利用污泥稀土混合浸种液调控水分胁迫下高羊茅保护酶的方法

摘要

本发明公开了一种利用污泥稀土混合浸种液调控水分胁迫下高羊茅保护酶的方法。所述的污泥稀土浸种液，它是由重量份数为1:1的污泥浸提液与稀土溶液组成；所述的污泥浸提液指的是污泥：蒸馏水的重量份数比为1:2混合后放置24h过滤，得到所需的污泥浸提液。稀土溶液指的是浓度为200-400mg.L

说明书

技术领域

本发明属于环境保护技术领域，涉及城市绿化，特别是一种利用污泥稀土混合浸种液调控水分胁迫下高羊茅保护酶的方法。

背景技术

近年来，稀土更是被誉为工业维生素，广泛应用于国防、航天、电子、新能源等领域，并且稀土元素在石油、化工、冶金、纺织、陶瓷、玻璃、永磁材料等领域都得到了广泛的应用，随着科技的进步和应用技术的不断突破，稀土氧化物的价值将越来越大。其中稀土元素也广泛应用于农业生产领域，一定质量浓度的稀土元素及其化合物对植物生长具有刺激促进作用。稀土所具有的高效、低成本、低毒等特点使之在农业生产中显示出广阔的应用前景。稀土作为适应逆境条件的一种新型物质，可能通过多种途径调节植物一系列生理生化过程。目前，稀土对生物影响的研究大多仍集中于作物增产、改善作物品质和提高作物抗逆性等方面。稀土并不是生命必需元素，但由于它在较低浓度的条件下对生物生长具有一定的促进作用，所以在农业、畜牧业和养殖业中作为一项增产措施而被广泛应用。

近年来，我国经济发展迅速，工业化进程加快，人口不断增加，各类污泥的年产量达到1.5x10⁷t。污泥是污水处理的必然产物，污水污泥是一种人类活动的必然产物。其产生量受到污水处理量、污水来源、处理工艺、处理水平、污泥脱水程度等因素影响。目前，世界各国的污水处理率和处理水平相差很大，所以对于污泥产生量很难给出一个准确的数值，一般都是根据污水处理量来估算其产生量。随着城市污水处理量与日俱增，污泥无害化处理与资源化利用成为当务之急。污泥经好氧发酵无害化处理后，作为基质替代物开展在基质生产上的应用，是一条经济可行的资源化途径。从实际应用效果来看，污泥发酵产物可改进基质理化性质，并具有保水性良好，养分释放缓释，符合作物生长需求规律的特点。

    草坪建设是城市现代化的重要标志，对绿化城市、保护生态环境卫生和生态平衡起着重要的作用。污泥堆肥与土壤混合作为基质可使草坪成坪时间显著缩短，改善草坪草的品质。同时资源化利用是污泥发展的主要方向。对污泥的重新利用不仅将污泥直接加入土壤中，还在污泥中加入化肥、动物粪便、秸秆等做成堆肥后使用。目前，将污泥施用于园林绿地是较理想的土地利用方式之一，也是安全、经济的城市污水污泥处置途径。国内外许多学者都对污泥的重新利用情况进行过大量的研究，包括在粮食作物，蔬菜，经济作物上的农业方面和园林绿地方面的土地利用。研究表明，稀土农用有明显的增产效应，还能增强作物的抗逆性。开展污泥在草坪上的应用，不仅可以促进草坪植物的生长，并且不存在食物链污染的危险。污泥在作为植物养分、土壤有机质和碱性稳定材料，石灰剂的来源方面十分有价值。

