通过用自体血清培养自体角质形成细胞和成纤维细胞来生产用于生成皮肤的自体皮肤片或敷料的方法

摘要

该方法一般是基于从患者取皮肤样品和血液样品并且基于这两种要素培养皮肤，置于胶原片上以产生敷料，随后将所述敷料置于对其有需要的患者上。

说明书

技术领域

本发明涉及用于形成皮肤敷料或片的方法，所述皮肤敷料或片用于对 患者中的皮肤损失进行覆盖、使其治愈、结斑、减轻。特别地，本发明涉 及用于在实验室中实施的生产皮肤的方法。

背景技术

目前，深度烧伤以及由不同创伤或疾病引起的其他皮肤组织损失造成 皮肤损伤，这些损伤需要对这些区域进行护理覆盖。已经用直接获自患者 自身皮肤的皮肤移植物实施这种覆盖。该方法尽管有效，但在获得所述移 植物的区域(大腿、背部、臀部)中产生显著的瘢痕(照片1)。此外， 该方法必须在实施了全麻或局麻的外科手术中进行，这产生了任何外科手 术所固有的并发症，例如：严重的疼痛、感染、以及出血、新的手术、以 及死亡(尽管百分率非常低)。此外，这还意味着较高的额外经济花费， 例如住院、为治愈而进行的会诊、治疗供体区域的瘢痕、用于手术的特殊 材料以及将患者转移到更综合的医院，等。

皮肤撕脱伤造成对皮肤上皮组织的损伤，导致细胞损失，其在体内条 件中被用成纤维细胞(其充当饲养层(alimentadora))产生的纤维基质 替换。有多个报道涉及角质形成细胞培养物用于构建皮肤再生片，所有这 样的报道都述及供体所提供的或来自尸体的细胞(异体的)，这意味着对 供体和受体两者实施多项研究，培养在胎牛血清中，这使得该产品昂贵且 在发展中国家中不可行，因此，角质形成细胞培养物在患者自身的血清(自 体的)中发育，在作为饲养层的同一患者的成纤维细胞(自体的)上，并 且使用同一患者的角质形成细胞(自体的)，因此当覆盖出血的区域时避 免了免疫和排斥反应，因此提高了侵袭性过程中皮肤的生存力，并且通过 该方法在非常短的时间内获得了完全的上皮化(皮肤生长)，结果良好且 成本很低。

因此，用于覆盖受影响区域的替代机制一直是世界范围内的研究目 标。在该范围内，用于生成皮肤的方法尤为突出，其允许替换损失的皮肤 并且避免整个前述创伤。到目前为止，已使用来自尸体的细胞开发了此类 方法，但该方法有一些缺陷，因为使用来自尸体的细胞在很多情况中产生 免疫反应，这可产生组织排斥和令人不太满意的结果。此外，这些方法的 成本是非常高的，因为使用来自尸体的皮肤意味着实施多种免疫相容性检 查等，以排除接触传染病(例如HIV和肝炎)的可能性。

发明简述

自2008年起，一组外科医生和整形外科医生开始了这样的任务：寻 找用于生成皮肤而又避免前述并发症的方法。因此，他们决定研究这样的 方法：由受影响者的非常小份(3mm)的皮肤生成皮肤，因此确保了使 用所培养组织的益处并且避免了不相容风险、高成本和额外疤痕的缺点。

我们由取自患者皮肤的细胞生成皮肤的方法的优点对于全世界的科 学以及整形外科和医学的未来具有非常重要的意义。其中，重要的是突出 以下优点：

1.该方法不生成除皮肤损伤以外的额外疤痕，因为从患者中尽可能少 地且从不可见的位置取出皮肤。

2.不引起患者的创伤，因此不产生疼痛。

3.不具有免疫排斥问题，因为所使用的组织取自同一患者。

4.不需要将该方法作为手术实施。

5.该方法可由任何专业的护士和医生来操作。

6.治疗患者的医院不必要求用于取皮肤的特殊材料(称为取皮机 (Dermatome))及其切割仪器，因为仅可使用一次，所以它们成本不 利。这些产品对于本发明的皮肤培养方法来说不是必须的。

