基于电导率检测的等电聚焦电泳测试结果预评估的方法

摘要

一种生物分离与分析技术领域的基于等电聚焦电泳电导率检测的蛋白样本前处理效果和实验操作是否正确评估方法，通过采用固化pH梯度胶条或非固化pH梯度胶条对经过前处理的蛋白质样品进行等电聚焦处理，根据处理期间的电迁移阶段以及扩散阶段的电流计算得到电迁移阶段以及扩散阶段的电导与时间的关系，进而通过电导率衡量蛋白质样品前处理脱盐效果和实验操作是否正确。本发明可有效识别在IEF过程中电迁移与扩散电导、蛋白质样本脱盐处理效果好坏、实验操作是否正确、以及基于固化pH梯度胶条或非固化pH梯度胶条的IEF实验，提升复杂蛋白质样品的IEF和双向凝胶电泳分析的成功率和稳定性。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物分离与分析技术领域的方法，具体是一种基于电导率检测的 等电聚焦电泳（isoelectric focusing，IEF）测试结果预评估的新方法，该方法具有识别电迁移 电流与扩散电流、识别固化pH梯度胶条（IPG strip）与非固化pH梯度胶条（non-IPG strip）、 识别蛋白样本前处理效果好坏、以及识别实验操作方法正确与错误功能的检测方法。

背景技术

等电聚焦电泳（IEF）是利用电解质在介质中创造一个pH梯度，同时利用蛋白质具有 两性解离和等电点的特点，对蛋白质进行高效分离富集（P.G.Rightti,In:T.S.Work and R.H. Rurdon,Laboraotary Techniques in Biochemistry and Molecular Bioboligy,Elsevier Biomedical  Press,Amesterdam New York Oxford,v II,1983,p.1-86,268-313）。IEF电泳技术应用广泛，它不 仅是蛋白质pI表征和纯度鉴定的标准分析技术；同时也是复杂蛋白质及其组学研究中的关键 分离方法（Nilesh S Tannu,Scott E Hemby,Nature Protocols,1(2006)1732），在双向凝胶电泳中 亦是作为关键的第一向分离技术（P.H.O′Farrell,J.Biol.Chem.250(1975)4007；Rolland AD, Evrard B,Guitton N,J.Proteome Res.6(2007)683）。

基于常规凝胶电泳的IEF技术主要有二种，包括：（i）、管式凝胶IEF技术（L.E.M.Miles, G.E.Simmons,A.Chrambach,Anal.Biochem.49(1972)109.）；（ii）、薄层凝胶IEF技术（P.G. Rightti,In:T.S.Work and R.H.Rurdon,Laboraotary Techniques in Biochemistry and Molecular  Bioboligy,Elsevier Biomedical Press,Amesterdam New York Oxford,v II,1983,p.1-86, 268-313）。但在这两种凝胶IEF电泳技术中始终存在pH梯度水平化（plateau of pH gradient,P. Arosio,E.Grana and P.G.Righetti,J.Chromatogr.,166(1978)55）和pH梯度漂移（drifting of pH  gradient,H.Rilbe,In:Electrofocusing and Isotachophoresis(Editors:B.J.Radola and D.Graeslin), Walter de Gruyter & Co.,Berlin New York,1977,p35-50），这二种现象造成的IEF不稳定性。并 且在双向凝胶电泳（two dimensional gel electrophoresis，2DE）中，由于管式和薄层凝胶IEF 的凝胶很难取出，取出后也很难完整的进行后续的转移操作；因此，基于常规凝胶的第一向 IEF分离技术很难与第二向的SDS-PAGE电泳兼容。

为了克服常规凝胶IEF技术稳定性问题以及与SDS-PAGE电泳兼容性问题，Rightti等 于上世纪八十年代发明了固定化pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）胶条以及基于IPG 胶条的IEF技术（（A.W.Postel,R.Westermeier,B.Bjellqvist,K.Ek,E.Gianazza,P.G. Righetti,Prot.Biol.Fluids30(1983)607；A.W.Postel,R.Westermeier,B.Bjellqvist,K.Ek, E.Gianazza,P.G.Righetti,Prot.Biol.Fluids30(1983)607）。由于较好地解决了传统凝胶IEF技 术稳定性和兼容性等问题，基于IPG胶条的IEF是目前应用最广泛的聚焦电泳技术，已经成 为2DE的第一向标准分离技术（Nilesh S Tannu,Scott E Hemby,Nature Protocols,1(2006) 1732）。相关的IEF技术体系、IPG胶条以及仪器设备等主要有美国GE公司通用电气医疗集 团生命科学部（http://gehealthcare.bioon.com.cn/）、美国Bio-Rad公司（http://www.bio-rad.com/）、 以及美国Inc公司（http://www.hoeferinc.com/）提供。

