区分螺旋藻品系生产性状优劣度的方法

摘要

本发明涉及螺旋藻开发应用技术，旨在提供一种区分螺旋藻品系生产性状优劣度的方法。该方法是用Tris-HCl提取液提取得到螺旋藻细胞的水溶性蛋白，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白样品分离后，检测蛋白质电泳图谱102kD处蛋白带的光密度值，并根据其值构建藻株间的聚类图；若候选品系在102kD处蛋白带的光密度值大于140，且与已知生产性状好的品系聚到一起，则说明该品系生产性状好，适用于大规模培植生产；若在102kD处蛋白带的光密度值小于40，且与已知生产性状不好的品系聚到一起，则说明该品系生产性状差，不适用于大规模培植生产。本发明简单、高效、可靠、成本低，不用进行核酸测序与生物信息学比对等复杂试验和分析，因而适合大规模、高通量筛选。

说明书

技术领域

本发明属于螺旋藻开发应用的技术，特别涉及一种区分螺旋藻品系生 产性状优劣度的方法。

背景技术

螺旋藻（Spirulina），是一种光合放氧、呈规则螺旋的原核丝状微藻 ，系蓝藻门（Cyanophyta）、颤藻目（Oscillatoriales）、颤藻科（ Oscillatoriaceae）的一个属[武汉植物学研究, 1997, 15(4): 3 69-374]。因富含优质蛋白和多种生物活性物质而受到国内外的极大关 注，并已在大量研究的基础上形成了庞大的螺旋藻产业，成为目前全 球研究开发规模最大、应用前景最广泛的经济微藻。值得指出的是， 众多的实验研究与长期的生产实践表明：螺旋藻不同品种（系），对 温度、光质、光照强度以及培养液的盐度、pH和营养成分等环境因子 的要求与适应性存在显著差异，由此产生的经济效益也相差甚远[水生 生物学报, 1999, 23(1): 59-64]。所以，与其它农业与生物技术 产业一样，选育品性兼优的品种（系）是有效提升当前螺旋藻产业经 济效益、切实解决生产实际问题的最直接而重要的途径之一。

目前国内外筛选适合大规模生产螺旋藻品种（系）的常规方法如下： 1、对新分离到的品种（系）进行编号；2、在实验室条件下做多种环 境因子的交叉组合培养试验，并根据所测定的生长曲线、光合放氧和 生化组成等指标进行初步筛选；3、对实验室初筛到有生产养殖潜力的 候选品种（系）在不同季节、气候及营养条件下进行养殖小试、中试 与生产性试验，再筛选出目标品种（系）。这一方法虽然实用、有效 ，但程序繁琐、工作量大、周期长，且成本高。因此，迫切需要建立 一种简单、高效、低成本的评价与筛选方法，以满足当前国内外螺旋 藻产业不断发展的实际需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种简单 、高效、低成本的区分螺旋藻品系生产性状优劣度的方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种区分螺旋藻品系生产性状优劣度的方法，包括以下步骤：

用Tris-HCl提取液提取得到螺旋藻细胞的水溶性蛋白，经十二烷基磺 酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)对蛋白样品分离后，利用Quan tity One分析软件检测蛋白质电泳图谱102kD处蛋白带的光密度值， 并根据其值构建藻株间的聚类图；若候选品系的蛋白质电泳图谱在10 2kD处蛋白带的光密度值大于140，且与已知生产性状好的品系聚到一 起，则说明该品系生产性状好，适用于大规模培植生产；若在102kD处 蛋白带的光密度值小于40，且与已知生产性状不好的品系聚到一起， 则说明该品系生产性状差，不适用于大规模培植生产。

本发明具体包括下述步骤：

1、选用9株螺旋藻品系作为样本，包括4株生产性状好的品系：Sp-4、 Sp-5、Sp-15和Sp-17；5株生产性状不好的品系：Sp-1、Sp-2、Sp-6、 Sp-9和Sp-10；

2、试剂和仪器

蛋白质分子量标准购自GE Healthcare Biosciences（美国）；丙烯 酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS）、过硫 酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）等购自Amresco（美国）。所用 的垂直电泳系统和紫外-可见扫描分光光度计等为Amersham Pharmci a Biotech（美国）产品；冷冻干燥仪为VirTis（美国）产品；扫描 仪GS-800 和Quantity One分析软件等为Bio-Rad（美国）产品；

3、水溶性蛋白的制备

取0.75g钝顶螺旋藻藻泥于5ml离心管中，加入3ml Tris-HCl提取液（ 125mM Tris-HCI，0.9% NaCl，pH 6.8），在-20℃冷冻1.5h后再在 4℃融化2h，如此反复冻融3次直至出现深蓝紫色荧光。4℃下12000r/ min离心20min得上清液即为螺旋藻水溶性蛋白；在上述所提的上清液 中加入3倍体积预冷的丙酮溶液，混匀后-20℃静置2h，4℃下12000r/ min离心20min，弃上清液；沉淀经真空冷冻干燥后，加入适量SDS上样 缓冲液使其溶解，即制得用于十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE)的蛋白样品。