7.生产成本比来自尸体的皮肤便宜约80％，并且美学结果要好得多。

8.生产和经销成本比在20×20cm面积上外科操作的成本低50％。

经过基本的培训之后，该方法在世界上任何地方(包括发展中国家) 都是可重复的，因为所有所使用的材料是任何实验室中常用且基本的那 些。

下文中给出的简要比较分析将显示鉴于本发明的多个实施方案的现 有技术。所述分析的目标是突出本发明的优点，其赋予用于获得请求保护 之专利主题的必要特征。

有充足的文献说明现有技术，其中很详细地描述了所使用的方法并且 以所引用的文献为基础，可与实现上述公开结论的本发明进行详细的比 较。下文中将给出所述参考文献，其可供参考。

自很久以前就开发了用于细胞培养物的不同方法，所述细胞培养物用 作出血皮肤区域的覆盖物和/或皮肤代用品。本发明产品的新颖性在于使 用同一患者的血清(自体的)由自体细胞产生，在仅三天内获得皮肤的层。 在另一种方法中，我们发现：

1.人皮肤等同物

A.供体或尸体细胞培养物

该方法不同于本发明中所开发的方法，在于样品由尸体或供体的皮肤 部分提供，并且通过低温和防腐处理需要多种化学物质和化合物，储存冷 冻的皮肤部分用于以后在对其有需要的患者中应用。这需要对供体和患者 的免疫研究以降低排斥风险。主要差异在于：

B.基于合成胶原的化合物和合成皮肤类似物

这是与我们的方法完全不同的方法，因为这些是由合成或动物化合物 产生的暂时性敷料(不是永久性的)。不从血清或人获取细胞。将产品储 存并且可以以不同的成本和商品名在市场中获得。在这些中，我们发现了 Biobrane、Transyte、Integra、Alloderm、Allograf、Apligraf和Demalogen。

2.角质形成细胞的细胞培养物

自约三十年前就已开发了细胞培养物，如今甚至可由母细胞培养出皮 肤细胞，因此可很容易地产生皮肤细胞。与其他细胞培养方法最显著的差 异是本发明在仅三天内获得具有所需大小的敷料，其具有足够的角质形成 细胞融合以用于覆盖出血区域，而在自体角质形成细胞培养物的情况中， 所述另一种方法需要至少3周。

此外，我们的方法不需要供体或额外的研究，因为我们使用来自同一 患者的细胞和血清，其他方法不这样做。

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附图简述

图1示出消化之后皮肤分离的照片。

图2是生长96小时之后角质形成细胞单层的视图。

图3示出成纤维细胞上的角质形成细胞。

图4示出具有成纤维细胞和角质形成细胞的胶原敷料的视图。

图5示出置于胶原网上的患者自体血清中的角质形成细胞和成纤维 细胞培养物。

图6示出用本发明产品治疗的腹部具有二度烧伤的56岁患者，在第 五天显示完全的上皮化。

图7A～D示出用通过本发明方法所获得产品治疗的在前臂具有烧伤 的患者。图7C示出附着第三天时敷料的外观，以及所述敷料如何随上皮 化程度提高而自身移除，直至完全松动，结果伤口如图7D所示完全愈合。

图8A～D示出对用通过本发明方法所获得产品治疗的手臂上段具有 二度深表面和深部烧伤(有残余的流血区域)的患者的评价。

图9A～D示出对用通过本发明方法所获得产品治疗的足背具有烧伤 的10岁患者的评价。6个月的随访过程显示平面的且轻度色素沉积的瘢 痕，但未显示出硬结。

发明详述

本发明涉及用于形成皮肤敷料或片的方法，所述皮肤敷料或片用于在 患者中对皮肤损失进行覆盖、使其治愈、结斑、减轻。下文中基于所提供 的示例性实施方案描述所述方法以说明本发明，从而在所有其范围和精神 内理解本发明。必须理解的是，本领域技术人员可获得多种变化方案，其 也落入本发明的范围和精神之内。所述范围仅由所附权利要求确定。

