甘丙肽在制备女性抑郁症检测工具中的应用

摘要

本发明公开了甘丙肽在制备女性抑郁症检测工具中的应用，本发明通过研究大量的临床抑郁症病人血浆甘丙肽与抑郁症的相关性，结果显示女性血浆中甘丙肽的浓度与女性抑郁症的浓度呈正相关。本发明还公开了一种检测女性抑郁症的试剂盒及其使用方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物化学物质在疾病检测中的新应用。具体而言，本发 明涉及人血浆中甘丙肽的检测方法以及甘丙肽在女性抑郁症检测中的应用。

背景技术

抑郁症又称抑郁障碍，是由各种原因引起的以抑郁为主要症状的心境障碍 或情感性障碍，涉及遗传、生化、心理和社会环境等多种因素。以持续性心境 低落为主要特征，主要表现为情绪低落、精神压抑、易于哭泣，可伴有自卑、 自责，患者感到精力疲惫、脑力迟钝、前途暗淡、悲观失望等。抑郁症属于中 医情志病范畴，散在于古医籍中郁证、癫狂、脏躁、百合病、惊悸、怔忡、不 寐、奔豚气等疾病。随着社会的发展，应激源的增多，抑郁症的发病率呈逐年 增长的趋势。研究显示，单相抑郁的终生患病率在10％以上，且女性是男性的 2倍左右[Moldin SO，Reich T，Rice JP.Current perspectives on the genetics of  unipolar depression.Behav Genet1991；21(3)：211-242]。

抑郁症的发病率、复发率、自杀致残率较高，却面临着检出率低、治疗率 低以及治愈率低等特点。世界卫生组织预测，到2020年抑郁症将成为发展中国 家仅次于心脏病的第二大疾病，成为最严重的疾病负担[Kessler RC，Berglund P， Demler O.The epidemiology of major depressive disorder：results from the national  comorbidity survey replication(NCS-R).JAMA2003，89(2)：3095]。

遗传研究认为，抑郁症具有一定的遗传倾向。双生子研究显示，抑郁症的 遗传度在40％～50％[Torgersen S.Genetic factors in moderately severe and mild  affective disorders.Arch Gen Psychiatry1986；43(3)：222-226]。寄养子研究也提示 遗传在抑郁症发病中具有重要作用[Wender PH，Kety SS，Rosenthal D， Schulsinger F，Ortmann J，Lunde I.Psychiatric disorders in the biological and  adoptive families of adopted individuals with affective disorders.Arch Gen  Psychiatry1986；43(10)：923-929]。抑郁症先证者一级亲属与普通人群相比，其相 对危险度在2～3，复发性抑郁和早发抑郁的相对危险度至少在4～5。但迄今为 止，抑郁症的遗传模式还不甚清楚。

源于单胺氧化酶抑制剂[Richelson E.Synaptic effects of antidepressants.J  Clin Psychopharmacol1996；16(3Suppl2)：1S-7S]和三环类抗抑郁药[Tran PV， Bymaster FP，McNamara RK，Potter WZ.Dual monoamine modulation for improved  treatment of major depressive disorder.J Clin Psychopharmacol2003；23(1)：78-86] 通过增加突触间隙去甲肾上腺素(去甲肾上腺素)和5羟色胺(五羟色胺)浓 度而发挥抗抑郁效应的单胺递质假说是抑郁症病因学的主流假说[Chopra K， Kumar B，Kuhad A.Pathobiological targets of depression.Expert Opin Ther Targets  2011；15(4)：379-400]。假说认为，抑郁症是中枢去甲肾上腺素和五羟色胺功能不 足或缺失所致。大量证据表明：中枢五羟色胺和去甲肾上腺素功能失调与抑郁 症发病以及抗抑郁药的作用机理密切相关。但是，递质失调的背后机理不甚明 了。

