针对人抗苗勒管激素II型受体的新的突变型人源化12G4抗体及其片段

摘要

本发明涉及针对抗苗勒管激素II型受体的新的突变型人源化12G4抗体及其片段。

说明书

本发明涉及针对抗苗勒管激素II型受体的新的突变型人源化 12G4抗体及其片段。

卵巢癌是妇科癌症的主要原因并且是女性中癌症死亡率的第五大 原因，其三个组织学来源为下列：

■表面上皮（具有不同亚型的上皮性肿瘤），其占卵巢癌的 85-90%，

■生殖索/间质（粒层细胞瘤（全部卵巢癌的3%）），其占卵巢 肿瘤的大约10%，

■生殖细胞，其占卵巢癌的5%。

卵巢癌在初始阶段期间通常是无症状的，这使它得到“无声杀手” 的别名（La Marca A.,Volpe A.The Anti-Mullerian hormone and ovarian cancer.Human Reproduction Update,第13卷,第3期， 第265-273页,2007）。

存在有四个阶段和预后（FIGO分类：国际妇产科学联盟），对于 其来说，存活率自第二阶段开始大大地降低：

阶段I：局限于卵巢的肿瘤（5年存活率：90-70%），

阶段II：延伸至骨盆的在一个或两个卵巢中的肿瘤（5年存活率： 70-40%），

阶段III：延伸至骨盆外的在一个或两个卵巢中的肿瘤（5年存活 率：20%），

阶段IV：远程转移，不包括腹膜转移（5年存活率：<10%）， （Fauci,Braunwald等人,Principles of internal medicine. Harrison's第17版/National Cancer Institute cancer.gov /CNGOF（法国国家妇产科学学会））。

对于治疗卵巢癌所采用的主要策略是外科手术和化学疗法，特别 是作为第一线治疗，例如卡铂和紫杉醇的混合物。

最近还开发了单克隆抗体，例如西妥昔单抗，其针对表皮生长因 子受体（EGFR，Ozols R.F.等人,Focus on epithelial ovarian cancer, Cancer Cell.2004,Jan;5(1):19-24）。

其他单克隆抗体目前处于III期临床阶段，例如针对CA-125的阿 巴伏单抗（abagovomab）、针对血管内皮生长因子（VEGF-A）的阿瓦 斯丁或针对叶酸受体α（FRA）的法利珠单抗（farletuzumab）。

人抗苗勒管激素是具有560个氨基酸的糖蛋白，其为TGF-β家族 的成员。这是由胎儿睾丸的塞尔托利细胞所释放的激素，其引起苗勒 管的退化。

在成人中，它在塞尔托利细胞和莱迪希细胞（睾丸）以及粒层细 胞（卵巢）中表达。

它在成人卵巢的调节卵泡生成的活性中发挥作用。

抗苗勒管激素II型受体（AMHR-II）是具有573个氨基酸的肽， 并且具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性。

它牵涉与人的生殖系统的发育相关的苗勒管的退行。苗勒管在男 性中萎缩，在男性中它仅形成前列腺囊和睾丸附件；但苗勒管在女性 中持续存在，在女性中它作为输卵管、子宫和大部分阴道的起源。

该受体经常在人卵巢的肿瘤上皮细胞上表达。

国际申请WO2008/053330描述了用于治疗卵巢癌的针对AMHR-II 的鼠类12G4单克隆抗体。然而，本领域技术人员众所周知的是，给人 施用鼠类单克隆抗体引起免疫反应。

该国际申请还提到所述抗体可以是嵌合的或人源化的，但并没有 照那样的来描述它们。

然而，嵌合抗体也引发免疫反应，并且弱免疫原性的人源化抗体 具有这样的缺点，即具有可能降低的对于抗原的结合亲和力并因而是 活性较低的。

根据该申请，可能的是，通过存在于人源化抗体中的氨基酸的突 变来增加所述亲和力，这通过尤其是修饰人源化抗体的肽序列但同时 不妨碍亲水指数，即其疏水性和其电荷，例如通过下列氨基酸的置换： 精氨酸-赖氨酸置换或谷氨酸-天冬氨酸置换或丝氨酸-苏氨酸置换或 谷氨酰胺-天冬酰胺置换或缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸置换。

本发明的目标之一是提供突变型人源化12G4抗体，或所述抗体的 片段，其具有至少与相应的非突变型嵌合抗体相等的亲和力和对于受 体AMHR-II的特异性，并且不引发免疫反应。

本发明的另一个目标还在于提供产生特异于受体AMHR-II的所述 抗体的方法。

本发明的另一个目标涉及这些抗体作为用于治疗卵巢癌的药物的 用途。

本发明涉及人源化12G4单克隆抗体，其包含下列组分或由下列组 分构成：

a)轻链，其包含下列组分或由下列组分构成：

-可变区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:2（无前导序列）或 SEQ ID NO:4（具有前导序列）表示，和

-恒定区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:6或由与SEQ ID NO: 6具有至少80%的同源性的序列表示，

b)重链，其包含下列组分或由下列组分构成：

-可变区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:8（无前导序列）或 SEQ ID NO:10（具有前导序列）表示，和

-恒定区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:12或由与SEQ ID NO: 12具有至少80%的同源性的序列表示，

所述人源化12G4单克隆抗体是突变的，在轻链和/或重链中包含 至少一个突变，并且具有至少与嵌合12G4单克隆抗体相等的对于人抗 苗勒管激素II型受体（AMHRII）的K_D，所述嵌合12G4单克隆抗体包 含下列组分或由下列组分构成：

a)轻链，其由下列组分构成：

-可变区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:14（无前导序列）表 示，和

-恒定区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:6表示，

b)重链，其由下列组分构成：

-可变区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:18（无前导序列）或 SEQ ID NO:10（具有前导序列）表示，和

-恒定区，其氨基酸序列由SEQ ID NO:12表示， 对于所述受体，K_D优选地小于10^-7M，尤其是小于10^-8M，特别地 为10^-9M至10^-11M。

本发明的抗体还具有至少与鼠类12G4抗体的亲和力的三分之一 或一半相等的亲和力。

在整个说明书中，在序列编号后面的处于括号之中的表述“具有 前导序列”意味着所述序列包含信号肽或编码信号肽的序列，信号肽 即为决定蛋白质将被分泌的肽。

相反地，括号之中的表述“无前导序列”意味着所述序列不包含 信号肽或编码信号肽的序列。

本发明基于发明人所作出的这样的发现，即本发明的突变型人源 化12G4抗体，尽管在CDR（三个决定抗原识别的区域）（其亲水指数 并非不受妨碍）中，即在对于与抗原的亲和力和结合来说关键的并且 通常仅支持具有相同亲水指数的氨基酸的置换（例如精氨酸-赖氨酸、 谷氨酸-天冬氨酸、丝氨酸-苏氨酸、谷氨酰胺-天冬酰胺或缬氨酸-亮 氨酸-异亮氨酸）的区域中具有至少一个突变，但依然具有下列特性：

-它具有至少与相应的嵌合12G4抗体相似或甚至比相应的嵌合 12G4抗体小的对于受体AMHR-II的K_D（根据实施例1所测定的），并 因此具有比相应的嵌合12G4抗体大或与相应的嵌合12G4抗体相等的 亲和力，或者相比于现有技术的抗体或抗体片段而言，

-它具有对于受体AMHR-II的特异性，

-它不引发免疫反应或者引发比鼠类抗体更小的反应。

作为例子，实施例1呈现了用在CHO或YB2/0细胞中产生的本发 明的抗体所获得的K_D。

在整个说明书中，术语“12G4”和也使用的术语“LFB112”，是 指相同的事物并且表示相同的抗体。

所述抗体的亲和力可以通过本领域技术人员熟知的BIAcore测试 来测定。

在本发明中，术语“抗体”是指免疫球蛋白，即参与获得性免疫 应答的由4条链构成的多聚体蛋白质。

免疫球蛋白是本领域技术人员熟知的，并且由两个二聚体的装配 而构成，所述两个二聚体中的每一个由重链和轻链构成。该多聚体复 合物通过经由在两个半胱氨酸之间的二硫桥而造成的轻链与重链的连 接来装配，其中两条重链本身也过两个二硫桥彼此相连。

重链和轻链中的每一个由恒定区和可变区构成。构成抗体的链的 装配使得能够确定特征性的Y形三维结构，其中

-Y的基部相应于恒定区Fc，其被补体和Fc受体识别，和

-Y的臂的末端相应于各自的轻链可变区和重链可变区的装配。

更精确地，每个轻链由可变区（V_L）和恒定区（C_L）构成。每个重 链由可变区（V_H）和恒定区构成，所述恒定区由三个恒定结构域C_H1、 C_H2和C_H3构成。结构域C_H2和C_H3构成结构域Fc。

在图1中示意性地显示了抗体的结构。

轻链的可变区由三个决定抗原识别的区域（CDR）构成，所述三个 决定抗原识别的区域被四个构架结构域包围。可变区的三维折叠是这 样的，即从而将所述3个CDR暴露在蛋白质的相同侧并允许形成识别 确定抗原的特定结构。

在图2中显示了抗体的轻链或重链的可变区的“珍珠项链”状的 结构。

分离并纯化了在本发明中所描述的抗体，并且它们不同于天然抗 体，因为它们是人源化的。这些抗体是成熟的，即它们具有使其能够 识别抗原的特别的三维结构，并且具有所有的对于其抗原识别来说必 需的翻译后修饰，尤其是糖基化以及分子内和分子间二硫桥的形成。

它们为单克隆抗体，即它们仅识别受体AMHR-II中的单一的抗原 决定簇，这与多克隆抗体相反，多克隆抗体相应于抗体的混合物，并 因此可以识别同一蛋白质中的多个抗原决定簇。

在本发明中，“嵌合单克隆抗体”是指这样的分离的抗体，其中 构成所述抗体的每个轻链和/或每个重链的序列包含来自至少两种不 同动物（或人）的杂合序列或者由来自至少两种不同动物（或人）的 杂合序列构成。

特别地，嵌合12G4抗体是小鼠/人杂合体，这意味着轻链和重链 的序列的某区域来自小鼠免疫球蛋白12G4的序列，而所述重链和所述 轻链的序列的其余部分来自一个或任选地数个人免疫球蛋白的序列。

图18显示了使得能够产生嵌合12G4抗体的表达载体的图谱。

在本发明中，“人源化12G4单克隆抗体”是指这样的分离的抗体， 其中仅将12G4抗体（尤其是鼠类12G4抗体）的每个轻链和重链的CDR 嫁接在人抗体的轻链和重链中。

图19显示了使得能够产生人源化12G4抗体的表达载体的图谱。

在说明书的所有下面部分中，表述“嵌合12G4抗体”和“非突变 型嵌合12G4抗体”是指相同的抗体。

在本发明中，“突变型人源化12G4单克隆抗体”是指这样的人源 化12G4单克隆抗体，其中在轻链的可变区和/或轻链的恒定区和/或重 链的可变区或重链的恒定区中进行了至少一个突变。

因此，本发明的突变型人源化单克隆抗体的定义同时涵盖：

-突变型人源化抗体（尤其是如上面所定义的人/小鼠抗体）的前 体，和

-突变型人源化抗体，尤其是如上面所定义的人/小鼠抗体。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其在轻链可变区的至少一个CDR中包含至少一 个突变，并且具有至少与所述嵌合12G4单克隆抗体相等的对于所述受 体的亲和力。

在该实施方案中，当存在单一突变时，它位于CDR1或CDR2或CDR3 中。

当存在超过一个的突变时，第二个突变以及其他突变可以位于 CDR1和/或CDR2和/或CDR3和/或抗体的任何其他区域中。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其还在轻链（VL）的FR区中包含至少一个突 变。

在本发明中，发明人发现，当在人源化12G4抗体的CDR1或CDR2 或CDR3中进行至少一个突变且在轻链的可变区（特别是FR）中进行 至少一个突变时，并非必然不妨碍氨基酸的亲水指数的所述至少一个 突变仍然使得能够不仅保留该人源化抗体的活性，而且还获得突变型 人源化抗体，其具有至少与非突变型嵌合抗体相等的亲和力并且不引 起免疫反应或引起更小的免疫反应。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其在CDR1中包含至少一个突变和在轻链（VL） 的FR区中包含至少一个突变。