但不论是在常规凝胶IEF技术还是在IPG-IEF技术中始终存在成功率低、重复性差等 问题，尤其是不同来源和不同人员准备的蛋白质样品的IEF和2DE实验。究其原因，主要是 对IEF过程中电迁移和扩散产生的电流在机制上认识不深，对CA的添加及其对电迁移电流的 影响尚未阐明，对蛋白质样品前处理各种盐份的存在、及其对IEF和电流影响认识不足，尚没 有对IPG-IEF和non-IPG-IEF过程中电流产生的机制进行比较。尤其是没有对在IEF过程中的 电迁移与扩散产生的电流、蛋白质样品中盐份对IEF电流影响、IPG-IEF与non-IPG-IEF的电 流等进行比较和识别，进而形成新的相关技术体系。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于电导率检测的等电聚焦电泳测试 结果预评估的方法，根据IEF过程中电迁移和扩散阶段的电流形成机制，将电迁移电流和扩散 电流转化成电迁移电导与扩散电导，并对IEF中的电迁移电导与扩散电导进行实际对比分析， 得到电导率随时间的变化曲线。本发明可以通过监测对比起始状态下的电导大小来衡量蛋白质 样品前处理脱盐效果的好坏，或/和评判实验操作的正确与错误，预测聚焦的效果和成功率； 如起始电导过高或过低，可提前终止IEF和/或2DE实验，减少后续的损失。

根据C.X.Cao,J.Chromatogr.A813(1998)153，等电聚焦电泳过程中电迁移和扩散阶段 的电流形成机制为：在等点聚焦的起始阶段，离子i的电迁移电流其中：A表示电泳管的横截面积，F为Faraday常数，c表示当量浓度(equiv./l)，v为离子的迁移速 度v_i＝m_iE；m表示离子淌度(m²s^-1V^-1)，E为电场强度。

总电流由各种两性电解质载体（carrier ampholytes,CA）的电迁移电流与氢离子和氢氧 根离子的电迁移电流（这里忽略来自蛋白质电泳电流）为

$I_{\mathrm{EMC},\mathrm{initial}}=(\Sigma c_i{v}_i+c_{H^{+}}{v}_{H^{+}}+c_{{\mathrm{OH}}^{-}}{v}_{{\mathrm{OH}}^{-}})\frac{\mathrm{AF}}{1000},$其中：下标‘initial’表示IEF初始阶段，当有较 多盐份存在于蛋白质样品中，则在IEF开始阶段，样品中的盐份（s,salt）对起始阶段的电流贡 献很大。因此，必须考虑样品盐份的影响，即

$I_{\mathrm{EMC},\mathrm{initial},\mathrm{salt}}=(\Sigma c_i{v}_i+c_{H^{+}}{v}_{H^{+}}{c}_{{\mathrm{OH}}^{-}}{v}_{{\mathrm{OH}}^{-}}{+\mathrm{\Sigma c}}_{s,\mathrm{salt}}{v}_{s,\mathrm{salt}})\frac{\mathrm{AF}}{1000},$在IEF稳定阶段(steady-state)， 各种CA聚焦在它们的等电点位置，因此CA净淌度为零；同时各种盐份离子被电解至阳极槽和 阴极槽，没有电迁移只有扩散；然而，氢氧根离子和氢离子仍然存在。

因此有：其中：下标‘SS’为IEF的稳定状态。当胶 条体系电导和横截面积均匀，得到Svensson-Tiselius的CA_i分布微分方程其中：C_i表示摩尔浓度(moL/L)，D_i表示离子组分的扩散系数，dC_i/dx_i是被聚焦的CA_i的浓度梯 度。该微分方程表明CA_i在单位时间内电迁移流通量与扩散流通量相等。当IEF体系中的电导、 扩散系数和pH梯度恒定，则：

CA_i的浓度分布为其中：x表示在电流方向上的CA_i的 位移，C_o为x=0时的最大浓度，p为系数，可见CA_i扩散导致了自身在临近区域（如CA_i-1和CA_i+1区带）的电迁移、并形成电流，显然该电流的形成源自于CA_i扩散。这样有

利用该方程能够定义在IEF稳定状态下的CA_i扩散电流(I_DC,SS)：

$I_{\mathrm{DC},\mathrm{SS}}=c_i{m}_{i}E\frac{\mathrm{AF}}{1000}=D_i\frac{{\mathrm{dC}}_i}{{\mathrm{dx}}_i}\frac{\mathrm{AF}}{1000}·$由于IEF稳定阶段的总电流(IT,SS)为：

