一种烟草中麦草畏残留量的测定方法

摘要

本发明公开一种测定烟草中麦草畏残留量的方法，该方法包括以下步骤：提取烟草中的目标物、N-丙基乙二胺纯化、标准储备液和标准工作液的配制和液相色谱-串联质谱测定。本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟草样本优化了前处理条件，并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系。与传统的气相色谱比较，采用基质分散固相萃取法来检测麦草畏。简化了前处理过程，提高了分析灵敏度。与HPLC方法相比，由于选取了超高效液相色谱柱RP18，使得柱子的分离度明显提高，分析时间显著缩短。串联质谱的使用使得方法的选择性和灵敏度提高，更有利于低含量的除草剂残留的测定。

说明书

技术领域

本发明涉及属于农药残留检验技术领域，具体涉及烟草中麦草畏残留量的测定方法。

背景技术

麦草畏是第一类投入商业生产的选择性除草剂，广泛施用于禾谷类作物田、针叶树林和 牧草场等。麦草畏都为低毒除草剂，通过植物叶面、茎杆和根系吸收传导，阻碍植物激素的 正常传导，从而使其死亡。但在使用过程中，结果表明此类物质可以引起人类软组织恶性肿 瘤，对动物体表现出胎盘毒性。CORESTA的农用化学品咨询委员会(ACAC)在2008年制定 的118种农用化学品指导性残留限量表中将麦草畏的限量定为0.20mg/kg。

对于水、土壤、蔬果以及纺织品中麦草畏残留的检测已有相关报道，而对于烟草中麦草 畏残留的检测报道较少。V.等利用在线的液相色谱-气相色谱联用法测定了烟草中 的麦草畏，酯化后的烟草样品进入液相色谱分离，选取合适的保留时间段切入气相色谱再次 分离，然后通过电子捕获检测器检测。刘惠民等研究开发了非水相毛细管电泳法测定烟草中 的麦草畏，2，4-D和2，4，5-T残留，其中麦草畏的检出限为0.5μg/mL，烟草样品经乙酸乙 酯超声萃取，凝胶渗透色谱净化后，进入毛细管电泳仪检测分析。宋娟梅等改进报道的毛细 管电泳法，采用正交法设计实验，优化毛细管电泳法，并将优化好的方法应用于烟草中2， 4-D、2，4，5-T、麦草畏的测定。烟草行业也于2004年制定了相应的行业标准，其中麦草畏、 2，4-D、2，4，5-T选取盐酸水溶液萃取，旋转蒸发浓缩，三甲基氢氧化锍衍生化，GC-MS 分析，其前处理复杂费时，检测时间较长，不利于高通量样品的快速准确检测。非水毛细管 电泳法的检出限较高，且分离度效果不如色谱方法。

超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）在农残检测的灵敏度以及选择性方面都明显 优于传统方法，在分析速度方面优于普通的HPLC方法，而目前未见该检测方法应用检测烟 草中的麦草畏残留量。

发明内容

鉴于此，本发明目的在于提供一种前处理简单、检测时间短，利于高通量样品的快速准 确的麦草畏残留量的测定方法。

为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种测定烟草中麦草畏残留量的 方法，该方法包括以下步骤：

1）提取烟草中的目标物

称取烘干磨好的烟叶样品，加入纯水浸润，依次加入氘代内标，乙腈和甲酸，涡漩混合 振荡。放入冰箱冷冻后取出，依次加入无水硫酸镁，氯化钠，柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠，涡 旋振荡后离心。

2）N-丙基乙二胺（PSA）纯化

移取上清液于新的离心管中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂，于漩涡振荡混合，然后高 速离心。吸取上清液经有机相滤膜过滤，移取滤液，并用乙腈和超纯水稀释后待测。

3）标准储备液和标准工作液的配制

用乙腈配置麦草畏标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。取一定量的储备液进 行混合，用乙腈稀释定容，制得混合标准储备液（10g/mL）。

用乙腈准确配置麦草畏-d₃氘带内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。取一 定量的内标储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得混合内标标准储备液（10g/mL）。所有 的储备液于冰箱-20℃，使用前将其恢复到室温。