在本发明中，发明人发现，当在人源化12G4抗体的CDR1中进行 至少一个突变且在轻链的可变区（特别是FR）中进行至少一个突变时， 并非必然不妨碍氨基酸的亲水指数的所述至少一个突变仍然使得能够 不仅保留该人源化抗体的活性，而且还获得突变型人源化抗体，其具 有至少与非突变型嵌合抗体相等的亲和力并且不引起免疫反应。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其在CDR2中包含至少一个突变和在轻链（VL） 的FR区中包含至少一个突变。

在本发明中，发明人发现，当在人源化12G4抗体的CDR2中进行 至少一个突变且在轻链的可变区（特别是FR）中进行至少一个突变时， 并非必然不妨碍氨基酸的亲水指数的所述至少一个突变仍然使得能够 不仅保留该人源化抗体的活性，而且还获得突变型人源化抗体，其具 有至少与非突变型嵌合抗体相等的亲和力并且不引起免疫反应。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其在CDR3中包含至少一个突变和在轻链（VL） 的FR区中包含至少一个突变。

在本发明中，发明人发现，当在人源化12G4抗体的CDR3中进行 至少一个突变且在轻链的可变区（特别是FR）中进行至少一个突变时， 并非必然不妨碍氨基酸的亲水指数的所述至少一个突变仍然使得能够 不仅保留该人源化抗体的活性，而且还获得突变型人源化抗体，其具 有至少与非突变型嵌合抗体相等的亲和力并且不引起免疫反应。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其具有针对表达受体AMHR II的细胞（尤其是 Cov434、Asc1和META 2815）的ADCC，该ADCC尤其是大于所述非突 变型人源化12G4单克隆抗体的针对相同细胞的ADCC。

ADCC（抗体依赖性细胞毒性）是这样的一种机制，其中当抗体识 别抗原时，抗体的Fc部分被杀伤细胞的受体Fcγ所识别，所述杀伤细 胞在结合后能够杀死携带所述抗原的细胞。

在本发明中，发明人发现，当在人源化12G4抗体（其亲和力相对 于相应的嵌合或鼠类抗体而言特别地降低（实施例2））的一个或多 个CDR中进行至少一个突变时，并且尽管CDR相应于对于抗原识别来 说特别重要的区域，但所述至少一个突变使得能够不仅保留该人源化 抗体的活性，而且还获得突变型人源化抗体，其具有至少与非突变型 嵌合抗体相等的亲和力并且不引起免疫反应或引起更小的反应。

在本发明的背景下，所采用的编号方式基于ScFv片段的编号方 式，其中重链从1至115进行编号，而轻链从131至236进行编号， 如在图3A和3B中对于人源化12G4抗体所显示的，在其中画有线的灰 色珠相应于在所述序列中不存在的氨基酸。

两条链通过包含氨基酸116至130的连接体彼此相连。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其中所述在轻链可变区的至少一个CDR中的突 变之中的至少一个突变位于包括在轻链可变区的包含氨基酸179至氨 基酸184的区域中的CDR中，所述轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:2表示。

所述包含氨基酸179至氨基酸184的区域不相应于完整的CDR。

在该实施方案中，如果该抗体仅具有一个突变，那么它位于轻链 CDR的包含氨基酸179至氨基酸184的区域中。

当然，可以具有在其他CDR中的其他突变。

在本发明中，发明人发现，当在人源化12G4抗体的CDR的包含氨 基酸179至184的区域中进行至少一个突变时，所述至少一个突变使 得能够不仅保留该人源化抗体的活性，而且还获得突变型人源化抗体， 其具有至少与非突变型嵌合抗体相等的亲和力并且不引起免疫反应。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其中所述位于包括在包含氨基酸179至氨基酸 184的区域中的CDR中的突变之中的至少一个突变相应于至少一个下 列氨基酸的置换：S179P、E184K、E184G、E184D、S182F。

此处所使用的标注相应于本领域技术人员熟知的单字母密码。

例如，标注“S179P”意味着在位置179处的丝氨酸被脯氨酸置换。

在本发明中，发明人发现，当在人源化12G4抗体的CDR的包含氨 基酸179至184的区域中进行至少一个突变时，并非必然不妨碍被置 换的氨基酸的亲水指数的所述至少一个突变仍然使得能够不仅保留该 人源化抗体的活性，而且还获得突变型人源化抗体，其具有至少与非 突变型嵌合抗体相等的亲和力。

作为例子，图17显示了根据本发明的突变型人源化抗体与受体 AMHR-II的结合亲和力。抗体6B_78仅具有一个位于轻链可变区的CDR 中的突变（E184K），其中谷氨酸被赖氨酸替代，即酸性氨基酸被碱性 氨基酸酸替代，因此具有完全不同的电荷（因为是相反的），然而依 然具有活性，特别是比非突变型人源化12G4抗体明显更好的和与非突 变型嵌合12G4抗体相等的亲和力，并且不引起免疫反应。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其还在轻链（VL）的FR区中包含至少一个突 变。

在本发明中，发明人发现，当在人源化12G4抗体的CDR的包含氨 基酸179至184的区域中进行至少一个突变且在轻链的可变区（特别 是FR）中进行至少一个突变时，并非必然不妨碍氨基酸的亲水指数的 所述至少一个突变仍然使得能够不仅保留该人源化抗体的活性，而且 还获得突变型人源化抗体，其具有至少与非突变型嵌合抗体相等的亲 和力并且不引起免疫反应。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其还在重链中包含至少一个突变。

在本发明中，发明人发现，当在人源化12G4抗体的CDR的包含氨 基酸179至184的区域中进行至少一个突变，在轻链的可变区（特别 是FR）中进行至少一个突变，并且在重链中进行至少一个突变时，并 非必然不妨碍氨基酸的亲水指数的所述至少一个突变仍然使得能够不 仅保留该人源化抗体的活性，而且还获得突变型人源化抗体，其具有 至少与非突变型嵌合抗体相等的亲和力并且不引起免疫反应。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其中所述在轻链（VL）的FR区中的突变之中 的至少一个突变位于与包含氨基酸179至氨基酸184的区域相邻的FR 区中。

作为例子，图17以及表I和VII（通过ELISA测定的与靶标 AMHRII-Fc的结合）显示了根据本发明的突变型人源化抗体与受体 AMHR-II的结合亲和力。

因此，抗体3C_23具有三个突变：

-在轻链可变区的CDR中的突变（S179P），其中丝氨酸被脯氨酸 替代，即亲水氨基酸被疏水氨基酸替代，

-在轻链可变区（特别是FR）中的突变（I177T），即疏水氨基 酸被亲水氨基酸替代，它们此外还具有完全不同的亲水指数值，根据 国际申请WO2008/053330（对于异亮氨酸为+4.5，和对于苏氨酸为 -0.7），和

-在重链中的突变（Q3R），即谷氨酰胺被精氨酸替代，它们的亲 水指数值，根据国际申请WO2008/053330，从-3.5（对于谷氨酰胺） 变化至-4.5（对于精氨酸），

然而具有比非突变型人源化12G4抗体明显更好的和比非突变型 嵌合12G4抗体大的亲和力。

同样地，抗体3C_23K（其除了抗体3C_23的突变外，还具有在轻 链可变区的CDR中的第二个突变（E184K），其中谷氨酸被赖氨酸替代， 即酸性氨基酸被碱性氨基酸替代，因此具有完全不同的电荷，因为有 着相反的符号）然而依然具有活性，特别是比非突变型人源化12G4 抗体明显更好的和比非突变型嵌合12G4抗体大的亲和力，并且不引起 免疫反应。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其中所述在轻链（VL）的FR区中的突变之中 的至少一个突变相应于至少一个下列氨基酸的置换：I132T、A143T、 T150A、S158P、L175Q、I177T、Y178H、V187A、S192T、G197D、F212S。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其中所述在重链中的突变之中的至少一个突变 相应于至少一个下列氨基酸的置换：Q1E、Q3E、Q3R、Q6E、A9T、V11A、 K12R、K13R、K19E、V20A、A24G、A24V、A24T、Q39E、A40V、S31G、 L45P、D56N、A76T、A79T、R87G、T58A、Q62R、V67M、I70N、T74A、 S77P、A79T、S88P、E89D、F102S、A103T、L110P、S114T。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其具有选自下列的轻链和重链：

a)轻链，其包含可变区和恒定区或由可变区和恒定区构成，所述 可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:2表示，在该SEQ ID NO:2中进 行了至少一个下列位于CDR之一中的氨基酸置换：S179P、E184K、 E184G、E184D、S182F；并且所述恒定区的氨基酸序列由SEQ ID NO:6 表示；或

轻链，其包含可变区和恒定区或由可变区和恒定区构成，所述可 变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:2表示，在该SEQ ID NO:2中进行 了至少一个下列位于CDR之一中的氨基酸置换：S179P、E184K、E184G、 E184D、S182F，和进行了至少一个下列位于FR区中的氨基酸置换： I132T、A143T、T150A、S158P、L175Q、Y178H、V187A、S192T、G197D、 F212S；并且所述恒定区的氨基酸序列由SEQ ID NO:6表示，

b)重链，其氨基酸序列由SEQ ID NO:58表示，在该SEQ ID NO: 58中进行了至少一个下列氨基酸的置换：Q1E、Q3E、Q3R、Q6E、A9T、 V11A、K12R、K13R、K19E、V20A、A24G、A24V、A24T、Q39E、A40V、 S31G、L45P、D56N、A76T、A79T、R87G、T58A、Q62R、V67M、I70N、 T74A、S77P、A79T、S88P、E89D、F102S、A103T、L110P、S114T。

实施例3的表VII呈现了所获得的各种不同克隆和其置换。它还 显示，亲水指数随突变而显著地变化，但并不因此导致活性和/或亲和 力（对于抗原）的丧失，并且甚至对于某些克隆来说，使得能够获得 相对于相应的嵌合抗体而言的亲和力的增加（等于或大于1的“本发 明的Ab/嵌合抗体”的比率）。

在该实施方案中，可能的是，形成来自事先获得的两种抗体的组 合的抗体，并进一步增加对于受体AMHR-II的活性和亲和力，相对于 非突变型嵌合12G4抗体而言。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其具有选自下列的轻链和重链：

a)轻链，其包含可变区和恒定区或由可变区和恒定区构成，所述 可变区的氨基酸序列由下列表示：

-SEQ ID NO:22（无前导序列）或SEQ ID NO:24（具有前 导序列），或

-SEQ ID NO:30（无前导序列）或SEQ ID NO:32（具有前 导序列），或

-SEQ ID NO:34（无前导序列）或SEQ ID NO:36（具有前 导序列），或

-SEQ ID NO:46（无前导序列）或SEQ ID NO:48（具有前 导序列），

并且所述恒定区的氨基酸序列由SEQ ID NO:6表示，

b)重链，其包含可变区和恒定区或由可变区和恒定区构成，所述 可变区的氨基酸序列由下列表示：

-SEQ ID NO:38（无前导序列）或SEQ ID NO:40（具有前 导序列），

-SEQ ID NO:26（无前导序列）或SEQ ID NO:28（具有前 导序列），

-SEQ ID NO:8（无前导序列）或SEQ ID NO:10（具有前导 序列），

-SEQ ID NO:42（无前导序列）或SEQ ID NO:44（具有前 导序列），

-SEQ ID NO:50（无前导序列）或SEQ ID NO:52（具有前 导序列），

并且所述恒定区的氨基酸序列由SEQ ID NO:12表示。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的突变型人 源化12G4单克隆抗体，其具有：

a)轻链，其由下列所表示的氨基酸序列构成：

-SEQ ID NO:70（无前导序列）或SEQ ID NO:72（具有前 导序列），和

b)重链，其由下列所表示的氨基酸序列构成：

-SEQ ID NO:74（无前导序列）或SEQ ID NO:76（具有前 导序列）

（抗体3C_23），

或者

a)轻链，其由下列所表示的氨基酸序列构成：

-SEQ ID NO:78（无前导序列）或SEQ ID NO:80（具有前 导序列），和

b)重链，其由下列所表示的氨基酸序列构成：

-SEQ ID NO:58（无前导序列）或SEQ ID NO:60（具有前 导序列）

（抗体6B_78），

或者

a)轻链，其由下列所表示的氨基酸序列构成：

-SEQ ID NO:82（无前导序列）或SEQ ID NO:84（具有前 导序列），和

b)重链，其由下列所表示的氨基酸序列构成：

-SEQ ID NO:86（无前导序列）或SEQ ID NO:88（具有前 导序列）

（抗体3C_23K），

或者

a)轻链，其由下列所表示的氨基酸序列构成：

-SEQ ID NO:78（无前导序列）或SEQ ID NO:80（具有前导 序列），和

b)重链，其由下列所表示的氨基酸序列构成：

-SEQ ID NO:90（无前导序列）或SEQ ID NO:92（具有前 导序列）

（抗体4C_35），

或者

a)轻链，其由下列所表示的氨基酸序列构成：

-SEQ ID NO:94（无前导序列）或SEQ ID NO:96（具有前导

序列），和

b)重链，其由下列所表示的氨基酸序列构成：

-SEQ ID NO:98（无前导序列）或SEQ ID NO:100（具有前 导序列）

（抗体5B_42）。

根据另一个方面，本发明涉及如上面所定义的突变型人源化12G4 单克隆抗体的片段，其选自下列片段：Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、 scFv、sc(Fv)₂、“双抗体”。