     干旱问题是的最为普遍的世界性自然灾害。据统计，全世界的干旱地区约占陆地面积的三分之一，且有逐年增加的趋势。而我国国土面积的53%都属于年降水量小于400mm的干旱、半干旱和生态环境脆弱地区。其中的土壤荒漠化、水土流失、沙尘暴等因干旱造成的自然灾害已经越来越严重，已危及我国生态环境安全。植物在逆境下（如干旱）会引起膜伤害和膜透性的增加，以及活性氧自由基的累积，而植物体内一系列的抗氧化酶类和小分子物质可以清除这些活性氧自由基，即植物对不良环境的适应性反应。 植物受到干旱胁迫后，会产生一系列形态和生理生化反应。形态上，随着植物体的失水，植物开始慢慢萎蔫，叶片或草本植物地上部分都会慢慢变得枯黄，最终随着进一步干旱，植物可能最终死亡。

     目前我国草坪植物的生产存在着诸多问题，无法满足城市草坪建植的需要，而其中草坪植物的萌发率和在逆境条件下生存就是一个重要的限制因素。在草坪生产过程中加入污泥浸提液和稀土元素混合浸种，主要是利用污泥浸提液和稀土元素具有增强植物种子活力、促进植物生长、增强植物抗逆性的作用， 将污泥浸提液和稀土元素应用于草坪植物，来提高草坪植物种子的活力、加快草坪植物的生长、提高草坪植物的抗逆性的能力；而这方面技术应用尚无文献报道。不仅可以拓宽城市污水污泥的 使用途径，还能够降低草坪的生产成本，是一条经济可行的途径。

本发明研究发现，用污泥稀土混合浸种液处理高羊茅，其在水分胁迫下，都推迟了叶萎蔫；并改善了草坪质量和根生物量。污泥稀土混合浸种液的使用改变了生物激素和色氨酸的含量，并提高了植物的抗旱性。因此，本技术方面采用污泥与稀土浸种液对高羊茅进行浸种处理，通过高羊茅叶绿素的含量、生物量、保护酶等指标变化规律，分析污泥与稀土浸种液浸种处理后高羊茅对干旱胁迫的适应能力，为干旱地区草坪植物的建植与养护管理提供一定技术支持。

发明内容

本发明公开了一种污泥稀土浸种液，其特征在于它是由重量份数为1:1的污泥浸提液与稀土溶液组成；其中所述的污泥浸提液指的是污泥：蒸馏水的重量份数比为1:2混合后放置24h过滤，得到所需的污泥浸提液；稀土溶液指的是浓度为200-400 mg.L^-1的Ce(NO₃)₃·6H₂O或 La(NO₃)₃·6H₂O溶液。

本发明所述的污泥稀土浸种液，其中Ce(NO₃)₃·6H₂O稀土溶液的浓度为200-400 mg.L^-1。La(NO₃)₃·6H₂O稀土溶液的浓度为200-400 mg.L^-1。

本发明进一步公开了污泥稀土浸种液在制备调控水分胁迫下草坪植物保护酶中的应用。其中草坪植物保护酶指的是：草坪植株干旱胁迫期间过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性。

本发明更进一步公开了利用污泥混合浸种液调控水分胁迫下高羊茅保护酶的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）将取来的污泥，在自然条件下风干，用2-4 mm筛子筛去大块颗粒备用；

（2）然后将污泥于蒸馏水以重量份数为1:2装于容器中放置24h后，过滤，得到所需的污泥浸提液；其中污泥浸提液中含Cr: 0.5875μgl^-1，Cu: 3.3μg.l^-1，Pb: 26.6μg.l^-1，Zn: 36.9μg.l^-1，K: 1754.9μg.l^-1，PH为6.5-6.7。其中，土壤有机质含量4.68%，全氮量0.21%，有效磷22.03 mg/kg，全钾量324.3 mg/kg，pH 7.44，饱和含水率0.58 ml/g。