I_T,SS＝I_EMC,SS+I_DC,SS，因此有$I_{T,\mathrm{SS},\mathrm{non}-\mathrm{IPG}}=(c_{H^{+}}{v}_{H^{+}}+c_{{\mathrm{OH}}^{-}}{v}_{{\mathrm{OH}}^{-}}+D_i\frac{{\mathrm{dC}}_i}{{\mathrm{dx}}_i})\frac{\mathrm{AF}}{1000},$即描述了在 non-IPG-IEF中的总电流大小；下标‘non-IPG’表示non-IPG-IEF体系。

对于IPG-IEF，由于形成pH梯度的材料直接固定在凝胶基质上，所以扩散常数接近于零。 因此，对于IPG-IEF，总电流为$I_{T,\mathrm{SS},\mathrm{IPG}}=(c_{H^{+}}{v}_{H^{+}}+c_{{\mathrm{OH}}^{-}}{v}_{{\mathrm{OH}}^{-}}+{\mathrm{\alpha D}}_i\frac{{\mathrm{dC}}_i}{{\mathrm{dx}}_i})\frac{\mathrm{AF}}{1000},$其中：下标‘IPG’ 表示IPG-IEF体系，进一步地：即在IEF电迁移阶段，蛋白 样品中存在的盐份对电泳电流的贡献。

由于在IEF过程中，电压或电场强度是渐进性增加的，因此利用总电流以及稳定阶段的 总电流方程除以不同时间的电场强度E，则得到电迁移阶段的电导：

${\kappa }_{\mathrm{EMC},\mathrm{inital}}=\frac{I_{\mathrm{EMC},\mathrm{inital}}}{E}={(\mathrm{\Sigma c}}_i{v}_i+c_{H^{+}}{v}_{H^{+}}+c_{{\mathrm{OH}}^{-}}{v}_{{\mathrm{OH}}^{-}})\frac{\mathrm{AF}}{1000E},$扩散阶段的non-IPG聚焦电泳电 导：${\kappa }_{T,\mathrm{SS},\mathrm{non}-\mathrm{IPG}}=\frac{I_{T,\mathrm{SS},\mathrm{non}-\mathrm{IPG}}}{E}(c_{H^{+}}{v}_{H^{+}}+c_{{\mathrm{OH}}^{-}}{v}_{{\mathrm{OH}}^{-}}+D_i\frac{{\mathrm{dC}}_i}{{\mathrm{dx}}_i})\frac{\mathrm{AF}}{1000E},$以及

扩散阶段的IPG聚焦电泳电导：${\kappa }_{T,\mathrm{SS},\mathrm{IPG}}=\frac{I_{T,\mathrm{SS},\mathrm{IPG}}}{E}(c_{H^{+}}{v}_{H^{+}}+c_{{\mathrm{OH}}^{-}}{v}_{{\mathrm{OH}}^{-}})\frac{\mathrm{AF}}{1000E};$

将初始阶段含有盐份样品的总电流和不含有盐分样品的总电流之差除以不同时间的电 场强度E，则可以得到电迁移阶段的蛋白质样品中盐份对电导的贡献：

${\mathrm{\Delta \kappa }}_{\mathrm{EMC},\mathrm{initial},\mathrm{salt}}=\frac{{\mathrm{\Delta I}}_{\mathrm{EMC},\mathrm{initial},\mathrm{salt}}}{E}=\frac{\mathrm{AF}}{1000E}\Sigma c_{s,\mathrm{salt}}{v}_{s,\mathrm{salt}}·$

上述不同时间的电场强度E根据IEF测试过程中胶条长度或两电极距离L已知、不同时间 使用的电压可以记录，因此可以得到同时可以通过串联电流计测定每个胶条电 流随时间的变化，即I_exp＝f(t)，因此有

本发明通过以下技术方案实现，本发明通过采用固化pH梯度胶条或非固化pH梯度胶 条对经过前处理的蛋白质样品进行等电聚焦处理，根据处理期间的电迁移阶段以及扩散阶段的 电流计算得到电迁移阶段以及扩散阶段的电导与时间的关系，进而通过电导率变化衡量蛋白质 样品前处理脱盐效果及操作正确与否。