根据另一个方面，本发明涉及核酸，其包含编码上面所定义的单 克隆抗体的轻链的序列或由编码上面所定义的单克隆抗体的轻链的序 列构成，和/或包含编码上面所定义的单克隆抗体的重链的序列或由编 码上面所定义的单克隆抗体的重链的序列构成。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及上面所定义的核酸，其中 所述编码轻链的序列包含下列序列或由下列序列构成：

a)编码由SEQ ID NO:53所表示的轻链的可变区的序列,在该序 列中进行了至少一个密码子的置换，其允许在CDR之一中一个或多个 下列氨基酸的置换：S179P、E184K、E184G、E184D、S182F，

或

b）编码由SEQ ID NO:53所表示的轻链的可变区的序列，在该序 列中：

-进行了密码子的至少一个置换，其允许在CDR之一中一个 或多个下列氨基酸的置换：S179P、E184K、E184G、E184D、 S182F，和

-进行了至少一个密码子的至少一个置换，其允许在FR之一 中一个或多个下列氨基酸的置换：I132T、A143T、T150A、 S158P、L175Q、Y178H、V187A、S192T、G197D、F212S， 和编码由SEQ ID NO:5所表示的恒定区的序列。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及上面所定义的核酸，其中 所述编码重链的序列包含下列序列或由下列序列构成：

a)SEQ ID NO:57，其中进行了至少一个密码子的置换，其允许 一个或多个下列氨基酸的置换：Q1E、Q3E、Q3R、Q6E、A9T、V11A、K12R、 K13R、K19E、V20A、A24G、A24V、A24T、Q39E、A40V、S31G、L45P、 D56N、A76T、A79T、R87G、T58A、Q62R、V67M、I70N、T74A、S77P、 A79T、S88P、E89D、F102S、A103T、L110P、S114T。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及上面所定义的核酸，其包 含上面所定义的轻链和上面所定义的重链。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及上面所定义的核酸，其中 所述编码轻链的序列包含选自下列的编码可变区的序列和编码恒定区 的序列或由选自下列的编码可变区的序列和编码恒定区的序列构成：

a)可变区：

-SEQ ID NO:21（无前导序列）或SEQ ID NO:23（具有前 导序列），或

-SEQ ID NO:29（无前导序列）或SEQ ID NO:31（具有前 导序列），或

-SEQ ID NO:33（无前导序列）或SEQ ID NO:35（具有前 导序列），或

-SEQ ID NO:45（无前导序列）或SEQ ID NO:47（具有前 导序列），

b)恒定区：

-SEQ ID NO:5。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及上面所定义的核酸，其中 所述编码重链的序列包含选自下列的编码可变区的序列和编码恒定区 的序列或由选自下列的编码可变区的序列和编码恒定区的序列构成：

a)可变区：

-SEQ ID NO:25（无前导序列）或SEQ ID NO:27（具有前 导序列），或

-SEQ ID NO:7（无前导序列）或SEQ ID NO:9（具有前导 序列），或

-SEQ ID NO:37（无前导序列）或SEQ ID NO:39（具有前 导序列），或

-SEQ ID NO:41（无前导序列）或SEQ ID NO:43（具有前 导序列），或

-SEQ ID NO:49（无前导序列）或SEQ ID NO:51（具有前 导序列），

b)恒定区：

-SEQ ID NO:11。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及上面所定义的核酸，其中 所述编码轻链的序列选自下列序列：

-SEQ ID NO:69（无前导序列）或SEQ ID NO:71（具有前导序 列），或

-SEQ ID NO:77（无前导序列）或SEQ ID NO:79（具有前导序 列），或

-SEQ ID NO:81（无前导序列）或SEQ ID NO:83（具有前导序 列），或

-SEQ ID NO:93（无前导序列）或SEQ ID NO:95（具有前导序 列），

并且，所述编码重链的序列选自下列序列：

-SEQ ID NO:73（无前导序列）或SEQ ID NO:75（具有前导序 列），或

-SEQ ID NO:57（无前导序列）或SEQ ID NO:59（具有前导序 列），或

-SEQ ID NO:85（无前导序列）或SEQ ID NO:87（具有前导序 列），或

-SEQ ID NO:89（无前导序列）或SEQ ID NO:91（具有前导序 列），或

-SEQ ID NO:97（无前导序列）或SEQ ID NO:99（具有前导序 列）。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及上面所定义的核酸，其中 所述编码轻链的序列和所述编码重链的序列为下列序列：

a)编码轻链的序列SEQ ID NO:69（无前导序列）或SEQ ID NO: 71（具有前导序列），和

b)编码重链的序列SEQ ID NO:73（无前导序列）或SEQ ID NO: 75（具有前导序列）

（抗体3C_23），

或者

a)编码轻链的序列SEQ ID NO:77（无前导序列）或SEQ ID NO: 79（具有前导序列），和

b)编码重链的序列SEQ ID NO:57（无前导序列）或SEQ ID NO: 59（具有前导序列）

（抗体6B_78），

或者

a)编码轻链的序列SEQ ID NO:81（无前导序列）或SEQ ID NO: 83（具有前导序列），和

b)编码重链的序列SEQ ID NO:85（无前导序列）或SEQ ID NO: 87（具有前导序列）

（抗体3C_23K），

或者

a)编码轻链的序列SEQ ID NO:77（无前导序列）或SEQ ID NO: 79（具有前导序列），和

b)编码重链的序列SEQ ID NO:89（无前导序列）或SEQ ID NO: 91（具有前导序列）

（抗体4C_35），

或者

a)编码轻链的序列SEQ ID NO:93（无前导序列）或SEQ ID NO: 95（具有前导序列），和

b)编码重链的序列SEQ ID NO:97（无前导序列）或SEQ ID NO: 99（具有前导序列）

（抗体5B_42）。

根据另一个方面，本发明涉及包含至少一个上面所定义的核酸的 表达载体，所述核酸处于允许其表达的元件的控制之下。

在本发明中，“表达载体”定义了这样的DNA分子，所述DNA分 子具有允许其在至少一种活生物体中进行复制（加倍）的元件。这些 允许复制的元件尤其为酵母或细菌的复制起点，或者病毒复制的控制 元件。

根据本发明的载体（vector）尤其为质粒、噬菌体、酵母人工染 色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）、复制型病毒的经修饰的基因 组或整合型病毒的经修饰的基因组，等等。

这些载体被称为“表达载体”，因为它们具有允许表达（即将它 们所控制的核苷酸序列转录成RNA）的核苷酸序列。

在本发明中，包含在所述载体中的所述核酸序列被置于“允许其 表达的元件的控制之下”。这意味着，所述表达载体具有至少一个转 录起始序列，例如病毒启动子，例如猿猴病毒SV40或巨细胞病毒（CMV） 的早期启动子或者劳斯肉瘤病毒（RSV）的启动子序列，尤其是包含 TATAA盒的序列或启动子。此外，所述载体还具有至少一个转录终止 序列，特别是来自哺乳动物（尤其是人）的基因的多腺苷酸化序列。

可以向这些对于包含在所述载体中的核苷酸序列的表达来说不可 缺少的序列增添其他使得能够调控或调节所述序列的表达的序列。一 个非穷尽的列表包括：哺乳动物（尤其是人）的基因的内含子，增强 子类型的转录调控序列，或者哺乳动物（尤其是人）的基因的转录但 非翻译的序列。

本发明的一个有利的实施方案涉及如上面所定义的表达载体，其 包含至少一个选自包含下列序列的核酸的核酸：SEQ ID NO:59、71、 75、79、83、87、91、95或99。

在另一个有利的实施方案中，本发明涉及如上面所定义的表达载 体，其包含

●第一核酸，其选自具有下列序列的核酸：SEQ ID NO:71、79、 83或95，所述第一核酸处于允许其表达的元件的控制之下，和

●第二核酸，其选自具有下列序列的核酸：SEQ ID NO:59、75、 87、91或99，所述第二核酸处于允许其表达的元件的控制之下。

因此，该表达载体包含上面提及的两个核酸序列，更特别地包含 编码上面所定义的单克隆抗体的轻链的核酸序列和编码上面所定义的 单克隆抗体的重链的核酸序列。

优选地，所述表达载体包含第一元件（其允许编码上面所定义的 单克隆抗体的轻链的核酸序列表达）和第二元件（其允许编码上面所 定义的单克隆抗体的重链的核酸序列表达），其中允许所述核酸序列 表达的所述第一元件和所述第二元件是相同的或不同的，优选地是相 同的。这些控制元件尤其为病毒RSV的长末端重复序列（LTR）。

本发明的另一个实施方案涉及上面所定义的表达载体，其包含至 少一个抗生素抗性基因。

在本发明中，“至少一个抗性基因”是指，所述表达载体可以包 含1个或2个或3个或4个或5个或6个抗生素抗性基因。

在本发明中，“抗生素抗性基因”定义了其表达产物发挥细胞的 抑制细胞效应（生长抑制）或溶细胞效应（细胞死亡）的基因。本发 明所涉及的抗生素尤其对于原核细胞具有效应，但也可以对于真核细 胞具有效应，不论其是酵母、植物、昆虫、两栖动物还是哺乳动物。

更特别地，上面提及的表达载体具有对于特异于原核细胞的抗生 素的抗性基因，和至少1个，优选地2个对于特异于真核细胞的抗生 素的抗性基因。

作为特异于原核细胞的抗生素，可以提及：氨苄青霉素、四环素 及其衍生物、潮霉素、卡那霉素，等等。作为特异于真核细胞的抗生 素，可以提及：G418、遗传霉素（G418的盐）、嘌呤霉素、氨甲蝶呤、 杀稻瘟素，等等。

将编码重链和轻链的目的转录单位（TU）以cDNA的形式且以受 RSV启动子支配的形式进行克隆。该启动子相应于在其5'区域中包含 增强子元件的劳斯肉瘤病毒的LTR（长末端重复序列）。

紧在启动子的3'处克隆人工内含子，其就可变剪接进行了优化并 且由在5'处的分离自人β-珠蛋白的供者序列和在3'处的源自免疫球 蛋白重链可变区基因的受者序列组成。目的TU以从人来源的生长激素 （hGH）（对于重链）和牛来源的生长激素（bGH）（对于轻链）的基 因得到的多腺苷酸化序列为终止。在polyA的选择中实现该来源差异， 以便限制目的基因之间的重组。选择了LTRRSV启动子、嵌合内含子、 cDNA和polyA序列这一联合，因为它赋予在YB2/0细胞系中的高的转 录和翻译活性。

除了目的TU外，所述表达载体还包含数个化学分子抗性TU：

Bla基因：该基因（在载体的限制性酶切图谱中被称为Amp）在细 菌（原核启动子）中表达β-内酰胺酶并赋予对于氨苄青霉素的抗性；

Neo基因：该基因在SV40启动子的控制之下编码酶npt II（新霉 素磷酸转移酶II），并且赋予经转染且表达该基因的哺乳动物细胞以 对于各种不同的抗生素例如新霉素、卡那霉素或G418的抗性；