4、SDS-PAGE和软件分析

蛋白质浓度测定参照Bradford[Anal Biochem, 1976, 72: 248— 254]的考马斯亮蓝G-250法进行；蛋白质SDS-PAGE分析参照Laemmli[N ature, 1970, 227: 680—685]的方法进行，分离胶浓度为12.5%， 浓缩胶浓度为5%。先以80V电泳45min后，再以120V电泳使溴酚蓝至胶 底部。用考马斯亮蓝G-250染色，脱色后凝胶成像，利用Quantity O ne分析软件对蛋白质电泳图谱在102kD处蛋白带的光密度值进行检测分 析，并根据其值利用SPSS13.0统计分析软件构建藻株间的聚类图，构 建藻株间的聚类图，通过聚类情况来鉴别该品系生产性状的优劣。

本发明的有益效果是：

本发明所建立的区分螺旋藻生产性状优良品系的方法与常规方法相比 ，不仅简单、高效、可靠、成本低，而且不用进行核酸测序与生物信 息学比对等复杂试验和分析，因而适合大规模、高通量筛选。

附图说明

图1为9株螺旋藻品系水溶性蛋白的SDS-PAGE凝胶图；其中M：标准分子 量；1～9：依次对应Sp-1、Sp-2、Sp-6、Sp-10、Sp-9、Sp-4、Sp-5、 Sp-17和Sp-15。

图2为9株用于构建生产性状鉴别标准的螺旋藻品系的聚类图。

图3为被鉴别藻株Sp-3、Sp-16、Sp-18和Sp-37 的SDS-PAGE凝胶图； 其中M：标准分子量；1～4：依次对应1：Sp-18；2：Sp-3；3：Sp-16 ；4：Sp-37。

图4为被鉴别藻株Sp-3、Sp-16、Sp-18和Sp-37 在所建鉴别标准中的 归类图。

具体实施方式

蛋白质的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术已被 广泛应用于烟草、水稻、木本植物和海藻等生物的分类和鉴定等领域 ，但有关螺旋藻蛋白质的SDS-PAGE指纹图谱及相关分析方法在分类和 鉴定等方面的应用，却鲜有报道。本发明建立了一种以检测蛋白指纹 图谱在102kD处条带光密度值的大小，并通过聚类来鉴别螺旋藻生产性 状的优良及能否应用于大规模生产养殖的新方法。

我们以9株公知的螺旋藻 Sp-1、Sp-2、Sp-4、Sp-5、Sp-6、Sp-9、、 Sp-10、Sp-15和Sp-17为对照材料，经蛋白质的SDS-PAGE及利用Quant ity One软件检测其蛋白质电泳图谱在102kD处蛋白带光密度值的大小 ，并根据其大小进行聚类分析，结果发现，9株品系可分为两大类：S p-4、Sp-5、Sp-15和Sp-17为第I类；Sp-1、Sp-2、Sp-6、Sp-9和Sp-1 0为第II类。长期的科学研究与生产实践表明，上述第I类中的4株品系 在实际生产养殖中表现优良，而第II类中的5株品系因适应能力差而不 宜用作工厂化生产养殖。由此可见，蛋白质电泳图谱在102kD处蛋白带 光密度值的大小可用于鉴别螺旋藻生产性状的优良。即若候选品系的 蛋白质电泳图谱在102kD处蛋白带的光密度值大于140，且与已知生产 性状好的品系聚到一起，则说明该品系生产性状好，适用于大规模培 植生产；若在102kD处蛋白带的光密度值小于40，且与已知生产性状不 好的品系聚到一起，则说明该品系生产性状差，不适用于大规模培植 生产。本发明的详细技术方案可以通过以下步骤实施：

1、选用材料为公知的9株螺旋藻品系Sp-1、Sp-2、Sp-4、Sp-5、Sp-6 、Sp-9、Sp-10、Sp-15和Sp-17，在浙江大学原子核农业科学研究所生 物资源与分子工程实验室也有保存。其中，Sp-4、Sp-5、Sp-15和Sp- 17因生产性状好，被广泛应用于大规模养殖生产；而Sp-1、Sp-2、Sp -6、Sp-9和Sp-10因生产性状差而不适用于工厂化生产。

2、试剂和仪器

蛋白质分子量标准购自GE Healthcare Biosciences（美国）；丙烯 酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS）、过硫 酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）等购自Amresco（美国）。所用 的垂直电泳系统和紫外-可见扫描分光光度计等为Amersham Pharmci a Biotech（美国）产品；冷冻干燥仪为VirTis（美国）产品；扫描 仪GS-800 和Quantity One分析软件等为Bio-Rad（美国）产品；