所述的前处理的蛋白质样品是指：利用透析脱盐、凝胶过滤脱盐或超滤脱盐及其对应 不同脱盐程度处理的样品，之后冷冻干燥备用。

所述的固化pH梯度胶条或非固化pH梯度胶条是指：采用被动水化方式，选择胶条长 度为7cm，胶条pH为3-10，水化12h；上样量为100μg/条，上样体积为125μL/条；环境温 度：25度；测试控温：18度。

所述的等电聚焦电泳是指：将固化pH梯度胶条或非固化pH梯度胶条浸渍于经过样本 前处理的蛋白质样品后，两端与可控电压源的正负极相连组成回路，通过调整电压源的输出得 到胶条两端的电压，通过串联电流计检测该过程中回路中的电流。

所述的调整电压源的输出是指：

当采用固化pH梯度胶条时，按以下步骤调整电压：

1：电压：4000V，升压方式：大约在3.5小时至5.5小时之间的升压，时间电压积：15000 Volt Hr；

2：电压：500V，恒压。

当采用非固化pH梯度胶条时，按以下步骤调整电压：

i：电压：500V，升压方式：从0V到500V之间的线性升压，升压时间：5h；

ii：电压：2000V，电压调节方式：从500V到2000V之间的快速升压，时间：5min；

iii：电压：200V，恒压，时间：在0小时至8小时之间。

所述的电迁移阶段以及扩散阶段的电导与时间的关系是指：

当采用固化pH梯度胶条时：或者是：

当采用非固化pH梯度胶条时：${\kappa }_{\exp ,\mathrm{non}-\mathrm{IPG}}=\frac{L_{\exp ,\mathrm{non}-\mathrm{IPG}}}{V_{\exp ,\mathrm{non}-\mathrm{IPG}}}f\left(t\right)$

其中：f(t)＝I_exp，即通过电流计测得的回路中电流随时间的变化；V_exp,non-IPG以及V_exp,IPG为等电聚焦过程中胶条两端的电压；L_exp,non-IPG以及L_exp,IPG为胶条长度。

所述的通过电导率衡量蛋白质样品前处理脱盐效果和/或IEF实验操作的正确如否是 指：

当采用固化pH梯度胶条时：在标准条件，即蛋白质样品无盐，如0.5%CA且蛋白质 样品无盐的情况下，蛋白质样品IPG-IEF对应的起始电导率变化从0.008μS/cm到0.02μS/cm 之间，持续时间在5分钟至30分钟之间。当蛋白样品中的盐份很高，IPG-IEF起始电导率会 超过0.02μS/cm，此时IEF的聚焦效果一般较差，成功率低。当蛋白样品IPG-IEF起始电导率 低于0.008μS/cm，则说明此测试胶条水化不完全，和/或电极接触不良，和/或上样成分漏加或 误加等偶然原因，此时IEF分离一般较差，成功率很低，应及时纠正或终止实验。

当采用非固化pH梯度胶条时：在标准条件，即蛋白质样品无盐，如2.0%CA且蛋白 质样品无盐的情况下，蛋白质样品non-IPG-IEF对应的起始电导率变化从0.04μS/cm到0.2 μS/cm之间，持续时间在5分钟至40分钟。当蛋白样品non-IPG-IEF起始电导超过0.2μS/cm， 说明此样品中含有较高浓度的盐类，此时IEF的聚焦效果一般较差，成功率低。当蛋白样品 non-IPG-IEF起始电导低于0.04μS/cm，则说明此测试胶条水化不完全，和/或电极接触不良， 和/或上样成分漏加或误加等偶然原因，此时IEF分离不完全，成功率很低，应及时纠正或终 止实验。

附图说明

图1为实施例等电聚焦装置示意图；

图中：1可调控的直流电源、2已知长度为L的IEF胶条、3电流测量装置、4为电压测 量装置、5电导率随时间的变化曲线示意图。

图2为标准IPG-IEF测试时电导随时间变化的对比分析示意图；

图中：pH3-10胶条，0.5%pH3-10CA，电极距离6.3cm。

图3为标准non-IPG-IEF测试时电导随时间变化的对比分析示意图；

图中：pH3-10胶条，2.0%pH3-10CA，电极距离6.3cm。

图4为IPG-IEF和non-IPG-IEF测试时电导率随时间变化的对比分析示意图。

图5为IPG-IEF蛋白样品电导率运行曲线示意图。

图6为non-IPG-IEF蛋白样品电导率运行曲线示意图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施， 给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。在下列 的测试中未注明具体的测试方案和过程，一般条件下需按照常规条件，或者是按照相关的仪器 指标或厂商建议的进行操作。