Dhfr基因：该基因在SV40启动子的控制之下编码酶DHFR（二氢 叶酸还原酶），并且赋予对于氨甲蝶呤（MTX）的抗性。该方法可以用 于通过增加MTX的浓度来实现基因扩增，由此导致由经转染的细胞来 进行的抗体产生增加。

图18至22显示了用于产生克隆3C_23、6B_78、3C_23K、4C_35 和5B_42的表达载体的图谱。

在另一个方面，本发明涉及被上面所定义的核酸和/或上面所定义 的表达载体转化的宿主细胞或细胞系。特别地，所述细胞或细胞系的 特征在于：它

●具有低于25%的凋亡，

●在细胞分裂过程中是稳定的，和

●分泌至少14μg/ml的前面所定义的单克隆抗体。

细胞稳定性的概念意味着，由于来自包含至少一个载体的细胞的 所克隆出的细胞的克隆过程而产生的细胞能够在各种不同的分裂的过 程中保留其抗生素抗性特性并产生单克隆抗体，所述载体允许根据本 发明的单克隆抗体的表达。

在另外一个方面，本发明涉及药物组合物，尤其是疫苗组合物， 其至少包含：

●上面所定义的单克隆抗体，或

●上面所定义的核酸，或

●上面所定义的载体，或

●上面所定义的所述单克隆抗体的片段，

以及与之相联合的药学上可接受的媒介物（vehicle）。

有利地，本发明涉及药物组合物，尤其是疫苗组合物，其包含至 少一种上面所定义的单克隆抗体，以及与之相联合的药学上可接受的 媒介物。

活性物质的剂量特别地依赖于施用方式，并且由本领域技术人员 容易地确定。

“药学上可接受的媒介物”是指与生物系统（例如细胞、细胞培 养物、组织或生物体）相容的非毒性材料。

在数周或数月期间，在一个或多个每周一次施用中，治疗有效量 （单位剂量）可以从0.01mg/kg至500mg/kg，优选地从0.1mg/kg 至500mg/kg，优选地从0.1mg/kg至100mg/kg，优选地从0.1mg/kg 至20mg/kg，优选地从0.1mg/kg至10mg/kg，和更优选地从1mg/kg 至10mg/kg变化。

同样地，在数周或数月期间，在一个或多个每周一次施用中，治 疗有效量（单位剂量）可以从0.2mg/m²至10g/m²，优选地从0.2mg/m²至1g/m²，优选地从2mg/m²至1g/m²，优选地从20mg/m²至1g/m²， 和更优选地从20mg/m²至0.5g/m²变化。

本发明的药物组合物可以尤其通过静脉内途径（尤其是通过注射 或通过逐步灌注）、通过皮下途径、通过全身途径、通过借助于渗透 的局部途径、经口或通过借助于气雾剂的呼吸或肺途径来进行施用。

用于肠胃外施用的制剂可以包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮 液或乳液。非水性溶剂的例子为丙二醇、聚乙二醇、植物油（例如橄 榄油）或可注射的有机酯（例如油酸乙酯）。水性媒介物包括水、醇/ 水溶液、乳液或悬浮液。

本发明的药物组合物的有利的盖仑氏形式为通过口服途径可施用 的，并且包含：

●上面所定义的单克隆抗体，或

●上面所定义的核酸，或

●上面所定义的表达载体，或

●上面所定义的所述单克隆抗体的片段，

以及与之相联合的赋形剂，在推进剂存在或不存在下。

在本发明的一个实施方案中，所述气雾剂以包含所述突变型人源 化抗体和赋形剂的液体的形式存在。所述赋形剂最通常为醇类，但在 本发明的背景下可使用本领域技术人员已知的任何其他赋形剂。以液 体形式的气雾剂可以与推进气体（例如氯氟烃（CFC）或氢氟烃（HFA）） 相联合。

以液体形式的气雾剂还可以由脂质微颗粒和赋形剂构成。在该情 况下，所述赋形剂可以选自合成的二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、乳 糖或羟乙基淀粉（HES）。然后，借助于吹入器来施用所述微颗粒。

在本发明的另一个实施方案中，所述气雾剂以粉末的形式存在。 所述粉末由具有1至10μm，优选地小于9μm，或优选地小于5μm 的尺寸的颗粒组成。作为非限制性的例子，下面的方法可以用于获得 干燥的粉末：伴随冷冻干燥的喷雾，或超声结晶，定向沉淀。

气雾剂的施用将根据其以液体形式还是以固体形式存在而借助于 可以是气动的、超声的或具筛的喷雾器来施行，或者对于液体制剂， 借助于（具加压液体的、机械的、电流体动力学的、热的）计量气雾 剂来施行，或者对于固体制剂，借助于吸入器来施行（Reychler G., Dessanges JF和Vecellio L,Rev.Mal.Respir,2007;24: 1013-1023）。

根据另一个方面，本发明涉及产品，其包含：包含上面所定义的 单克隆抗体的第一药物制剂，和包含常规抗癌化合物（尤其是紫杉醇 或铂盐，特别是奥沙利铂、顺铂或卡铂）的第二药物制剂，以作为用 于在患有与人抗苗勒管激素II型受体相关的病理学状态的患者的治 疗中同时地、分开地或顺次地使用的联合制剂，所述与人抗苗勒管激 素II型受体相关的病理学状态尤其为：

卵巢癌，特别是转移性卵巢癌，浆液性癌，肾上腺样瘤、子宫内 膜样癌、胶样上皮癌，

前列腺癌，

生殖细胞癌，

子宫内膜癌，

子宫混合性苗勒恶性肿瘤，

平滑肌肉瘤，

子宫内膜间质肉瘤。

根据另一个方面，本发明涉及至少下列物质在制备用于治疗或预 防与人抗苗勒管激素II型受体相关的病理学状态的药物中的用途：

●上面所定义的单克隆抗体，或

●上面所定义的所述单克隆抗体的片段，或

●上面所定义的核酸，或

●上面所定义的载体，或

●上面所定义的细胞，

所述与人抗苗勒管激素II型受体相关的病理学状态尤其为：

卵巢癌，特别是转移性卵巢癌，浆液性癌，肾上腺样瘤、子宫内 膜样癌、胶样上皮癌，

前列腺癌，

生殖细胞癌，

子宫内膜癌，

子宫混合性苗勒恶性肿瘤，

平滑肌肉瘤，

子宫内膜间质肉瘤。

“治疗”是指医治其症状是可见的、发作的病理学状态的手段。 “预防”是指防止所述病理学状态发作的手段。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及上面所定义的抗体或上面 所定义的所述抗体的片段用于诊断和/或监测卵巢癌的用途。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及上面所定义的抗体或上面 所定义的所述抗体的片段的用途，其还包含常规抗癌药物，尤其是紫 杉醇或铂盐，特别是奥沙利铂、顺铂或卡铂。

根据另一个方面，本发明涉及：

●如上面所定义的单克隆抗体，或

●如上面所定义的所述单克隆抗体的片段，或

●如上面所定义的核酸，或

●如上面所定义的载体，或

●如上面所定义的细胞，

其用于其在治疗或预防与人抗苗勒管激素II型受体相关的病理 学状态中的应用，所述与人抗苗勒管激素II型受体相关的病理学状态 尤其为：

卵巢癌，特别是转移性卵巢癌，浆液性癌，肾上腺样瘤、子宫内 膜样癌、胶样上皮癌，

前列腺癌，

生殖细胞癌，

子宫内膜癌，

子宫混合性苗勒恶性肿瘤，

平滑肌肉瘤，

子宫内膜间质肉瘤。

在一个有利的实施方案中，上面所定义的单克隆抗体或上面所定 义的所述单克隆抗体的片段用于诊断和/或监测与人抗苗勒管激素II 型受体相关的癌症，所述与人抗苗勒管激素II型受体相关的癌症尤其 为：

卵巢癌，特别是转移性卵巢癌，浆液性癌，肾上腺样瘤、子宫内 膜样癌、胶样上皮癌，

前列腺癌，

生殖细胞癌，

子宫内膜癌，

子宫混合性苗勒恶性肿瘤，

平滑肌肉瘤，

子宫内膜间质肉瘤。

在一个有利的实施方案中，上面所定义的单克隆抗体，或上面所 定义的所述单克隆抗体的片段，或上面所定义的核酸，或上面所定义 的载体，或上面所定义的细胞还包含常规抗癌药物，尤其是紫杉醇或 铂盐，特别是奥沙利铂、顺铂或卡铂。

根据另一个方面，本发明涉及试剂盒，其至少包含：

●上面所定义的单克隆抗体，或

●上面所定义的所述单克隆抗体的片段，或

●上面所定义的核酸，或

●上面所定义的载体，或

●上面所定义的细胞，

该试剂盒用于在诊断与人抗苗勒管激素II型受体相关的病理学 状态，尤其是卵巢癌中的应用。

根据另一个方面，本发明涉及在人的生物学样品上诊断与人抗苗 勒管激素II型受体相关的病理学状态，尤其是卵巢癌的方法，其包括 下列步骤：

a.对事先从患者获取的活组织检查物进行标记，

b.测定人抗苗勒管激素II型受体的存在情况。

根据另一个方面，本发明涉及在人的生物学样品上诊断与人抗苗 勒管激素II型受体相关的病理学状态，尤其是卵巢癌的方法，其包括 下列步骤：

a.对患者实施活组织检查，

b.对活组织检查物进行标记，

c.测定人抗苗勒管激素II型受体的存在情况。

活组织检查物的标记根据本领域技术人员熟知的技术来进行。

所述受体的存在情况的测定可以通过本领域技术人员熟知的技术 （例如免疫测定法、结合测定法，等等）来进行。

活组织检查物的标记根据本领域技术人员熟知的技术来进行。

所述受体的存在情况的测定可以通过本领域技术人员熟知的技术 （例如免疫测定法、结合测定法，等等）来进行。

根据另一个方面，本发明涉及在人的生物学样品上治疗与人抗苗 勒管激素II型受体相关的病理学状态，尤其是卵巢癌的方法，其包括 下列步骤：

a.对患者实施活组织检查，

b.对活组织检查物进行标记，

c.测定人抗苗勒管激素II型受体的存在情况，

d.如果确定了人抗苗勒管激素II型受体的存在，则用下列物质 对患者进行治疗：

i.上面所定义的单克隆抗体，或

ii.上面所定义的所述单克隆抗体的片段，或

iii.上面所定义的核酸，或

iv.上面所定义的载体，或

v.上面所定义的细胞。

附图描述

图1相应于抗体的示意性图示。黑色部分相应于重链的恒定部分， 深灰色部分相应于轻链的恒定部分，浅灰色部分相应于重链的可变部 分，和白色部分相应于轻链的可变部分。-S-S-表示在两个半胱氨酸之 间建立的二硫桥。CDR区和构架区由箭头指示。还显示了Fab和Fc片 段。

图2相应于免疫球蛋白的轻链或重链的可变部分的氨基酸序列的 “珍珠项链”状示意性图示。黑色球相应于形成构架区的氨基酸，和 灰色球相应于表示CDR的氨基酸。

图3相应于人源化12G4抗体的重链的可变部分（图3A：氨基酸 1-115，SEQ ID NO:8）和轻链的可变部分（图3B：氨基酸131-236， SEQ ID NO:2）的氨基酸序列的“珍珠项链”状示意性图示，具有为 了确定突变位置而采用的编号。画有线的灰色珠相应于在所述序列中 不存在的氨基酸，其因此不计入编号。

图4相应于嵌合12G4抗体的重链（SEQ ID NO:66）的可变部分 的氨基酸序列的“珍珠项链”状示意性图示。

图5相应于嵌合12G4抗体的轻链（SEQ ID NO:62）的可变部分 的氨基酸序列的“珍珠项链”状示意性图示。

图6相应于非突变型人源化12G4抗体的重链（SEQ ID NO:58） 和突变型人源化12G4抗体的重链（6B_78；SEQ ID NO:58）的可变部 分的氨基酸序列的“珍珠项链”状示意性图示。