（3）分别用蒸馏水将Ce(NO₃)₃·6H₂O、La(NO₃)₃·6H₂O溶解，然后再分别制成浓度100-300 mg.L^-1的稀土溶液备用；

（4）将上述污泥浸提液和不同浓度的稀土溶液以1:1的比例混合，得到污泥和稀土浸种液；

（5）称取籽粒饱满、均匀的高羊茅种子0.4g，置于培养皿中，分别用上述溶液没过浸种24h，然后将已浸好的种子均匀置于装有100 g园土培养皿中，加水至土表面湿润，播种初期，充分浇水，保证种子能顺利萌发和幼苗初期生长。萌发5天之后，开始干旱胁迫，采用称重浇水；园土的土壤含水量应为饱和持水量的35%-50%，即100g土壤含水量应为15.28-21.67g，此时为中度胁迫，若要保持中度胁迫，则整个培养皿重约为157 g，保证植物处于中度胁迫过程，即每天浇水时保持在称重157 g；实验周期为40 d，培养期间实验室温度为23-27℃，湿度为45%-60%，光照强度为470-750μmol·m^-2·s^-1；

（6）植物培养40 d后，将高羊茅齐根刈割，地上部分用蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干表面水份，放入烘箱中，在105℃下杀青1 h，80℃烘干至恒重，测量其地上部分干重。

本发明更加详细的制备方法及试验情况如下：

1 研制材料与方法

1.1材料

    实验选用的污泥取自天津市纪庄子污水处理厂，草坪植物选用我国北方常见的高羊茅。稀土元素为铈和镧，采用天津市凯通化学试剂有限公司生产的硝酸铈，其分子式为：Ce(NO₃)₃·6H₂O和天津市津科精细化工研究所生产的硝酸镧，其分子式为：La(NO₃)₃·6H₂O。实验所用园土采自天津师范大学校园内，其中，土壤有机质含量4.68%，全氮量0.21%，有效磷22.03 mg/kg，全钾量324.3 mg/kg，pH 7.44，饱和含水率0.58 ml/g。

   浸提液的制备： 取来的污泥，在自然条件下风干的污，用2 mm筛子筛去大块颗粒。 然后以污泥：蒸馏水=1:2。装于锥形瓶中放置24 h后 ，然后过滤，得到所需的污泥浸提液。

用蒸馏水将Ce(NO₃)₃·6H₂O和La(NO₃)₃·6H₂O溶解后，然后将上述污泥浸提液和不同浓度的稀土溶液以1:1的比例混合得到污泥和稀土浸种液。草坪植物为高羊茅。

1.2实验方法

   实验共设8个处理，分别为纯蒸馏水、纯污泥浸提液、200 mg.L^-1铈 +污泥浸提液、300 mg.L^-1铈 +污泥浸提液、400 mg.L^-1铈 +污泥浸提液，200 mg.L^-1镧 +污泥浸提液、300 mg.L-1镧 +污泥浸提液、400 mg.L^-1镧 +污泥浸提液，以蒸馏水为对照（CK），所有处理均为三次重复。称取籽粒饱满、均匀的高羊茅种子0.4g，置于5.5 cm培养皿中，分别用上述溶液没过浸种24h，然后将已浸好的种子用滤纸吸去表面水份，均匀置于装有100 g园土的直径9cm的培养皿中，加水至土表面湿润。播种初期，充分浇水，保证种子能顺利萌发和幼苗初期生长。萌发5天之后，开始干旱胁迫，采用称重浇水。

    园土的土壤含水量应为饱和持水量的35%-50%。即100g土壤含水量应为15.28-21.67g，此时为中度胁迫，培养皿重37g。若要保持中度胁迫，则整个培养皿重约为157 g。保证植物处于中度胁迫过程，即每天浇水时保持在称重157 g左右。实验周期为40 d，培养期间实验室温度为23~27℃，湿度为45%~60%，光照强度为470~750μmol·m^-2·s^-1。

1.3指标测定方法

1.3.1株高和生物量的测定

植物培养40 d后，将高羊茅齐根刈割，地上部分用蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干表面水份，放入烘箱中，在105℃下杀青1 h，80℃烘干至恒重，测量其地上部分干重，视为生物量。

