积比为10%的乙酸-甲醇组成的混合溶液冲洗色谱柱至基线平衡即可进样。

一种应用盐酸小檗碱分子印迹色谱柱分离盐酸小檗碱的方法，按照如下步骤进行：

（1）制备样品溶液：取适量盐酸小檗碱、盐酸川芎嗪，用甲醇溶解，配制成每1L含盐酸小檗碱2.5×10^-5mol的盐酸小檗碱与盐酸川芎嗪混合溶液；同时，制备浓度均为2.5×10^-5mol/L的盐酸小檗碱甲醇溶液、盐酸川芎嗪甲醇溶液；分别进样； 

（2）设定参数：将盐酸小檗碱分子印迹色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为1mL/min，检测波长345nm和295nm，柱温箱20℃；

（3）分离：启动进样阀使体积比为0.01∶100的乙酸-甲醇混合溶液将样品溶液带入盐酸小檗碱分子印迹色谱柱中，进样量为20μL，实现盐酸小檗碱的分离，所得结果如图1所示，在保留时间8.62min时出现盐酸川芎嗪峰，在保留时间为39.81min时出现盐酸小檗碱峰，分离系数为18.17。

在本实施例中，盐酸小檗碱分子印迹色谱柱，，柱径与柱高比值为1∶1，其装填料为盐酸小檗碱分子印迹聚合物，盐酸小檗碱分子印迹聚合物为球形多孔材料，其粒径为50~150μm，平均孔径为2~80nm。盐酸小檗碱分子印迹色谱柱，柱管3两端外侧有内螺纹1与管路相连，两端内侧有筛板2。

实施例5

将实施例3盐酸小檗碱分子印迹聚合物填装于色谱柱中，得到盐酸小檗碱分子印迹色谱柱。将所得分子印迹聚合物色谱柱用体积比为5%的乙酸-甲醇组成的混合溶液冲洗色谱柱至基线平衡即可进样。

一种应用盐酸小檗碱分子印迹色谱柱分离盐酸小檗碱的方法，按照如下步骤进行：

（1）制备样品溶液：取适量盐酸小檗碱、盐酸川芎嗪，用甲醇溶解，配制成每1L含盐酸小檗碱3.0×10^-4mol的盐酸小檗碱与盐酸川芎嗪混合溶液；同时，制备浓度均为3.0×10^-4mol/L的盐酸小檗碱甲醇溶液、盐酸川芎嗪甲醇溶液；分别进样；

（2）设定参数：将盐酸小檗碱分子印迹色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.5mL/min，检测波长345nm和280nm，柱温箱40℃；

（3）分离：启动进样阀使体积比为0.5∶100的乙酸-甲醇混合溶液将样品溶液带入盐酸小檗碱分子印迹色谱柱中，进样量为20μL，实现盐酸小檗碱的分离，所得结果如图2所示，在保留时间9.10min时出现盐酸川芎嗪峰，在保留时间为20.95min时出现盐酸小檗碱峰，分离系数为8.56。

在本实施例中，盐酸小檗碱分子印迹色谱柱，柱径与柱高比值为1∶54，其装填料为盐酸小檗碱分子印迹聚合物，盐酸小檗碱分子印迹聚合物为球形多孔材料，其粒径80~150μm，平均孔径为20~60nm。盐酸小檗碱分子印迹色谱柱，柱管3两端外侧有内螺纹1与管路相连，两端内侧有筛板2。

 

实施例6

将实施例2盐酸小檗碱分子印迹聚合物填装于色谱柱中，得到盐酸小檗碱分子印迹色谱柱。将所得分子印迹聚合物色谱柱用体积比为5%的乙酸-甲醇组成的混合溶液冲洗色谱柱至基线平衡即可进样。

一种应用盐酸小檗碱分子印迹色谱柱分离盐酸小檗碱的方法，按照如下步骤进行：

（1）制备样品溶液：取适量盐酸小檗碱、延胡索乙素，用甲醇溶解，配制成每1L含盐酸小檗碱1.0×10^-5mol的盐酸小檗碱与延胡索乙素混合溶液；同时，制备浓度均为1.0×10^-5mol/L的盐酸小檗碱甲醇溶液、延胡索乙素甲醇溶液；分别进样； 

（2）设定参数：将盐酸小檗碱分子印迹色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.1mL/min，检测波长345nm和280nm，柱温箱30℃；

（3）分离：启动进样阀使体积比为1∶100的乙酸-甲醇混合溶液将样品溶液带入盐酸小檗碱分子印迹色谱柱中，进样量为20μL，实现盐酸小檗碱的分离，所得结果如图3所示，在保留时间34.70min时出现延胡索乙素峰，在保留时间为78.67min时出现盐酸小檗碱峰，分离系数为4.44。

在本实施例中，盐酸小檗碱分子印迹色谱柱，柱径与柱高比值为1∶300，其装填料为盐酸小檗碱分子印迹聚合物，盐酸小檗碱分子印迹聚合物为球形多孔材料，其粒径100~180μm，平均孔径为40~100nm。盐酸小檗碱分子印迹色谱柱，柱管3两端外侧有内螺纹1与管路相连，两端内侧有筛板2。