图7相应于非突变型人源化12G4抗体的轻链（SEQ ID NO:54） 的可变部分的氨基酸序列的“珍珠项链”状示意性图示。

图8相应于突变型人源化12G4抗体的重链（3C_23；SEQ ID NO:74） 的可变部分的氨基酸序列的“珍珠项链”状示意性图示。

图9相应于突变型人源化12G4抗体的轻链（3C_23；SEQ ID NO:70） 的可变部分的氨基酸序列的“珍珠项链”状示意性图示。

图10相应于突变型人源化12G4抗体的轻链（6B_78；SEQ ID NO: 78）的可变部分的氨基酸序列的“珍珠项链”状示意性图示。

图11相应于突变型人源化12G4抗体的重链（3C_23K；SEQ ID NO: 86）的可变部分的氨基酸序列的“珍珠项链”状示意性图示。

图12相应于突变型人源化12G4抗体的轻链（3C_23K；SEQ ID NO: 82）的可变部分的氨基酸序列的“珍珠项链”状示意性图示。

图13相应于突变型人源化12G4抗体的重链（4C_35；SEQ ID NO: 90）的可变部分的氨基酸序列的“珍珠项链”状示意性图示。

图14相应于突变型人源化12G4抗体的轻链（4C_35；SEQ ID NO: 78）的可变部分的氨基酸序列的“珍珠项链”状示意性图示。

图15相应于突变型人源化12G4抗体的重链（5B_42；SEQ ID NO: 98）的可变部分的氨基酸序列的“珍珠项链”状示意性图示。

图16相应于突变型人源化12G4抗体的轻链（5B_42；SEQ ID NO: 94）的可变部分的氨基酸序列的“珍珠项链”状示意性图示。

图17显示了用根据本发明的突变型抗体（Fab）所获得的在常规 ELISA测试中抗体与受体AMHR-II的结合亲和力的测定。

横坐标轴表示以μg/ml显示的（Fab）浓度，和纵坐标轴表示450 nm处的OD。

具有白色空心圆圈的点状曲线表示非突变型人源化12G4抗体的 结合。

具有黑色实心三角形的曲线表示在轻链可变区的CDR中具有突变 （E184K）的突变型人源化12G4抗体（抗体6B_78）的结合。

具有白色空心三角形的曲线表示在轻链可变区的CDR中具有突变 （S179P）、在轻链可变区的FR区中具有突变（I177T）且在重链可变 区中具有突变（Q3R）的突变型人源化12G4抗体（抗体3C_23）的结 合。

具有白色空心圆圈的曲线表示在轻链可变区的CDR中具有突变 （E184K）、在轻链可变区的CDR中具有突变（S179P）、在轻链可变 区的FR区中具有突变（I177T）且在重链可变区中具有突变（Q3R）的 突变型人源化12G4抗体（抗体3C_23K）的结合。

具有黑色实心圆圈的曲线表示非突变型嵌合12G4抗体的结合。

图18相应于用于包含重链和轻链的嵌合12G4抗体的克隆载体 H622-14的示意性图示，在所述重链中，AMHR-II VH前导序列与重链 可变区（AMHR-II VH）相融合，后者与人免疫球蛋白的恒定区（CH T125） 相融合，和在所述轻链中，AMHR-II VK前导序列与轻链可变区（AMHR-II VK）相融合，后者与人免疫球蛋白的恒定区（CK T125）相融合。

还显示了各种不同的调控元件（启动子、嵌合内含子、多腺苷酸 化位点，等等）以及抗生素抗性基因和复制起点。

图19相应于用于包含重链和轻链的非突变型人源化12G4抗体的 克隆载体H622-18的示意性图示，在所述重链中，人源化AMHR-II VH 前导序列与重链可变区（人源化AMHR-II VH）相融合，后者与人免疫 球蛋白的恒定区（CH T125）相融合，和在所述轻链中，AMHR-II VK 前导序列与轻链可变区（人源化AMHR-II VK）相融合，后者与人免疫 球蛋白的恒定区（CK T125）相融合。

还显示了各种不同的调控元件（启动子、嵌合内含子、多腺苷酸 化位点，等等）以及抗生素抗性基因和复制起点。

图20相应于用于包含重链和轻链的突变型人源化12G4抗体 3C_23的克隆载体H622-18MAO3C23的示意性图示，在所述重链中， 3C_23VH前导序列与重链可变区（3C_23VH）相融合，后者与人免疫 球蛋白的恒定区（CH T125）相融合，和在所述轻链中，3C_23VK前 导序列与轻链可变区（3C_23VK）相融合，后者与人免疫球蛋白的恒 定区（CK T125）相融合。

还显示了各种不同的调控元件（启动子、嵌合内含子、多腺苷酸 化位点，等等）以及抗生素抗性基因和复制起点。

图21相应于用于包含重链和轻链的突变型人源化12G4抗体 6B_78的克隆载体H622-18MAO6B_78的示意性图示，在所述重链中， 人源化AMHR-II VH前导序列与重链可变区（人源化AMHR-II VH）相 融合，后者与人免疫球蛋白的恒定区（CH T125）相融合，和在所述轻 链中，6B_78VK前导序列与轻链可变区（6B_78VK）相融合，后者与 人免疫球蛋白的恒定区（CK T125）相融合。

还显示了各种不同的调控元件（启动子、嵌合内含子、多腺苷酸 化位点，等等）以及抗生素抗性基因和复制起点。

图22相应于用于包含重链和轻链的突变型人源化12G4抗体 3C_23K的克隆载体H622-18MAO3C_23K的示意性图示，在所述重链 中，3C_23K VH前导序列与重链可变区（3C_23K VH）相融合，后者与 人免疫球蛋白的恒定区（CH T125）相融合，和在所述轻链中，3C_23K VK前导序列与轻链可变区（3C_23K VK）相融合，后者与人免疫球蛋 白的恒定区（CK T125）相融合。

还显示了各种不同的调控元件（启动子、嵌合内含子、多腺苷酸 化位点，等等）以及抗生素抗性基因和复制起点。

图23显示了构建scFv片段的示意性实验方案。

在VH的“2/3”区域下的黑色箭头指出了编码肽连接链的N-末端 2/3的序列。

在VL的“2/3”区域下的黑色箭头指出了编码肽连接链的C-末端 2/3的序列。

图24A和24B显示了将抗体mLFB112和huLFB112的轻链VL-CL 和重链VH-CH1的核苷酸序列亚克隆到表达载体pMG62-Fab中。

图24A：mLFB112

图24B：huLFB112。

图25显示了相比于非突变型人源化12G4抗体而言，本发明的人 源化抗-AMHRII抗体的ADCC活性。结果表示为随所添加的抗体的量 （ng/ml）（横坐标轴）而变化的ASC1细胞的裂解的百分比（纵坐标 轴）。平均值±SEM。

具有菱形的曲线表示抗-AMHRII抗体3C_23（R9013C_23），具有 尖端向上的三角形的曲线表示抗-AMHRII抗体6B_78（R9016B_78）, 具有尖端向下的三角形的曲线表示抗-AMHRII抗体3C_23K（R901 3C_23K）,具有圆圈的曲线表示非突变型人源化12G4抗-AMHRII抗体。

图26显示了用于产生cov434-AMHRII细胞系的质粒表达载体 pIRES-neo的图谱。

图27A和27B显示了在YB2/0细胞（图27A）和CHO细胞（图27B） 中产生的嵌合的和人源化的抗-AMHRII抗体对于COV434-AMHRII细胞 系的ADCC活性。

结果表示为随所添加的抗体的量（ng/ml）（横坐标轴）而变化的 COV434-AMHRII细胞的裂解的百分比（纵坐标轴）。3次测试的平均值 ±SEM。

图27A：具有菱形的曲线表示非突变型嵌合12G4抗-AMHRII抗体， 具有实心正方形的曲线表示抗-AMHRII抗体YB2/03C_23（R9013C_23）, 具有尖端向下的三角形的曲线表示抗-AMHRII抗体YB2/06B_78（R901 6B_78）,具有尖端向上的三角形的曲线表示抗-AMHRII抗体YB2/0 3C_23K（R9013C_23K），和具有空心长方形的曲线表示用作阴性对照 的抗-CD20抗体。

图27B：具有菱形的曲线表示非突变型嵌合12G4抗-AMHRII抗体， 具有尖端向上的三角形的曲线表示抗-AMHRII抗体CHO3C_23（R901 3C_23）,具有尖端向下的三角形的曲线表示抗-AMHRII抗体CHO3C_23K （R9013C_23K）,具有圆圈的曲线表示抗-AMHRII抗体CHO6B_78（R901 6B_78），和具有空心长方形的曲线表示用作阴性对照的抗-CD20抗体。

图28显示了在YB2/0和CHO细胞中产生的人源化抗-AMHRII抗体 对于Asc1细胞系的ADCC活性。结果表示为随所添加的抗体的量 （ng/ml）（横坐标轴）而变化的Asc1细胞的裂解的百分比（纵坐标 轴）。3次测试的平均值±SEM。

具有菱形的曲线表示抗-AMHRII抗体YB2/03C_23K，具有尖端向 上的三角形的曲线表示抗-AMHRII抗体CHO3C_23K。

图29显示了在YB2/0和CHO中产生的人源化抗-AMHRII抗体对于 META2815细胞系的ADCC活性。结果表示为随所添加的抗体的量 （ng/ml）（横坐标轴）而变化的META2815细胞的裂解的百分比（纵 坐标轴）。3次测试的平均值±SEM。

具有菱形的曲线表示抗-AMHRII抗体YB2/03C_23K，具有尖端向 上的三角形的曲线表示抗-AMHRII抗体CHO3C_23K，具有圆圈的曲线 表示用作阴性对照的抗-CD20抗体（抗-CD20A/R60309/045)。

图30显示了抗-AMHRII抗体3C_23K对于COV434-AMHRII细胞的 增殖的影响。100%的值相应于没有抗体时所观察到的COV434-AMHRII 细胞的增殖（3次测试的平均值±SD）。

从左至右，柱状图表示：

没有抗体的对照，抗-P24抗体，抗-AMHRII抗体YB2/03C_23K， 抗-AMHRII抗体CHO3C_23K，在交联剂（CK）存在下的抗-P24抗体， 在CK存在下的抗-AMHRII抗体YB2/03C_23K，在CK存在下的抗 -AMHRII抗体CHO3C_23K，1μg/ml的秋水仙素。

图31显示了抗-AMHRII抗体3C_23K对于META2815细胞的增殖 的影响。100%的值相应于没有抗体时所观察到的META2815细胞的增 殖（3次测试的平均值±SD）。

从左至右，柱状图表示：

没有抗体的对照，抗-P24抗体，抗-AMHRII抗体YB2/03C_23K， 抗-AMHRII抗体CHO3C_23K，仅交联剂，在交联剂（CK）存在下的抗 -P24抗体，在CK存在下的抗-AMHRII抗体YB2/03C_23K，在CK存在 下的抗-AMHRII抗体CHO3C_23K，1μg/ml的秋水仙素。

图32A和32B显示了在cov434-AMHRII模型中，在用3C23K-YB2/0 进行的治疗的影响下，肿瘤体积的变化（图32A）和存活曲线（图32B）， 所述治疗通过下述方式来进行：以10mg/kg/注射的剂量，以2-3天 的间隔，进行抗体的腹膜内注射，总共18次注射（黑色箭头）。

图32A：

纵坐标轴：肿瘤体积（mm³），

横坐标轴：肿瘤细胞注射后的天数，

具有菱形的曲线：媒介物，

具有长方形的曲线：抗-AMHRII抗体YB2/03C_23K。

图32B：

纵坐标轴：存活百分比，

横坐标轴：肿瘤细胞注射后的天数，

具有菱形的曲线：媒介物，

具有长方形的曲线：抗-AMHRII抗体YB2/03C_23K。

图33A和33B显示了在Asc1a5模型中，在用3C_23K-YB2/0进行 的治疗的影响下，肿瘤体积的变化（图33A）和存活曲线（图33B）， 所述治疗通过下述方式来进行：以10mg/kg/注射的剂量，以2-3天 的间隔，进行抗体的腹膜内注射，总共18次注射（黑色箭头）。