用国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）空白烟叶的萃取基质配制不同浓度的麦草畏 标准工作溶液；

4）液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定：吸取空白烟叶溶液和配制好的不同浓度的麦 草畏标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，按内标法以峰面积计算出样品待测液中麦草畏含 量。

优选地，所述烟叶的重量为2g。

优选地，步骤1）中所述冷冻时间为10min，冷冻温度为-18至-15℃。

优选地，步骤1）中提取过程依次加入的超纯水，氘代内标(10g/mL)，乙腈和甲酸(49-51%) 的体积分别为10mL，20L，10mL和200L。涡旋振荡（2000rpm）1min。离心管在-10℃条件 下保持10min。依次加入的无水硫酸镁，氯化钠，柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠的质量分别为4g， 1g，1g和0.5g。然后漩涡混合振荡的速率为2000rpm，振荡时间为2min，离心（4000rpm） 时间为10min。

优选地，步骤2）中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂的质量为150mg和25mg。

优选地，所述步骤（2）中移取滤液体积为200L，加入乙腈和超纯水的体积为100L和 700L。

优选地，步骤4）中选取70%甲酸水(体积分数0.05%)和30%乙腈初始流动相体系，分析 时间为4min，进样量为10μL。

优选地，步骤4）中梯度洗脱条件为梯度洗脱条件：0~2min，70%A~10%A；2~3.5min， 10%A~10%A；3.5~3.51min，10%A~70%A；3.51~4.00min，70%A~70%A；流动相流速为 0.7mL/min。

优选地，步骤4）串联质谱检测器的条件：ESI-，喷雾电压（IS）：2.6kV，雾化气流量： 800L/Hr；锥孔气(cone)流量50L/Hr，离子化温度350℃；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气 为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30msec，负离子MRM模式采集。

本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟草样本优化了前处理条件， 并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体 系。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

选取了基质分散固相萃取方式来处理样品，简化了前处理过程。

在乙腈萃取过程中加入乙酸，有助于提高麦草畏这类苯氧羧酸类化合物的萃取效率。

在加入硫酸镁和氯化钠之前，放入冰箱冷冻一段时间，可以防止其加入后过热结块。

与传统的气相色谱比较，采用基质分散固相萃取法来检测麦草畏。简化了前处理过程， 提高了分析灵敏度。

与HPLC方法相比，由于选取了超高效液相色谱柱RP18(50mm×2.1mm，1.7um)，使得柱 子的分离度明显提高，分析时间显著缩短。串联质谱的使用使得方法的选择性和灵敏度提高， 更有利于低含量的除草剂残留的测定。

选取了氘代麦草畏对麦草畏进行定量，有效消除基质干扰和前处理过程中引起的误差， 使得方法的准确性更高。

选取了两个离子对，定量离子对定量，定性离子对确认，可以提高方法的准确度。

本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。

附图说明

图1是麦草畏的子离子质谱图。

图2是麦草畏-d₃的子离子质谱图。

图3是加标样品的选择离子流色谱图（50ng/mL，定量离子对）。

图4是加标样品的选择离子流色谱图（50ng/mL，定性离子对）。

图5是麦草畏-d₃的选择离子流色谱图（IS20ng/mL）。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例进行说明。参见图1至图5。

1．仪器与试剂

Waters Xevo TQ超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)，配备电喷雾电离源 （ESI）；VtexMixer230VeU振荡器（美国Labnet公司）；Sigma3K15离心机(德国Sigma 公司)。

甲酸为HPLC级(浓度为49-51%，德国Sigma公司)；乙腈，甲醇均为色谱纯（美国 Thermo-Fisher公司）；麦草畏标准品来自于Labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers（化学纯度：98.5%， Augsburg，德国），内标麦草畏-d3来自于Labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers（化学纯度：99%， 同位素纯度：98.5%，Augsburg，德国）。N-丙基乙二胺（PSA）吸附剂、末尾封端碳18（C18E） 吸附剂，水为超纯水。