该方法总体上基于获得患者的皮肤样品和血液样品并且用这两种要 素培养皮肤，该培养的皮肤被置于胶原片上从而产生敷料，其将被进一步 用于对其有需要的患者上。所述方法包括两个可同时或顺序进行的子方 法，不过优选以同时方式进行所述子方法。一个子方法始于步骤10，用 于处理浅表皮肤，而另一种子方法同时或随后始于步骤10’。因此，将用 以下步骤描述本发明的方法：

I-＊第0天：

A-获得自体皮肤和血液样品。

1-从患者获得皮肤样品，其具有2mm²至4mm²(优选3mm²) 的面积和0.30mm至0.65mm的厚度，

2-从需要所述(自体的)皮肤的个体获得量为约20-50cm³的血液 样品。

B-消化皮肤(18小时)

3-用约2cm³至10cm³磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗所获得的皮肤 样品。

4-在4℃下将所述自体皮肤样品在0.25％胰蛋白酶溶液中放置18 小时。

C-从所述患者的血液中获得自体血清

5-将所述自体血液样品以1200rpm离心10分钟，获得10cm³至 25cm³血浆。

6-在4℃下储存所述血浆。

7-通过添加2cm³至5cm³DMEM-HG(Dulbecco改良的Eagle培 养基-高葡萄糖)、2cm³至5cm³磷酸盐缓冲溶液(PBS)和0.5cm³至2cm³ 10,000I.U.青霉素、10mg硫酸链霉素以及25/-1g两性霉 素B使所应用的胰蛋白酶失活。

II-＊第1天：

D-将自体皮肤的两层分离。(见图1)

8-随后在镊子的帮助下将自体皮肤(外植体)分离成两层：浅表 的表皮和包含胶原纤维的深层真皮。

9-用磷酸盐缓冲盐水(PBS)分别清洗所述外植物(两个皮肤层) 多次(3至10次)。＊＊＊；

E-在自体血清中培养和复制在消化之后获得的获自自体皮肤浅表层 的角质形成细胞(72h)

10-将皮肤的浅表部分收集在无菌管中；

11-将所述管以1200rpm离心10分钟。

12-弃去上清液；

13-将所产生的细胞沉淀重悬于5cm³至10cm³ DMEM-HG培养基 (Dulbecco改良的Eagle培养基-高葡萄糖)中。

14-将包含在该液体中的细胞以75,000至90,000个细胞/cm²的密度接 种在无菌盒中；

15-通过在Neubawer室(Neubawer chamber)中进行细胞计数来核 实细胞密度；

16-将所接种的细胞(角质形成细胞)在37℃下储存24小时。

F-培养和复制在消化之后所产生的获自深层的自体成纤维细胞。 10’-步骤9之后，将消化之后获得的自体皮肤的深部接种到无菌盒 中；

11’-添加2cm³至5cm³DMEM-HG(Dulbecco改良的Eagle培养 基-高葡萄糖)和2cm³至5cm³从需要皮肤之个体的血液中获得的 血浆；

12’-将所得物在37℃下储存48小时以使成纤维细胞生长。

13’-48小时之后将所接种和储存的成纤维细胞提取并放置在无菌 管中；

14’-将所述管以1200rpm离心10分钟；

15’-弃去上清液；

16’-向细胞沉淀中添加2cm³至5cm³DMEM-HG(Dulbecco改良 的Eagle培养基-高葡萄糖)和2cm³至5cm³从需要皮肤之个体的 血液中获得的自体血浆。

III-＊第2天：

G-更换自体角质形成细胞的培养基。

17-在储存24小时之后提取角质形成细胞培养物的培养液或培养 基；

18-再次应用2cm³至5cm³DMEM-HG(Dulbecco改良的Eagle 培养基-高葡萄糖)以及1cm³至10cm³自体血浆(源自患者的血 液)；

19-再次在37℃下储存24小时。(见图2)

IV-＊第3天：

H-将成纤维细胞接种在胶原网上。

20-将步骤16’中所获得的产品接种在所需大小的胶原网上；

21-核实自体成纤维细胞具有90％融合；

22-将该网置于振动台(oscillating table)上最少4小时；

23-再次在37℃下储存最少20小时；

I-将所培养的角质形成细胞接种在成纤维细胞和胶原网上(24h)(见 图3)