图33A：

纵坐标轴：肿瘤体积（mm³），

横坐标轴：肿瘤细胞注射后的天数，

具有菱形的曲线：媒介物，

具有长方形的曲线：抗-AMHRII抗体YB2/03C_23K。

图33B：

纵坐标轴：存活百分比，

横坐标轴：肿瘤细胞注射后的天数，

具有菱形的曲线：媒介物，

具有长方形的曲线：抗-AMHRII抗体YB2/03C_23K。

图34A和34B显示了在META2815模型中，在用3C_23K-YB2/0 进行的治疗的影响下，肿瘤体积的变化（图34A）和存活曲线（图34B）， 所述治疗通过下述方式来进行：以10mg/kg/注射的剂量，以2-3天 的间隔，进行抗体的腹膜内注射，总共18次注射（黑色箭头）。

图34A：

纵坐标轴：肿瘤体积（mm³），

横坐标轴：肿瘤细胞注射后的天数，

具有菱形的曲线：媒介物，

具有长方形的曲线：抗-AMHRII抗体YB2/03C_23K。

图34B：

纵坐标轴：存活百分比，

横坐标轴：肿瘤细胞注射后的天数，

具有菱形的曲线：媒介物，

具有长方形的曲线：抗-AMHRII抗体YB2/03C_23K。

实施例

实施例1：抗-AMHR-II抗体的亲和力的测定

在BIACore X100（BIACore,GE Heal thcare）上通过SPR（表面 等离子共振）技术来测定抗体对于其抗原即AMHR-II的亲和力。将以 具有Fc区的融合蛋白的形式进行表达的重组受体AMHR-II通过其胺官 能团与存在于CM5类型的传感器芯片表面上的以琥珀酰亚胺酯形式活 化的右旋糖酐的羧基基团之间的共价偶联来进行固定。以10μl/分钟 的流量用EDC/NHS混合物（0.1MN-羟基琥珀酰亚胺和0.1M3-(N，N- 二甲基氨基)丙基-N-乙基碳二亚胺）来活化传感器芯片的COOH基团7 分钟，然后将在乙酸钠缓冲液（10mM，pH4.0）中稀释至5μg/ml 的融合蛋白AMHR-II/Fc以5μl/分钟注射到传感器芯片的“道2”上 以达到300RU。通过在7分钟期间以10μl/分钟的流量注射乙醇胺 -HCl1M溶液（pH8.5）来使未与所述融合蛋白的胺反应的酯基团去 活化。像“道2”一样，对用作阴性对照的“道1”进行活化和去活化。

所有测量均在25℃下进行。将待分析的抗体在HBS-EP运行缓冲 液（BIACore,GE Healthcare）中稀释至6.25nM至3333nM的浓度， 并且在2分钟期间以30μl/分钟的流量注射到传感器芯片上。监测解 离步骤10分钟，然后通过在30秒期间以10μl/分钟注射甘氨酸缓冲 液（10mM，pH1.5）来使表面再生。

通过使用软件BIAevaluation3.1的1:2动力学模型来分析所获 得的传感图（sensorgram）。

结果

在CHO或YB2/0细胞中产生抗体（表I）

表I

在抗体6B_78和3C_23中引入的突变导致相对于嵌合抗体（12G4_ 嵌合的)而言2.3倍至2.6倍的对于抗原AMHR-II的亲和力的增加。

6B_78和3C_23这两种抗体的突变具有协同效应；将抗体6B_78 的突变引入到抗体3C_23中引起10倍的亲和力的增加。

实施例2：在cov434-AMHR-II细胞上嵌合的或人源化的鼠类12G4抗 体的亲和力的测定（序列表位肽：GGGGNLTQDRAQVEMQGSR（SEQ ID NO: 101），和GGGGNLTQARGQVEMQGSR（SEQ ID NO:102），对于阴性对照 肽）

  缔合常数 解离常数 平衡亲和常数 人源化12G4 1.83×10³M^-1.s^-19.62×10^-3s^-15.26×10^-6M 嵌合12G4 6.49×10³M^-1.s^-11.53×10^-3s^-12.35×10^-7M 鼠类12G4   1.47×10^-3s^-110^-7M的数量级

在人受体AMHR-II上测得的嵌合抗体的亲和力为大约10^-8M。

实施例3：突变型人源化12G4抗体的制备

鼠类抗体几乎等价于嵌合抗体并具有强的亲和力。

通过将鼠类12G4抗体（mLFB112）的高变环CDR嫁接到人性质的 蛋白质构架区上（“CDR嫁接”)来获得人源化12G4抗体（huLFB112）。

与鼠类抗体相比，人源化抗体具有不可忽略的亲和力丧失。

因此，最终的目标是增加人源化抗体的亲和力以便恢复鼠类抗体 的初始的结合特征。该优化将通过采用Millegen公司所拥有的 MutaGen技术施行分子进化循环来实现。

3.1.分子工具的构建和验证

3.1.1.scFv片段的构建

通过使用合适引物的PCR来扩增编码鼠类和人源化抗体的轻链可 变区（VL）和重链可变区（VH）的核苷酸序列。然后，将扩增出的序 列彼此相联合，以产生scFv类型的重组抗体片段。如此来进行数个构 建：VH-VL或VL-VH方向，以及采用两种不同的肽连接链（15或18 个氨基酸的肽连接链）。制备了总共8个构建物，其中4个关于鼠类 抗体和4个关于人源化抗体。scFv片段的构建的原理在下面举例说明 （流程I）。然后，将编码这些scFv的序列亚克隆到MilleGen的噬 菌粒表达载体（pMG58）中。该载体使得能够表达scFv类型的抗体片 段，并且将它们暴露在M13类型的噬菌体的表面上（噬菌体-scFv）。

通过DNA测序验证了鼠类和人源化抗体的VH和VL结构域的核苷 酸序列。

实验方案概括在图23中。

3.1.2.噬菌体表面上scFv的表达和通过ELISA的表征

所提供的靶标的量（80μg）不允许我们测试所制备的所有8个 构建物。以scFv形式表达的鼠类抗体mLFB112在本文件的下文中称为 mVH-VL，而人源化抗体huLFB112称为huVH-VL。

3.1.2.1.噬菌体-scFv的产生

将用载体pMG58转化的细菌XL1-Blue在30℃下进行培养直至 0.5-0.6的OD600nm，所述载体pMG58包含一方面编码scFv mVH-VL 和另一方面编码scFv huVH-VL的DNA。在添加IPTG并用辅助噬菌体 （M13KO7,New England Biolabs）感染所述细菌后，将培养物在26℃ 下培养过夜。次日，将噬菌体颗粒（噬菌体-scFv）回收在培养物上清 液中，借助于PEG/NaCl溶液进行沉淀，浓缩（100X），并进行定量。

在我们的情况下，对于所述两种scFv，获得了约计8×10¹¹个噬 菌体/ml的浓度。

3.1.2.2.ELISA-噬菌体测试

在噬菌体表面上产生的scFv mVH-VL和huVH-VL的功能性通过直 接ELISA测试来进行验证。

实验分案：

1）靶标的固定：100μl/孔的在1X PBS中稀释至5μg/ml的重 组靶标（即500ng/孔），在4℃下过夜。使用Nunc-Immuno Plate Maxisorp的微量滴定板，

2）饱和：200μl/孔的1X PBS-4%脱脂乳，在37℃下温育2小时，

3）结合：100μl/孔的在1X PBS-2%乳-0.05%Tween20中稀释的 鼠类和人源化的噬菌体-scFv的溶液（2倍稀释系列），在37℃下温 育2小时，

4）检测：100μl/孔的与过氧化物酶（1/10000稀释度，GE Healthcare）相偶联的抗-M13噬菌体抗体,在37℃下温育2小时，

5）揭示：100μl/孔的TMB，

6）中和：100μl/孔的H₂SO₄，

7）测量在450nm处的OD。

结果（表II）：

表II

Diff：特异性结合（具有包覆物和没有包覆物的孔之间的差异） 比率“mVH-VL/huVH-VL”用特异性结合的值（“Diff”）来进行计算

3.1.3.Fab片段的构建

将抗体mLFB112和huLFB112的轻链VL-CL和重链VH-CH1的核苷 酸序列亚克隆到表达载体pMG62-Fab中（图24A和24B）。

表达载体pMG62-Fab。

A）从在轻链上游的启动子pLac开始表达VL-CL和VH-CH1这两条 链，将重链VH-CH1与检测标签（肽V5）和用于通过IMAC进行纯化的 标签（6xHis）相融合。

B）轻链和重链中的每一个在启动子的支配之下。RBS：核糖体结 合位点。

3.2.分子工具的构建和验证

通过MutaGen^TM的库的构建

为该步骤所确定的目标是获得5×10⁶个变体（具有1-2个氨基酸 突变/scFv）的库。

通过MutaGen^TM技术，在人源化抗体huLFB112的VL和VH结构域 中引入突变。最后，获得了由大约5×10⁷个突变型克隆（具有1-5个 氨基酸突变/scFv）组成的大规模的库，即10倍于最初所预测的多样 性。

为此，根据不同的实验条件（由不同的核苷酸引物、所使用的变 位酶和复制次数所确定的条件U、M、US和UE）构建了数个亚库。这 些亚库的数目为4个，并且称为R20U、45M、R20US和R20UE。对于所 有这些亚库，实施了总共295个序列以便精确确定该诱变的不同特征。 下面的表III呈现了从测序分析获得的主要数据的概况。

表III.不同亚库的突变的分析

核苷酸序列的分析

氨基酸序列的分析

3.2.选择条件的确立

为了评价各种不同的选择策略，制备了鼠类和人源化的噬菌体 -scFv之间的人工混合物（1/200混合物，mLFB112/huLFB112）,目标 是模拟库的筛选。对于筛选的该模拟应当使得能够验证各种不同的其 目的在于快速地扩增该人工混合物中最具亲和力的克隆（即鼠类克隆 mLFB112，在该情况下）的选择条件。

所评价的各种不同的策略：

i）随着选择循环进行，使用恒定量的经固定的靶标（条件1），

ii）随着选择循环进行，减少经固定的靶标的量（条件2），

iii）“K_off”条件的测试：长的噬菌体-scFv与靶标的温育时间（条 件3）。

以3个选择循环来施行这些不同的条件。对于在每个选择循环后 所保留的克隆进行测序。结果显示在下面的表IV中。

表IV.三种筛选策略的评价

通过对这些结果进行核查可以看出，条件1（固定量的靶标）对 于扩增具有更好亲和力的克隆即mLFB112来说是最出色的（10个克隆 中9个克隆）。使用更少量的靶标（100ng/孔）看来是不太合适的； 在3个选择循环后10个克隆中仅3个克隆相应于具有更好亲和力的克 隆。对于基于长的培养时间的条件3（“k_off选择”）来说是同样的， 其不允许充分地扩增克隆mLFB112。此外，对于该最后一个条件，在3 个循环结束时回收的噬菌体的数目不太高（2×10⁴个噬菌体）。因此， 在我们看来，对于更多样化的克隆混合物（正如关于在该计划的背景 下所构建的库的情况）来说，采用条件2和3是不太明智的。

3.3.初步筛选（选择循环）

在确立了筛选条件之后，因此决定采用2种筛选条件：

条件A：1μg/孔的靶标，在4个选择循环期间；随后为2个循环， 用0.5μg/孔，

条件B：0.5μg/孔，在6个选择循环期间。

所获得的结果呈现在下面的表V中。

表V:选择循环的结果

在这些选择结束时，从第3个选择循环开始，对所获得的克隆进 行测序。将所获得的结果与对于起始库所获得的结果进行比较（表 VI）。

表VI:测序的结果

库：从R20U、45M、R20US、R20Ueta这4个库的混合物来源的起始库。

对于这些测序进行的分析揭示了丰余克隆的存在。总之，在所有 经测序的克隆之上，获得了113个独特的突变型克隆。

3.4.二次筛选（ELISA-噬菌体）

二次筛选在于独个地分析在初步筛选结束时选择出的克隆。为此， 将所述113个独特的突变型克隆移种到培养平板中（96孔-1.2ml）。

在产生噬菌体颗粒后，将包含噬菌体-scFv的培养物上清液用于 进行ELISA结合测试。以两个稀释度（包含scFv-噬菌体的上清液的 1/2和1/4）来评价突变型克隆的结合。在每个测试平板上，使用以 scFv-噬菌体形式构建的鼠类克隆（mLFB112）和人源化克隆（huLFB112） 作为参照。将每个突变型克隆测试至少2次。