1.3.2保护酶含量的测定

粗酶液提取：准确称取0.5 g样叶，用磷酸缓冲液（PBS，pH7.8）冰浴研磨提取，定容25 ml，取10 ml于离心管中，10000 r·min-1EPPENDOFF离心机离心20 min，上清液为粗酶提取液。

POD活性测定：采用愈创木酚法，取3ml反应混和液于比色皿中，对照以pH=7.8磷酸缓冲液代替，向比色皿中加0.1mL粗酶提取液，立开启秒表计时，于470nm下测量吸光值，每分钟读1次数，共读3次。以每分钟△A470变化0.01为一个过氧化物酶活性单位。反应混和液成分为50mL pH=6.0的磷酸缓冲液加28μL愈创木酚和19μL过氧化氢。

SOD活性测定：采用NBT法。3ml反应混和液包括：pH=7.8的磷酸缓冲液，0.1mMEDTA，13mM蛋氨酸，75μMNBT，2μM核黄素和0.1mL得酶提取液，不加酶液的为对照。在人工气候箱中照射15min，不加酶液和无光照的作为空白对照。然后迅速在560nm下测定吸光值。以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位。

CAT活性测定：采用紫外分光光度法。于试管中加入1.5mlpH=7.8磷酸缓冲液、1ml蒸馏水、0.2ml酶提取液，对照用缓冲液代替酶液。然后在测定管中加0.3ml浓度为0.1mol.L^-1过氧化氢，同时立即计时，迅速在240nm下测量吸光值，每分钟读1次数。以每分钟△A240变化0. 1为一个过氧化氢酶活性单位。

1.3.3叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定采用丙酮-乙醇混合液法：准确称取0.1 g，剪碎，放入实验小黑盒中，加丙酮-乙醇（1:1）混合提取液10 mL，盖塞，在室温下暗处放置24 h，直到材料变白。然后在663 nm和645 nm波长下测定光密度。按照公式计算。

1.4 数据处理

     数据分析采用EXCEL和SPSS17.0分析软件进行处理

2 研制结果与分析

2.1污泥与稀土混合液浸种对干旱胁迫下高羊茅株高和生物量的影响

由表1可见，干旱胁迫期间，混合液浸种的高羊茅株高明显高于对照，说明混合液浸种明显有助于缓解植物干旱胁迫的影响。其中铈混合液浸种中，300铈+污泥浸提液在播种后10d、20d、25d分别比对照高出10.0%、9.6%、8.7%，与对照间差异显著（P﹤0.05）。对于镧混合液浸种，除200镧处理5d的株高外，其它处理各测定时间的株高均显著高于对照（P﹤0.05），其中，400镧+污泥浸提液在播种后5d比对照高出53.0%。

由表2可见，混合液浸种对高羊茅的干重鲜重影响比较明显，尤其高浓度稀土元素显著提高了干旱胁迫下高羊茅的生物量。鲜重中300铈+污泥浸提液是对照的56.22%，400镧+污泥浸提液是对照的58.5%。干重中300铈+污泥浸提液是对照的156.22%，400镧+污泥浸提液是对照的158.52%。

表1 污泥与稀土混合液对干旱胁迫下高羊茅株高的影响（cm）

表2 污泥与稀土混合液对干旱胁迫下高羊茅地上生物量的影响

2.2污泥与稀土混合液浸种对干旱胁迫下高羊茅保护酶活性的影响

由表3可知，各种混合液浸种的POD和SOD含量较对照有所下降，CAT活性均高于对照。对铈混合液浸种而言，POD和SOD含量均呈现了先减少后增加的趋势，其中300铈+污泥浸提液的POD和SOD含量分别比对照下降了16.34%、50.47%，与对照有显著差异（P﹤0.05）。高羊茅的CAT活性变化与SOD和POD不同，和对照相比，差异不显著。