目前，这一假说仍然存在诸多问题。绝大多数抗抑郁药主要针对单胺转运 体靶点，增加突触间隙的去甲肾上腺素和五羟色胺水平，发挥抗抑郁作用。但 是，抗抑郁药短时间内即可增加突触间隙神经递质，而抗抑郁疗效却要延迟2～ 4周显示[Davis LL，Wisniewski SR，Howland RH.Does comorbid substance use  disorder impair recovery from major depression with SSRI treatment？An analysis of  the STAR*D level one treatment outcomes.Drug Alcohol Depend2010； 107(2-3)：161-170]；抗抑郁药的总有效率仅为60％～80％，仍有相当一部分病人 缺乏疗效或由于毒副反应放弃治疗[Wong ML，Licinio J.From monoamines to  genomic targets：a paradigm shift for drug discovery in depression.Nature Reviews  Drug Discovery2004；3：136-151]；以褪黑素为作用靶点的新型抗抑郁药成功研发 上市，进一步说明抑郁症病因病理的复杂性，说明目前单胺类假说不能诠释抑 郁症的病理机制，促使研究者进一步探讨其具体发病机理。同时，由于抑郁症 是一种发作性的疾病，具有一定的自愈倾向。这提示，在机体内部存在某些内 源性的保护因素[Zhang JM，Tonelli L，Regenold WT.Effects of neonatal flutamide  treatment on hippocampal neurogenesis and synaptogenesis correlate with  depression-like behaviors in preadolescent male rats.Neuroscience2010； 169(1)：544-554]。对于这些内源性保护因素的探寻也许会对认识抑郁症发病机 理、转归和治疗产生深远影响。

神经调质，尤其是与心境障碍相关的神经肽类，逐渐引起研究者的注意。 在脑内，这些神经肽常与经典的神经递质如去甲肾上腺素、五羟色胺、多巴胺 等共存。这些调质的一个重要特征就是在应激状态或神经元处于高活性状态下 被激活。他们通过多种受体亚型，调节共表达神经元的功能和活性。

甘丙肽在脑内均有较为广泛的分布，参与人体多种高级生理功能的调节， 如认知、情感行为、神经损伤等。在中缝背核有95％的五羟色胺能神经元与甘 丙肽递质共存，蓝斑80％以上的去甲肾上腺素能神经元与甘丙肽递质共存；无 论是蓝斑还是中缝背核所有的甘丙肽能阳性神经元内均有去甲肾上腺素或五羟 色胺递质的存在。甘丙肽的受体在蓝斑和中缝背核部位均有表达且有其纤维投 射[Kehr J，Yoshitake T，Wang FH.Galanin is a potent in vivo modulator of  mesencephalic serotonergic neurotransmission.Neuropsychopharmacology2002； 27(3)：341-356]。甘丙肽与中缝背核大部分五羟色胺能神经元和色氨酸羟化酶共 表达。因此，甘丙肽系统影响五羟色胺能和去甲肾上腺素能神经元功能。

基于上述研究，本发明主要通过抑郁症患者体内甘丙肽及性激素与抑郁症 之间的关联性，探寻神经肽与性激素相关激素间的关系，为女性抑郁症的检测 提供新的方法。

发明内容

本发明为检测预防和治疗抑郁症疾病，研究了抑郁症患者血浆中神经肽与 抑郁症之间的关联性，研究结果显示，血浆中甘丙肽浓度与女性抑郁症严重程 度呈相关性。

本发明根据研究需要设定了样本采集标准，成功采集了700名抑郁症患者 的血液样本，对样本进行了性别、年龄、抑郁程度等方面的统计和分层。年龄、 发病年龄、体重指数、HAMD、HAMA及其性别差异均无显著性差异。

本发明采用放射免疫的方法测定样本血浆中甘丙肽等神经肽的浓度，统计学 研究发现整体样本中甘丙肽浓度与抑郁症严重程度不存在相关性，甘丙肽与 HAMD评分之间的相关系数(r)为：0.233(P＝0.084)，HAMD为汉密尔顿抑郁 量表。

性别分层后女性患者血浆甘丙肽浓度与HAMD评分、甘丙肽与睾酮之间存 在相关性，相关系数r分别为：0.324(P＝0.046)，0.421(P＝0.014)，而男性患者血 浆甘丙肽浓度与HAMD评分无显著相关性，r＝-0.68(P＝0.694)。