3、水溶性蛋白的制备

取0.75g钝顶螺旋藻藻泥于5ml离心管中，并加入Tris-HCl提取液（12 5mM Tris-HCI，0.9% NaCl，pH 6.8）3ml，在-20℃冷冻1.5h后再 在4℃融化2h，如此反复冻融5次至出现深蓝紫色荧光，并在显微镜下 镜检无完整细胞。4℃下12000r/min离心20min得上清液即为螺旋藻水 溶性蛋白；

4、SDS-PAGE和软件分析

蛋白质浓度测定参照Bradford[Anal Biochem, 1976, 72: 248— 254]的考马斯亮蓝G-250法进行；蛋白质SDS-PAGE分析参照Laemmli[N ature, 1970, 227: 680—685]的方法进行，分离胶浓度为12.5%， 浓缩胶浓度为5%。先以80V电泳45min后，再以120V电泳使溴酚蓝至胶 底部。用考马斯亮蓝G-250染色，脱色后凝胶成像，利用Quantity O ne分析软件对蛋白质电泳图谱在102kD处蛋白带的光密度值进行检测分 析，并根据其值利用SPSS13.0统计分析软件构建藻株间的聚类图，通 过聚类情况来鉴别该品系生产性状的优劣。

5、结果与分析

图1为9株螺旋藻品系水溶性蛋白的SDS-PAGE凝胶图；利用Quantity  One软件对蛋白质电泳图谱在102kD处蛋白带光密度值进行检测，并根 据其值进行聚类分析，如图2所示，9株螺旋藻品系可分为两大类：Sp -4、Sp-5、Sp-15和Sp-17为第I类；Sp-1、Sp-2、Sp-6、Sp-9和Sp-10 为第II类。

长期的科学研究与生产实践表明，上述第I类中的4株品系在实际生产 养殖中表现优良，而第II类中的5株品系因适应能力差而不宜用作工厂 化生产养殖。由此可见，蛋白电泳图谱在102kD处蛋白带光密度值的大 小可用于鉴别螺旋藻生产性状的优劣。即若 候选品系的蛋白电泳图谱在102kD处蛋白带的光密度值大于140，且与 已知生产性状好的品系聚到一起，则说明该品系生产性状好，适用于 大规模培植生产；若在102kD处蛋白带的光密度值小于40，且与已知生 产性状不好的品系聚到一起，则说明该品系生产性状差，不适用于大 规模培植生产。

进一步利用NanoLC-MS/MS对生产性状好与差两组节旋藻品系SDS-PAGE 上102kD处的蛋白带进行质谱鉴定与生物信息学分析与比较发现，生产 性状好的品系具有一种特异性的蛋白——麦芽寡糖基海藻糖合成酶， 而在生产性状差的品系中没有。麦芽寡糖基海藻糖合成酶能催化合成 海藻糖。而海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等外界恶劣环 境条件下能在生物体细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质 分子不变性失活，维持生命体正常的生命过程和生物特征，从而使生 物体对外界环境有更好的适应能力（邵引刚等. 海藻糖的应用及基因 工程研究. 安徽农业科学. 2008, 36(3): 857-859）。因此，生 产性状好的品系中由特有的麦芽寡糖基海藻糖合成酶合成的海藻糖， 能有效地抵御节旋藻培植过程中高温和渗透压骤变等各种不良环境， 使用权其表现出更好的生产性状；而生产性状差的品系，因缺乏该合 成酶而不能合成海藻糖，致使其对环境等变化更敏感而表现出更差的 生产性状。可见，节旋藻SDS-PAGE上102kD处的蛋白带与品系的生产性 状密切相关。

作为实例，我们选取公知的Sp-3、Sp-16、Sp-18和Sp-37这4株品系来 验证本发明的实用性，其中，Sp-3和Sp-16品系的生产性状好，被广泛 应用于大规模养殖生产，而Sp-18和Sp-37因生产性状差而不适用于工 厂化生产。Sp-3、Sp-16、Sp-18和Sp-37这4株品系的水溶性蛋白经SD S-PAGE获得蛋白质电泳图谱（图3），利用Quantity One软件检测蛋 白质是泳图谱在102kD处蛋白带的光密度值，然后根据其值进行聚类分 析。结果如图4所示，Sp-3和Sp-16的蛋白指纹图谱在102kD处蛋白带的 光密度值都大于140，且都能与已知生产性状好的品系聚到一起，说明 该品系生产性状好，适用于大规模培植生产；而Sp-18和Sp-37的蛋白 质电泳图谱在102kD处蛋白带的光密度值都小于40，且都能与已知生产 性状差的品系聚到一起，说明该品系生产性状差，不适用于大规模培 植生产。该例子进一步说明，通过检测蛋白质电泳图谱在102kD处蛋白 带的光密度值来鉴别该品系生产性状的优良，可作为一种简单、高效 、低成本的方法来鉴别螺旋藻生产性状的优劣。