表3 污泥与稀土混合液对干旱胁迫下高羊茅保护酶活性的影响

2.3污泥与稀土混合液浸种对干旱胁迫下高羊茅叶绿素含量的影响

 叶绿素含量与叶片光合能力大小密切相关，干旱胁迫可导致高羊茅的叶绿素含量降低，加入镧后干旱胁迫高羊茅叶绿素a含量均高于对照，但差异不显著（P>0.05）（见表4）。干旱胁迫通过各种途径降低植株的光合作用能力。从表4中可以看出，干旱胁迫期间，各处理组的叶绿素含量较对照均有不同程度的上升。而铈混合液处理中200铈+污泥浸提液的总叶绿素含量达到显著差异（P﹤0.05），比对照高出152.13%。对于镧混合液处理中200镧++污泥浸提液的总叶绿素含量达到显著差异（P﹤0.05），是对照的1.27倍。

表4 污泥与稀土混合液对干旱胁迫下高羊茅叶绿素含量的影响（mg·g^-1FW）

3 研制结论

本研究中，在干旱胁迫过程中，过氧化物酶和超氧化物歧化酶随胁迫的加强呈现先上升后下降的趋势，处理的高羊茅的过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性始终高于对照植株，表明污泥和稀土浸种液浸种可提高植株干旱胁迫期间过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性，从而提高抗旱性。以300铈+污泥浸提液的浸种最明显，在此组合下， SOD活性，POD活性表现出很高的活性，分别为 641.10 U·g^-1和8097.92U·g^-1·min^-1；CAT活性，300铈+污泥浸提液，比对照组活性增加了17.30%。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例1

一种污泥稀土浸种液，它是由重量份数为1:1的污泥浸提液与稀土溶液组成；其中所述的污泥浸提液指的是污泥：蒸馏水的重量份数比为1:2混合后放置24h过滤，得到所需的污泥浸提液；稀土溶液指的是Ce(NO₃)₃·6H₂O或 La(NO₃)₃·6H₂O水溶液。

其中Ce(NO₃)₃·6H₂O稀土溶液的浓度为200、300 、400mg.L^-1。

La(NO₃)₃·6H₂O稀土溶液的浓度为200、300 、400mg.L^-1。

调控水分胁迫下草坪植物保护酶的方法：

（1）将取来的污泥，在自然条件下风干，用2 mm筛子筛去大块颗粒备用；

（2）然后将污泥于蒸馏水以重量份数为1:2装于容器中放置24h后，过滤，得到所需的污泥浸提液；

（3）分别用蒸馏水将Ce(NO₃)₃·6H₂O、La(NO₃)₃·6H₂O溶解，然后再分别制成浓度2000-400 mg.L^-1的稀土溶液备用；

（4）将上述污泥浸提液和不同浓度的稀土溶液以1:1的比例混合，得到污泥和稀土浸种液；

（5）称取籽粒饱满、均匀的高羊茅种子0.4g，置于5.5 cm培养皿中，分别用上述溶液没过浸种24h，然后将已浸好的种子用滤纸吸去表面水份，均匀置于装有100 g园土的直径9cm的培养皿中，加水至土表面湿润。播种初期，充分浇水，保证种子能顺利萌发和幼苗初期生长。萌发5天之后，开始干旱胁迫，采用称重浇水。

    园土的土壤含水量应为饱和持水量的40%。即100g土壤含水量应为15.28-21.67g，此时为中度胁迫，培养皿重37g。若要保持中度胁迫，则整个培养皿重约为157g。保证植物处于中度胁迫过程，即每天浇水时保持在称重157 g左右。实验周期为40 d，培养期间实验室温度为25℃，湿度为45%~60%，光照强度为470μmol·m^-2·s^-1。

（6）植物培养40d后，将高羊茅齐根刈割，地上部分用蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干表面水份，放入烘箱中，在105℃下杀青1h，80℃烘干至恒重，测量其地上部分干重。