2．提取烟草中的分析物

准确称取2g样品（精确至0.01g）于50mL具盖离心管中，加入10mL水，振荡直至样 品被水充分浸润。冷冻10min后移取10mL乙腈至离心管中，加入200L甲酸，然后将离心管 置于涡漩混合振荡仪上，以2000rpm速率振荡1min。将离心管置于0℃条件下保持10min， 然后向离心管中加入4g无水硫酸镁和1g氯化钠，1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸二氢钠，立即于 漩涡混合振荡仪上，以2000rpm速率振荡2min，然后以4000rpm速率离心10min。

3.PSA纯化

移取上清液1.0mL于1.5mL离心管中，加入150mg无水硫酸镁及25mgPSA吸附剂，于 漩涡混合振荡仪上以2000rpm速率振荡2min，以6000rpm速率离心2min。吸取上清液经0.22m 有机相滤膜过滤，移取200L，用超纯水稀释至1.0mL，待测。

4液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定

（1）LC-MS/MS条件：

色谱条件：Atiantis UPLC BEH Shield RP18(50mm×2.1mm，1.7um，美国Waters公司)； 流动相A：0.05%甲酸水溶液（体积分数），流动相B：乙腈；流速0.7mL/min；柱温45°C； 进样量10μL。梯度洗脱条件：0~2min，70%A~10%A；2~3.5min，10%A~10%A；3.5~3.51min， 10%A~70%A；3.51~4.00min，70%A~70%A。

质谱条件:电喷雾离子源，喷雾电压（IS）：2.6kV，雾化气流量：800L/Hr；锥孔气(cone) 流量50L/Hr，离子化温度350℃；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮 气；驻留时间为30msec，负离子MRM模式采集，监测离子对及其相应的碰撞能量（CE）见 表1。

表1多反应监测模式下麦草畏及其氘代内标的部分质谱参数

*quantification ion pairs．

（2）标准储备液的配制

储备液及工作液的配制：用乙腈准确配置麦草畏（1.00mg/mL）标准储备液，储存于棕 色玻璃瓶中，-20℃保存。取一定量的各化合物储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得标准 储备液（10g/mL）。

用乙腈准确配置麦草畏-d₃（0.67mg/mL）氘带内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中， -20℃保存。取一定量的各内标储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得混合内标标准储备液 （10g/mL）。所有的储备液于冰箱-20℃，使用前将其恢复到室温。

（3）麦草畏含量的测定

吸取配制好的不同浓度的麦草畏的混合标准工作溶液各10μL，注入LC-MS/MS；麦草畏 的线性回归方程分别为y=0.00798x+0.248518，其中y代表分析物与内标峰面积的比值，x表 示烟草中目标分析物的浓度。同样的方法检测实际样本，求得实际样本中麦草畏的含量。

（4）该方法的线性范围和检出限

分别移取混合标准储备液0L，10L，20L，50L，100L1g/mL混合标液和20L，50L及 100L10g/mL混合标液到8个10mL容量瓶中，每个容量瓶移入20uL混合氘代内标工作液 （1g/mL），加入200L空白烟叶样品萃取液，用纯水定容至1mL。各标准工作溶液的浓度分 别为0ng/mL，1ng/mL，2ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL。分别 对这些标准溶液进行LC-MS/MS分析，并对各标样峰面积与内标的峰面积的比值（y）和其 浓度（x）进行线性回归分析，得到标准曲线，结果见表5。结果表明，麦草畏线性关系良好 (相关系数r>0.998)，可以满足定量分析的需要。以3倍信噪比确定方法的检出限，详见表2。 混合标准品及加标样品的总离子流色谱图见图4。

表2麦草畏的线性范围、相关系数、检测限及保留时间

（5）本发明方法的重复性和加标回收率：

在空白的烤烟样品中添加一定量的麦草畏标准溶液，然后提取、测定，计算回收率。本 实验选用高、中、低3种不同浓度的加标回收实验来考察方法的准确度，计算5次结果的平 均值为93.1%~100.6%。方法的精密度以回收率的相对标准偏差(RSD)来评价，对同一样品平 行测定5次，麦草畏回收率的RSD范围为4.6%~10.3%，结果见表3。

表3烟草中麦草畏的回收率和精密度(n=5)

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明 的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。