本发明通过对抑郁症患者血浆甘丙肽、性激素相关激素与HAMD评分的相 关分析首次发现，甘丙肽的血浆浓度与女性抑郁症患者的HAMD评分成正相关， 相关系数为0.324(P＝0.046)。我们可以通过测定女性抑郁症患者甘丙肽的血浆 浓度来推测或判断抑郁症状的严重性，进而为抑郁症的临床评估提供生物学的 指标。本发明通过对

本发明还公开了一种检测女性抑郁症的试剂盒，试剂盒中包括甘丙肽抗体， 所述甘丙肽抗体可以通过免疫大鼠、小鼠、兔子等哺乳动物，获得甘丙肽多克 隆抗体；也可通过经典的杂交瘤技术获得甘丙肽单克隆抗体。

本发明公开了一种检测女性抑郁症的放免试剂盒，包括以下组份：含Galanin 抗体的大鼠血清、¹²⁵I-Galanin(¹²⁵I标记的的Galanin)、缓冲液、分离剂、正常 大鼠血清、Galanin标准品为5、10、20、40、80、160pg/mL；所述缓冲液为200mM  pH5.0磷酸盐缓冲液；所述分离剂为兔抗大鼠IgG血清。

本发明还公开了一种检测甘丙肽的方法，包括以下步骤：

1、测定前使样本置于室温或冷水中复融，再3000转/分离心5分钟，取上清液 测定。

2、取聚苯乙烯试管编号，T、NSB，S₀～S₆和待测样品管等。

3、其中编号为NSB管加缓冲液300ul，编号为S₀管加缓冲液200μl和含Galanin 抗体的大鼠血清100μl；编号为S₁～S₆管先加100μl缓冲液和100μl含Galanin 抗体的大鼠血清，然后分别加入100μl浓度为5、10、20、40、80、160pg/mL 的Galanin标准品；样品管加入200ul待测样本上清和100μl含Galanin抗体的 大鼠血清；上述各管加样完成后充分混匀，于4℃，放置24小时。

4、上述各管加入100ul¹²⁵I-Galanin充分混匀，于4℃，放置24小时。

5、上述各管加入100ul正常大鼠血清，充分混匀后，室温静置20分钟。

6、除标记为T的试管，其他各管加入500ul兔抗大鼠IgG血清，混匀，室温放 置20分钟，4℃离心3500转/分，25分钟，立即吸取上清液，测定各管沉淀cpm 数。

7、实验结果处理如下：

(1)测每份标品管的cpm值并计算出平均数；

(2)按下列式计算各标准管，质控和病人标本的B/130％

B/B₀＝(B-NSB)/(B₀-NSB)×100％

B＝为样品管值cpm，B₀＝标准管B₀的cpm值；NSB＝非特异性结合管的cpm值；

(3)以各标准管B/130为纵轴，标准物浓度(ng/ml)为横轴在logit-log坐标纸 上绘制标准曲线；

(4)在标准曲线上查出质控血清及各标本的甘丙肽浓度。

本发明通过上述方法，检测了376女性的血浆甘丙肽浓度，结果显示当女 性抑郁症患者抑郁程度较为严重时，其血浆甘丙肽浓度超过34.54pg/ml；当女 性抑郁症患者抑郁程度为中度抑郁时，其血浆甘丙肽浓度为29.73～34.54pg/ml； 当女性抑郁症患者抑郁程度为轻度抑郁时，其血浆甘丙肽浓度达为23.55～29.73 pg/ml；正常人的血浆甘丙肽浓度小于21.02pg/ml。

具体实施方式

实施例1血浆甘丙肽浓度与抑郁症

一、研究对象和方法

1、研究对象

首都医科大学附属北京安定医院门诊或住院的患者700例、符合DSM-I V 抑郁症诊断标准，并符合下列标准的患者，作为研究对象。

抑郁症患者入组标准：(1)住院或门诊患者；(2)汉族；(3)年龄18～60 岁；(4)符合DSM-IV抑郁症诊断标准；(5)患者本人或其法律监护人签署知 情同意书；。