结果表示为比率的形式，即突变型克隆与参照huLFB112和 mLFB112之间的结合差异（OD405nm）：

-相对于人源化scFv huLFB112的比率（比率，/huLFB112），

-相对于鼠类scFv mLFB112的比率（比率，/mLFB112）。

在所测试的113个克隆中，仅将最好的克隆呈现在下面。

下面的表VII呈现了所获得的各种不同克隆和存在于轻链和/或 重链中的突变（氨基酸的位置和置换），以及通过ELISA所测定的克 隆的结合亲和力。

在置换后面所指出的值相应于随不同置换而变化的亲水指数值的 改变。

结合亲和力值相应于本发明的抗体对于受体AMHR-II的结合亲和 力与非突变型人源化12G4抗体的结合亲和力或非突变型嵌合12G4抗 体的结合亲和力之比。

所给出的结合亲和力值是至少四个值的平均值的结果，并且括号 中的数字相应于标准偏差。

表VII显示，用所施行的置换，尽管它们导致亲水指数的重大变 化，但抗体对于受体的结合亲和力比非突变型人源化12G4抗体大很 多，并且至少与非突变型嵌合12G4抗体相等:大于或等于1的“本发 明的抗体/嵌合12G4”的比率。

突变型人源化抗体具有经恢复的甚至大于嵌合或鼠类抗体的亲和 力。

表VII

（Q1E、Q3E、Q6E、K19E、Q39E和Q62E：受抑制的TAG密码子，其在所使 用的大肠杆菌XL1-blue中被翻译成E）

NT：未测试

实施例4：呈现出亲和力改善的克隆的比较

通过用根据本发明的可溶性突变型抗体（Fab）在常规ELISA测试 中测定抗体与受体AMHR-II的结合亲和力，将阳性克隆3C_23K、3C_23 和6B_78彼此进行比较。

所获得的结果呈现在图17中。 实施例5：用AMHRII转染的细胞系cov434-AMHRII的建立

通过将表达编码AMHRII的cDNA的质粒转染到不表达AMHRII的粒 层细胞瘤细胞系cov434（van den Berg-Bakker,C.等人,1993. Establishment and characterization of 7 ovarian carcinoma cell lines and one granulosa tumour cell line:Growth features and cytogenetics.International Journal of Cancer53:613；Zhang, H.等人,2000.Characterization of an immortalized human granulosa cell line(COV434).Molecular Human Reproduction 6: 146）中来产生cov434-AMHRII细胞系。

简而言之，将AMHRII的cDNA克隆到商业质粒pIRES-neo （Clontech-Takara Bio Europe,France；参考号6060-1）中。由 于IRES序列，AMHRII和neo在同一个启动子CMV的控制之下进行表 达（图26）。

将该构建物稳定地转染到粒层细胞癌细胞系cov434中（转染试剂 Fugene,Roche）。然后，就受体AMHRII的表达，通过细胞计量术和 通过Western印迹来对所获得的转染子进行筛选。在进行亚克隆后， 保留包含pIRES-neo类型的载体的细胞克隆cov434-AMHRII-1F3以用 于体外和体内研究。该细胞系在下文中被称为为cov434-AMHRII。

实施例6：从患有卵巢上皮癌的患者的腹水或活组织检查物来建立原 代细胞系

建立源自腹水取样物的细胞系（Asc1细胞系）的主要步骤如下：

-J0：接受腹水并立即进行取样物的培养。将取样物以1000转/ 分钟离心5分钟，并将粒状沉淀物接纳在2mL的用于接种T25瓶的培 养基（RPMI10%FCS培养基）中。

-J2－J46：实施培养，其中进行定期的显微镜观察。在该时期期 间定期地添加新的培养基。还每2天进行PBS洗涤，以便去除污染性 的红细胞和成纤维细胞。

J13左右，所有污染性的细胞消失，并且观察到仍是异质的（两 种不同的类型）汇合细胞覆盖层。

-J46：移种：在J46，观察到同质的肿瘤细胞覆盖层，因而洗涤 细胞并通过刮取以重新接种在两个T75瓶中来进行移种。

-J61：通过FACS来评价AMHRII表达：在PBS洗涤后，用刮器使 细胞脱离，并通过流式细胞术来进行分析（标记mAb12G410μg/mL， 抗小鼠的AbII FITC）。在该阶段进行库的制备。将阳性AMHRII细胞 系继续培养10天以便证实受体AMHRII的表达。

-J71：通过FACS来证实AMHRII表达。

在RPMI10%FCS培养基中维持如此建立的细胞系，每周传代一次 （1/15稀释度）。

在活组织检查物的情况下（META2815细胞系），首先在裸鼠上 维持原发肿瘤（将取样物移植到肩胛间隙中，在小鼠上3次连续传代）， 然后取出肿瘤并且在接纳于培养基中之前撕碎。然后，应用与腹水取 样物相同的实验方案。

实施例7：各种不同的候选人源化抗体的亲和力的评价

该研究对于原始的鼠类12G4抗体以及对于在YB2/0中产生的候选 人源化抗体3C23、6B78和3C23K（分别具有序列3C_23、6B_78和 3C_23K）来进行。在cov434-AMHRII细胞上评价这些抗体的亲和力。

简而言之，通过向恒定数目的cov434-AMHRII细胞添加渐增剂量 的经放射性标记的抗体，根据饱和法来进行K_D的测定。在渐增剂量的 事先用碘125（¹²⁵I）标记的抗体存在下，将细胞（在50μl PBS/BSA0.5% 中的1×10⁶）在4℃下温育1小时（最终体积为150μl）。对于每种 抗体，从经标记的和未标记的抗体的溶液（84.4μg/ml）开始，在 PBS/BSA0.5%中进行4倍系列稀释。通过在100倍摩尔过量的未标记 的抗体存在下进行细胞的温育来评价非特异性结合。

在温育后，将样品在液氮中进行冷冻，然后在γ计数器中进行分 析。通过减去在过量的未标记的抗体存在下获得的结合来测定特异性 结合。

在软件PRISM上进行的Scatchard分析使得能够测定在表VIII 中所呈现的亲和力常数。

表VIII:抗-AMHRII抗体的解离常数（K_D）

  鼠类12G4 3C23 6B78 3C23K K_D(nM) 15.41+/-0.97 7.33+/-0.44 6.68+/-0.21 5.30+/-0.38

根据该研究，看起来相比于其他两种候选抗体6B78和3C23而言， 人源化抗-AMHRII抗体3C23K具有最好的亲和力（K_D=5.3nM）。抗 体3C23K还具有为原始的鼠类12G4抗体的亲和力（K_D=15.4nM）大 约三倍的亲和力。

实施例8：本发明的抗体的ADCC活性与非突变型人源化12G4抗体的 ADCC活性的比较

1.材料和方法

1.1.方法的原理

ADCC

来自患者的靶细胞ASC1是粘附性的，并且在测试前一天进行制 备。用胰蛋白酶使它们脱离，并且以6×10⁵个细胞/ml的浓度，按照 50μl/孔，在平底平板中在EMS+5%FCS中进行温育。将平板在37℃、 7%CO₂下温育过夜。

次日，细胞已粘附在孔底。吸出上清液，并添加每孔所需的缓冲 液体积以在NK和抗体存在下进行测试。

事先，从健康供者的外周血开始，通过由Miltenyi公司所开发的 负耗竭技术（Miltenyi Biotec-NK cell isolation kit human参 考号130-092-657）来纯化杀伤细胞（NK细胞）。ADCC技术在于，在 不同浓度的人源化抗-AMHRII抗体（0.005-5000ng/ml）存在下，以 10/1的E/T比例，将NK细胞与靶细胞ASC1一起进行温育。在4小时 的温育后，经由测定上清液中由被裂解的靶细胞所释放的称为乳酸脱 氢酶（LDH）的细胞内的酶的量，通过比色法来测量由抗-AMHRII抗体 诱导的细胞毒活性（Roche Diagnostics-Cytotoxicity Detection Kit LDH参考号11644793001）。

1.2.研究的要素

-抗-AMHRII抗体：

○829 10 054，人源化的YB2/0，R901  3C23K

○829 10 050，人源化的YB2/0，R901  3C23

○829 10 051，人源化的YB2/0，R901  6B78

○632 07 107，非突变型人源化抗-AMHRII 12G4

-ASC1细胞：培养物档案871 10 063。

结果呈现在图25中。

表IX呈现了与图25相应的原始数据。

表IX

表X呈现了用不同抗体获得的Emax和EC50。

表X

实施例9：本发明的抗体与嵌合12G4抗体的ADCC活性的比较

评价了候选人源化抗体3C_23K（具有序列3C_23K:突变VHQ3R的 ha12G4（SEQ ID NO:82（无前导序列）或SEQ ID NO:84（具有前导 序列））和VLI177T/S179P/E184K（SEQ ID NO:86（无前导序列）或 SEQ ID NO:88（具有前导序列））的ADCC活性。

简而言之，事先，从健康供者的外周血开始，通过由Miltenyi 公司所开发的负耗竭技术（Miltenyi Biotec-NK cell isolationkit human参考号130-092-657）来纯化效应细胞（NK杀伤细胞（天然杀 伤细胞）），并且这在通过Ficoll来纯化单核细胞的第一步骤之后。

ADCC活性的体外测试在于，在不同浓度的抗-AMHRII抗体（嵌合 抗体ch12G4、在YB2/0中产生的人源化抗体3C_23K-YB2/0和在CHO 中产生的3C_23K-CHO）存在下,将NK细胞与靶细胞（cov434-AMHRII、 Asc1和META2815细胞系）一起进行温育。所应用的“效应细胞/靶 细胞”比例为15/1。以0.005至5000ng/ml的浓度，将抗体在培养 基中进行稀释。

在4小时的温育后，经由测定上清液中由被裂解的靶细胞所释放 的称为乳酸脱氢酶（LDH）的细胞内的酶的量，通过比色法来测量由抗 -AMHRII抗体诱导的细胞毒活性（Roche Diagnostics-Cytotoxicity Detection Kit LDH参考号11644793001）。

根据下面的公式来计算裂解百分比：

%裂解=[(ER-SR)/(100-SR)]-[(NC-SR)/(100-SR)]

其中，

ER=在抗体和NK细胞存在下的LDH释放

SR=单独的靶细胞的自发的LDH释放

NC=在NK细胞存在和抗体不存在下的LDH释放。

将结果表示为随抗体的量而变化的裂解的百分比。

借助于软件PRISM来计算Emax和EC50值。

在cov434-AMHRII细胞系上获得的结果呈现在图27中。抗体 3C_23K-CHO的低的活性不允许在测试条件下获得平台。为了比较抗体 的效力，在该情况下进行了50%相对值的计算，其代表了为了达到嵌 合抗体（50%相对值=1）的平台的50%所需要的抗体3C_23K-CHO的 量。根据该评价，对于COV434-AMHRII细胞系具有最好的ADCC活性的 人源化抗体为在YB2/0中产生的抗体3C_23K（50%相对值：0.84）。 具有序列3C_23和6B_78的人源化抗体具有分别等于6.41和36.92 的50%相对值的值。

在Asc1细胞系上获得的结果呈现在图28中。抗体3C_23K-YB2/0 对于Asc1细胞具有依赖于剂量的细胞毒活性，其中所估计的EC50 为2.24ng/ml。抗体3C_23K-CHO的低的活性不允许在测试条件下获 得平台。为了比较这两种抗体的效力，在该情况下进行了50%相对值 的计算，其代表了为了达到抗体3C_23K-YB2/0（50%相对值=1）的 平台的50%所需要的抗体3C_23K-CHO的量。根据该评价，抗体 3C_23K-YB2/0的细胞毒活性为在CHO中产生的抗体的细胞毒活性（50% 相对值：39.4）的大约40倍。

类似地，在图29中所呈现的结果显示，抗体3C_23K-YB2/0和 3C_23K-CHO诱导META2815细胞的依赖于剂量的裂解。抗体 3C_23K-YB2/0的细胞毒活性（EC50=30.5ng/ml）为抗体3C_23K-CHO 的细胞毒活性（EC50=466.9ng/ml）的大约146倍。

所有这些结果表明，在YB2/0中产生的抗-AMHRII抗体3C_23K具 有诱导表达抗原AMHRII的细胞发生裂解的能力。在抗体抗 -AMHRII-YB2/0与抗体抗-AMHRII-CHO之间的EC50的差异暗示，在低 的抗原表达或低的抗体向肿瘤的穿透性的条件下，抗体抗 -AMHRI I-YB2/0具有特别的优势。