24-在更换培养基并对其进行储存之后24小时，使用2cm³至10 cm³磷酸盐缓冲溶液(PBS)从盒中分离角质形成细胞；

25-将具有细胞的该液体放置在无菌管中并以1200rpm离心10分 钟。

26-弃去离心所产生的上清液；

27-将细胞沉淀重悬于5cm³至10cm³自体血浆中。

28-将浸入血浆中的角质形成细胞接种到成纤维细胞和胶原网上， 同时核实它们具有250,000个细胞/cm²的密度；

29-将所接种的细胞在37℃下储存24小时；

30-然后观察融合和细胞在胶原敷料上的附着从而获得充足的自 体组织皮肤层。(见图4和5)

V-＊第4天：

J-处理用于将其自身放置在对其有需要的个体上的所述皮肤敷料。 对根据本发明方法的总结

I-＊第0天：

A-获得自体皮肤和血液样品。

B-消化皮肤(18小时)

C-从患者的血液中获得自体血清

II-＊第1天：

D-将自体皮肤的两层分离。

E-在自体血清中培养和复制在消化之后获得的获自自体皮肤浅表 层的角质形成细胞(72h)

F-培养和复制在消化之后所产生的获自深层的自体成纤维细胞。

III-＊第2天：

G-更换自体角质形成细胞的培养基。

IV-＊第3天：

H-将成纤维细胞接种到胶原网上。

I-将所培养的角质形成细胞接种在成纤维细胞和胶原网上(24h) V-＊第4天：

J-获得用于将其自身放置在对其有需要的个体上的最终产品(例 如皮肤片或敷料)。

所描述的本发明申请的方法的应用结果是用在胶原基质上生成的皮 肤形成的片或敷料。所述产品直接施加在皮肤损失区域上，这使得在患者 伤口上以清洁且快速的方式产生皮肤，从而获得这样的结果，例如以下实 施例中所描述的并于图6至9中所示的那些。

应用实施例以及在真实的案例中本发明的发展

按照以下方式治疗10位具有出血皮肤区域的患者。首先对出血区域 进行清洗和清创，这时获得3mm长的皮肤样品并抽取20cm³血液。将 这些材料送至实验室并实施上述方法。

获得样品之后三天，现在可获得具有足够细胞密度的具有成纤维细胞 和角质形成细胞的敷料以供使用(图5)。在出血区域进行另一清洗步骤， 并放置敷料，将其用纱布和透明敷料覆盖。放置该外植物之后第五天，将 其除去，发现所有被治疗患者中均出现完全的上皮化(图8和9)。

实施对患者的照片随访，从而发现用自体角质形成细胞治疗的区域表 现出更好质量的疤痕，没有硬结且没有收缩，而对于在二期中愈合的区域， 愈合显示出瘢痕的肥大(图6和7)。

实施例的结论以及应用本发明的结果

历史上已使用不同的方法处理具有出血皮肤区域的患者，而如今有从 二期愈合至异源细胞培养的不同治疗选择。已在全世界范围内开发异源性 角质形成细胞培养物，并且用于对其进行培养的方法是标准化的，但是当 处理进入宿主接受体的外源细胞时，这些需要进行免疫研究。

鉴于这样的困难，我们已开发和标准化了这样的方法：其允许从非常 小的样品获得具有角质形成细胞的敷料和自体血清且在三天中完成，在第 五天时获得完全上皮化，瘢痕与用皮肤移植物或二期愈合治疗之患者中所 示的不同之处在于所述瘢痕不显示出收缩或回缩，并且提供可行的替代方 案用于处理出血区域而在移植物供应区域上没有额外的疤痕。

通过本发明的示例性实施方案描述了本发明。必须理解的是，必须将 对本发明的所述描述理解为非限制性的，因为任何本领域技术人员能够引 入改变和修改，这些改变和修改并不超出本发明的范围和精神，本发明的 范围和精神仅由权利要求的内容所限定。