抑郁症患者排除标准：(1)有精神分裂症、酒精和药物依赖病史；(2)有 脑器质性疾病和内分泌疾病史；(3)妊娠期和哺乳妇女；(4)有躁狂或轻躁狂 发作史；(5)电休克治疗者。

2、研究方法

2.1临床资料收集

对于上述研究对象均通过2名中级以上医师确证，并做SCID扫描，资料采 集包括：一般包括年龄、性别、民族、文化程度、职业、既往健康状况、烟酒 嗜好，家族史等，对符合入组条件者签署知情同意书。

2.2抑郁评定工具及方法

由医院院精神科5名有多年临床工作及量表评定经验的主治医生对所有的 入组人员进行一般情况的了解及简易智力状态检查、17项汉密尔顿抑郁量表 (HAMD)和汉密尔顿焦虑量表(HAMA)来评定患者抑郁症的严重程度。

2.3标本采集及处理方法

对符合入组条件的患者，早晨6:00到9:00之间空腹抽取肘静脉血5ml(EDTA 抗凝管)，缓慢倒置数次，血浆的分离采用3000转/分离心5分钟，吸取上清液， -80℃保存。

2.4血浆生化指标检测

血浆甘丙肽、神经肽Y测定采用放免试剂盒，送301放免研究所委托测定。 血浆雌激素、雄激素、孕酮、睾酮等采用化学发光免疫标记法测定。

2.4.1甘丙肽浓度的测定

2.4.1.1实验材料和仪器：

甘丙肽放免试剂盒，高速冷冻离心机(美国Beckman公司)。所述甘丙肽放 免试剂盒包括以下组份：含Galanin抗体的大鼠血清、¹²⁵I-Galanin(¹²⁵I标记的 的Galanin)、缓冲液、分离剂、正常大鼠血清、Galanin标准品为5、10、20、 40、80、160pg/mL；所述缓冲液为200mM pH5.0磷酸盐缓冲液；所述分离剂为 兔抗大鼠IgG血清。

本发明所述试剂盒检测甘丙肽的原理是：应用竞争机制原理，标准品或样 品中的Galanin和加入的¹²⁵I-Galanin共同与一定量的抗Galanin抗体产生竞争性 免疫反应。¹²⁵I-Galanin与抗体的结合量与标准品或样品中Galanin的含量呈一定 的函数关系。用免疫分离试剂(PR)将结合部分(B)与游离部分(F)分离后， 测定结合部分的放射性强度，并计算相应结合率B/B₀。用已知标准Galanin含量 与对应结合率作图，即得标准抑制曲线。从标准曲线上查知对应结合率的待测 样品中Galanin的含量。

2.4.1.2实验步骤：

测定前使样本置于室温或冷水中复融，再3000转/分离心5分钟，取上清液 测定。测定采用非平衡法，取聚苯乙烯试管编号，按表1操作。

表1放射免疫测定加液程序

注：单位为μL，X代表各测定物，此处X代表Galanin。

以B/T计算NSB、S0结合百分率，以B/BO计算标准及待测样品结合百分率， 在半对数座标纸上绘制标准曲线，并查出样品值或由自动γ计数器直接读出样 品甘丙肽的浓度。

2.4.2神经肽Y浓度的测定

2.4.2.1实验材料和仪器：

神经肽Y放免试剂盒(美国ALPCO公司)，高速冷冻离心机(美国Beckman 公司)。

2.4.2.2实验步骤：

以B/T计算NSB、S0结合百分率，以B/BO计算标准及待测样品结合百分 率，由自动γ计数器预先编制程序，直接给出有关参数、标准曲线及样品浓度， 得出浓度后，除以浓缩倍数4得出实际浓度。