实施例10：细胞增殖的研究

通过测量在所测试的抗-AMHRII抗体存在或不存在下随时间进程 的细胞生长来证明细胞增殖的抑制。

简而言之，于在CHO或YB2/0中表达的抗-AMHRII抗体（10μg/ml） 存在下，并且具有或没有交联试剂，将靶细胞（cov434-AMHRII、Asc1、 META2815）在37℃下在P6平板中（1×10⁵个细胞/孔）培养72小时 （AffiniPure F(ab')2Fragment Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific参考号:109-006-008,Jackson Immunoresearch, France）。将细胞用胰蛋白酶处理5分钟，然后在CEDEX（基于细胞 生存力（锥虫蓝）的自动细胞计数器）中进行计数。在1μg/ml秋水 仙素（参考号:C3915,Sigma-Aldrich,France）存在下来建立增殖 抑制的阳性对照。在非相关的抗体（抗-P24）存在下来建立阴性对照。 在培养基（RPMI,10%FCS）中制备所有稀释物。结果表示为增殖百分 比，其中100%的值相应于在抗体不存在下观察到的细胞增殖。

用cov434-AMHRII细胞系获得的结果呈现在图30中。

根据这些观察结果，抗体3C_23K-YB2/0和3C_23K-CHO诱导 cov434-AMHRII细胞的大约40%的细胞增殖抑制，这在交联剂（CK）存 在下。在非相关的抗体（p24抗体）存在下未观察到该抑制细胞效应， 而阳性对照秋水仙素（10μg/ml）诱导了88%的抑制。

类似地，呈现在图31中的结果显示，抗体3C_23K-YB2/0和 3C_23K-CHO在交联剂（CK）存在下对于META2815细胞系诱导了大约 40%的细胞增殖抑制。

该细胞增殖抑制可能是在cov434-AMHRII和META2815细胞系上 由抗-AMHRII抗体诱导的细胞信号传导的结果。

实施例11：抗体3C_23K-YB2/0对于COV434-AMHRII肿瘤的体内效应

以在皮下（s.c.）注射COV434-AMHRII肿瘤细胞后对于雌性裸瑞 士小鼠的晚期治疗，评价了抗体3C_23K-YB2/0的抗肿瘤效力。以10 mg/kg/inj的剂量，以2-3天的间隔，进行抗体的腹膜内（i.p.）注 射（inj），总共18次注射。将用抗体3C_23K-YB2/0进行治疗的组与 用媒介物（PBS）进行治疗的组进行比较。

-材料和方法

使用了雌性裸瑞士小鼠（Harlan）。在实验的第0天，使小鼠接 受与基质胶（matrigel）相混合的7×10⁶个COV434-AMHRII肿瘤细胞 （比例1:1）的皮下注射。然后，从第16天（肿瘤体积为84-270mm³） 开始，通过以10mg/kg/inj腹膜内注射PBS或3C_23K-YB2/0来治疗 所述动物，3次注射/周，持续6周（总共18次注射）。

每周进行2至3次肿瘤体积的测量。通过使用下面的公式来计算 肿瘤体积（TV）：

TV（mm³）=（长度×宽度×高度)/2

其中，所述长度相应于肿瘤的最大直径，和所述宽度相应于肿瘤 的最小直径。

通过使用肿瘤体积的平均值（MTV）来绘制肿瘤生长曲线。当肿瘤 的个体体积达到2000mm³时，对动物实施安乐死。在每个组中，当该 组的30%的动物被实施了安乐死时，停止所述曲线。

如下来计算肿瘤生长的抑制（T/C），其被定义为治疗组的平均肿 瘤体积与用媒介物进行治疗的对照组的平均肿瘤体积之比：

T/C=（治疗组的平均TV/媒介物组的平均TV）×100

-大于42%的T/C，该产品被认为是无效的，

-42%至10%的T/C，该产品具有抗肿瘤效应，

-小于10%的T/C，该产品确实是有效的。

通过使用ANOVA比较（软件Statgraphics centurion XV），用 Kruskal-Wallis检验，获得了不同组之间的统计学差异。如果P<0.05， 则认为差异是显著的。还通过ANOVA（软件Statgraphics centurion XV）进行了时序（logrank）检验，其使得能够比较所述研究的存活参 数。如果P<0.05，则认为差异是显著的。

-结果

抗体3C_23K-YB2/0显示出抗肿瘤活性，因为在COV434-AMHRII 中观察到延缓（图32A和32B）。

一旦治疗开始，每个测量点处的肿瘤体积的统计学比较显示，抗 体3C_23K-YB2/0延缓了肿瘤生长（Kruskal-Wallis，通过ANOVA）。 也是一旦治疗开始，在用3C_23K-YB2/0进行治疗的组与用媒介物进行 治疗的组之间所计算出的“T/C”比率显示了在所有测量点处的显著差 异。时序检验也显示，在存活方面，用3C_23K-YB2/0进行治疗的组在 统计学上不同于用媒介物进行治疗的组。

下面的表XI呈现了在cov434-AMHRII模型中在用3C_23K-YB2/0 进行治疗的影响下肿瘤体积的变化（“治疗/对照”比率，以“%”表 示的T/C）。

表XI

测量日 15 21 25 30 32 T/C% 108 60 42 22 13

下面的表XII呈现了在cov434-AMHRII模型中获得的统计学分析。

表XII

实施例12：抗体3C_23K-YB2/0对于Asc1A5肿瘤的体内效应

以在皮下（s.c.）注射Asc1A5肿瘤细胞（原始的Asc1细胞系的 克隆）后对于雌性裸瑞士小鼠的晚期治疗，评价了抗体3C_23K-YB2/0 的抗肿瘤效力。以10mg/kg/inj的剂量，以2-3天的间隔，进行抗体 的腹膜内（i.p.）注射（inj），总共18次注射。将用抗体3C_23K-YB2/0 进行治疗的组与用媒介物（PBS）进行治疗的组进行比较。

-材料和方法

使用了雌性裸瑞士小鼠（Harlan）。在实验的第0天，使小鼠接 受与基质胶（matrigel）相混合的7×10⁶个Asc1A5肿瘤细胞（比例 1:1）的皮下注射。然后，从第12天（肿瘤体积为40-160mm³）开始， 通过以10mg/kg/inj腹膜内注射PBS或3C_23K-YB2/0来治疗所述动 物，3次注射/周，持续6周（总共18次注射）。

每周进行2至3次肿瘤体积的测量。通过使用下面的公式来计算 肿瘤体积（TV）：

TV（mm³）=（长度×宽度×高度)/2

其中，所述长度相应于肿瘤的最大直径，和所述宽度相应于肿瘤 的最小直径。

通过使用肿瘤体积的平均值（MTV）来绘制肿瘤生长曲线。当肿瘤 的个体体积达到2000mm³时，对动物实施安乐死。在每个组中，当该 组的30%的动物被实施了安乐死时，停止所述曲线。

如下来计算肿瘤生长的抑制（T/C），其被定义为治疗组的平均肿 瘤体积与用媒介物进行治疗的对照组的平均肿瘤体积之比：

T/C=（治疗组的平均TV/媒介物组的平均TV）×100

-大于42%的T/C，该产品被认为是无效的，

-42%至10%的T/C，该产品具有抗肿瘤效应，

-小于10%的T/C，该产品确实是有效的。

通过使用ANOVA比较（软件Statgraphics centurion XV），用 Kruskal-Wallis检验，获得了不同组之间的统计学差异。如果P<0.05， 则认为差异是显著的。还通过ANOVA（软件Statgraphics centurion XV）进行了时序（logrank）检验，其使得能够比较所述研究的存活参 数。如果P<0.05，则认为差异是显著的。

-结果

抗体3C_23K-YB2/0显示出抗肿瘤活性，因为在Asc1A5模型中， 与用媒介物进行治疗的组相比，在肿瘤生长中观察到延缓（图33A和 33B）。

一旦治疗开始，每个测量点处的肿瘤体积的统计学比较显示，抗 体3C_23K-YB2/0延缓了肿瘤生长（Kruskal-Wallis，通过ANOVA）。 也是一旦治疗开始，在用3C_23K-YB2/0进行治疗的组与用媒介物进行 治疗的组之间所计算出的“T/C”比率显示了在所有测量点处的显著差 异。时序检验也显示，在存活方面，用3C_23K-YB2/0进行治疗的组在 统计学上不同于用媒介物进行治疗的组。

下面的表XIII呈现了在Asc1a5模型中获得的在用3C_23K-YB2/0 进行治疗的影响下肿瘤体积的变化（“治疗/对照”比率，以“%”表 示的T/C）。

表XIII

测量日 12 17 24 27 31 35 T/C% 101 33 8 8 7 6

下面的表XIV呈现了在Asc1a5模型中获得的统计学分析。

表XIV

实施例13：抗体3C_23K-YB2/0对于Meta2815肿瘤的体内效应

以在皮下（s.c.）注射Meta2815肿瘤细胞后对于雌性裸瑞士小 鼠的晚期治疗，评价了抗体3C_23K-YB2/0的抗肿瘤效力。以10 mg/kg/inj的剂量，以2-3天的间隔，进行抗体的腹膜内（i.p.）注 射（inj），总共18次注射。将用抗体3C_23K-YB2/0进行治疗的组与 用媒介物（PBS）进行治疗的组进行比较。

-材料和方法

使用了雌性裸瑞士小鼠（Harlan）。在实验的第0天，使小鼠接 受8×10⁶个Meta2815肿瘤细胞的皮下注射。然后，从第33天（肿瘤 体积为45-240mm³）开始，通过以10mg/kg/inj腹膜内注射PBS或 3C_23K-YB2/0来治疗所述动物，3次注射/周，持续6周（总共18次 注射）。

每周进行2至3次肿瘤体积的测量。通过使用下面的公式来计算 肿瘤体积（TV）：

TV（mm³）=（长度×宽度×高度)/2

其中，所述长度相应于肿瘤的最大直径，和所述宽度相应于肿瘤 的最小直径。

通过使用肿瘤体积的平均值（MTV）来绘制肿瘤生长曲线。当肿瘤 的个体体积达到2000mm³时，对动物实施安乐死。在每个组中，当该 组的30%的动物被实施了安乐死时，停止所述曲线。

如下来计算肿瘤生长的抑制（T/C），其被定义为治疗组的平均肿 瘤体积与用媒介物进行治疗的对照组的平均肿瘤体积之比：

T/C=（治疗组的平均TV/媒介物组的平均TV）×100

-大于42%的T/C，该产品被认为是无效的，

-42%至10%的T/C，该产品具有抗肿瘤效应，

-小于10%的T/C，该产品确实是有效的。

通过使用ANOVA比较（软件Statgraphics centurion XV），用 Kruskal-Wallis检验，获得了不同组之间的统计学差异。如果P<0.05， 则认为差异是显著的。还通过ANOVA（软件Statgraphics centurion XV）进行了时序（logrank）检验，其使得能够比较所述研究的存活参 数。如果P<0.05，则认为差异是显著的。

-结果

抗体3C_23K-YB2/0显示出抗肿瘤活性，因为在Meta2815模型中， 与用媒介物进行治疗的组相比，在肿瘤生长中观察到延缓（图34A和 34B）。

一旦治疗开始，每个测量点处的肿瘤体积的统计学比较显示，抗 体3C_23K-YB2/0延缓了肿瘤生长（Kruskal-Wallis，通过ANOVA）。 也是一旦治疗开始，在用3C_23K-YB2/0进行治疗的组与用媒介物进行 治疗的组之间所计算出的“T/C”比率显示了在所有测量点处的显著差 异。时序检验也显示，在存活方面，用3C_23K-YB2/0进行治疗的组在 统计学上不同于用媒介物进行治疗的组。

下面的表XV呈现了在META2815模型中在用3C_23K-YB2/0进行 治疗的影响下肿瘤体积的变化（“治疗/对照”比率，以“%”表示的 T/C）。

表XV

测量日 33 38 42 47 52 T/C% 92 38 26 22 21

表XVI呈现了在META2815模型中获得的统计学分析。

表XVI