测定前使样本置于室温或冷水中复融，再3000转/分离心5分钟，取上清液 测定。测定采用非平衡法，取聚苯乙烯试管编号，按表1操作。

2.4.3雌激素的浓度测定

2.4.3.1实验材料和仪器：

人雌激素ELISA检测试剂盒(美国RD公司)，蒸馏水，移液枪，振荡器

2.4.3.2实验步骤：

a)将试剂盒所有试剂在室温下充分混匀，避免产生泡沫。

b)将标准品稀释到400、200、100、50、25、12.5、0pg/ml，50×缓冲液稀 释到1×。

c)标准品设置2个复孔，样品设置10个复孔。将标本用标本稀释液按1∶ 1稀释后加入50ul于反应孔内。

d)加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。 立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小 时。

e)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍 干。重复此操作3次。

f)每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

g)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍 干。重复此操作3次。

h)每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光 照。

i)取出酶标板，迅速加入50ul终止液，立即在450nm波长处测定各孔的 OD值。

j)计算：以吸光度OD值为纵坐标(Y)，相应的雌激素标准品浓度为横坐标 (X)，做得相应的曲线，样品的雌激素含量可根据其OD值由标准曲线换算出相 应的浓度。

2.5数据分析

采用SPSS16.0统计分析软件。甘丙肽浓度的性别差异采用t检验；抑郁症 状严重性与神经肽浓度，抑郁症严重程度与激素浓度采用相关性分析。所有考 察值以平均数±标准差表示，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异具有显 著性。

二、实验结果

1、人口学资料

本部分共收集北京安定医院抑郁症患者700例，其中女性376例，男性324 例。患者年龄、发病年龄、体重指数、HAMD、HAMA及其性别差异见表2。 结果显示年龄、发病年龄、体重指数、HAMD、HAMA及其性别差异均无显著 性差异。

表2抑郁症患者人口学资料及其性别差异

注：Values were mean±SD；HAMD：汉密尔顿抑郁量表；HAMA：汉密尔顿焦虑量表；galanin：甘丙 肽；BMI：体重指数

2、血浆水平的神经肽浓度及HAMD间的相关分析结果显示，甘丙肽与HAMD 评分之间的相关系数(r)为：0.241(P＝0.084)，(见表3)即甘丙肽与HAMD 评分之间不存在相关性。

性别分层后女性患者血浆甘丙肽浓度与HAMD评分、甘丙肽与睾酮之间差 异显著，r分别为：0.324(P＝0.046)，0.421(P＝0.014)(见表5)，而男性患者血浆 甘丙肽浓度与HAMD评分无显著相关性，r＝-0.68(P＝0.694)(见表4)。

表3抑郁症患者血浆生化递质及HAMD间的相关分析

NPY：神经肽Y；SP：感觉神经肽P物质；GAL：甘丙肽；COR：皮质激素；TES：睾酮；PRL：催乳素；PGN：孕酮；E2： 雌激素

*.Correlation is significant at the0.05level(2-tailed).

**.Correlation is significant at the0.01level(2-tailed).

表4男性患者血浆水平的生化递质及HAMD评分间的相关分析

*.Correlation is significant at the0.05level(2-tailed).

**.Correlation is significant at the0.01level(2-tailed).

表5女性抑郁症患者血浆水平生化递质及HAMD间相关分析

*.Correlation is significant at the0.05level(2-tailed).

**.Correlation is significant at the0.01level(2-tailed).

本发明通过对大量的抑郁症患者血浆甘丙肽、性激素相关激素与HAMD评 分的相关分析首次发现，甘丙肽的血浆浓度与女性抑郁症患者的HAMD评分成 正相关，相关系数为0.324(P＝0.046)。这一结果从另一个层面进一步提示甘丙 肽功能的性别差异性。

3、不同抑郁程度的女性患者其血浆中甘丙肽的含量

通过对376名女性患者进行17项汉密尔顿抑郁量表(HAMD)打分评定， 并检测其血浆中甘丙肽的含量，结果见表6：

表6女性抑郁症患者血浆甘丙肽的浓度

以上实验结果显示当女性抑郁症患者血浆甘丙肽浓度达到至少34.54 pg/ml时，其抑郁程度较为严重；当血浆甘丙肽浓度达到在29.73～34.54pg/ml 时，其抑郁程度为中度抑郁；当血浆甘丙肽浓度达到在23.55～29.73pg/ml时， 其为轻度抑郁；正常人的血浆甘丙肽浓度小于21.02pg/ml。

我们可以通过测定女性抑郁症患者甘丙肽的血浆浓度来推测或判断抑郁症 状的严重性，进而为抑郁症的临床评估提供生物学的指标。