由于样品和原始材料的生物学缓冲特性，为了得到双向凝胶电泳最佳的测试结果，蛋白 质样品除盐是相当重要的。通常情况下，最佳的对各种类型的样品除盐方法必须通过经验来决 定。常见的除盐方法有超滤、透析和凝胶过滤等。处理好的样品可进行IEF分离，需要选择适 合于蛋白样品也适合于该样品加样的pH值范围。第一向分离过程包括胶条的水化、加样和等 电聚焦电泳。

在IPG胶条测试中，IEF是在高压（达3500V-4000V）下进行的。胶条由于其内离子 强度低，从而使电泳过程中电流非常低（往往低于50μA）。为了保证有效聚焦时间，典型等 电聚焦方法往往在进行IEF时要通过一系列的电压增加步骤，最终达到所希望的聚焦电压，并 且在此电压下维持一段时间。同时由于样品带电成分逐渐达到平衡点而导致电流下降。由于两 个参数电压和电流在这一过程中都在变化，在判定测试聚焦效果及聚焦进程时往往进入误区。 这里用一关键参数-电迁移电导率-来表述这一聚焦过程，起始电导率为较大值，随着IEF测试 的进行，电迁移电导率快速下降，然后缓缓减少，趋于某一恒定值。此时预示样品聚焦已经完 成，该处的电导是扩散电导所致。

在non-IPG胶条测试中，IEF是在低压（500V）下进行的。测试起始电导同样为较大值， 随着IEF测试进行，电导率迅速下降，然后缓缓减少，趋于某一恒定值。这一阶段主要是各种 离子（尤其是较高浓度的两性电解质）在IEF时的电迁移过程，这一过程对应显著的电迁移电 导率的变化。

实施例1

高盐蛋白质样品的IPG-IEF测试识别

步骤一、蛋白样品的获取：利用透析脱盐或凝胶过滤脱盐或超滤脱盐，选择不同脱盐程 度处理的样品，之后冷冻干燥。备用。

步骤二、IPG胶条的处理及加样：水化方式：被动水化；胶条类别：IPG Strips；胶条 长度：7cm；胶条pH：3-10；水化时间在12h左右；上样量：100μg/条；上样体积：125μL/ 条；环境温度：25度；测试控温：18度。

步骤三、IEF测试程序

如图1所示，在整个IEF测试中，通过电压和电流测定装置分别得到在不同时间的电压 和电流数据：

3.1：电压：4000V，升压方式：大约在3.5小时至5.5小时之间的升压，时间电压积： 15000Volt Hr。

3.2：电压：500V，恒压。

步骤四、测试电导率实时在线检测：利用方程

计算电导率，实时得到电导率随时间的变化曲线示意图。

如图2所示，为标准IPG-IEF测试时电导率随时间变化的对比分析（pH3-10胶条，0.5% pH3-10CA，电极距离6.3cm）。不同蛋白质样品的IPG-IEF测试时，起始时的电导率为较大 值，随着IEF测试进行，电导率迅速下降，然后缓缓减少，趋于一恒定值。这一阶段主要是各 种离子在IEF时的电迁移过程，这一过程对应电迁移电导的变化。在标准条件下得到标准 IPG-IEF电导随时间变化关系（以pH3-10胶条、0.5%pH3-10CA、电极距离6.3cm的测试为 例）：电迁移电导率变化从0.02μS/cm到0.002μS/cm之间，持续时间在0min到75min之间； 扩散电导在0.001μS/cm至0.003μS/cm，持续时间在75min到600min或者更长。

标准条件下，蛋白质样品IPG-IEF对应的起始电导率变化从0.008μS/cm到0.02μS/cm 之间。当蛋白样品IPG-IEF起始电导率超过0.02μS/cm，说明此样品中含有较高浓度的盐类， 此时IEF的聚焦效果一般较差，成功率低。而当蛋白样品IPG-IEF起始电导率低于0.008μS/cm， 则说明此测试胶条水化不完全，和/或电极接触不良，和/或上样成分漏加或误加等偶然原因， 此时IEF的实验成功率很低，应及时纠正或终止测试。

因此，对于IPG-IEF电泳测试，可以通过监测对比起始状态下的电导率大小来衡量蛋 白质样品前处理脱盐效果的好坏，和/或实验操作的正确与错误，预测聚焦的效果和成功率； 如起始电导过高或过低，均是不当甚至错误实验的信号，此时可提前终止IPG-IEF测试，减少 后续的损失。

如图5所示，为高盐蛋白样品和蛋白标准品的IPG-IEF测试时电导率随时间变化的对 比分析。可以看出，高盐与标准蛋白样品起始电导率差别较大，随着IEF测试进行，电导率迅 速下降，然后缓缓减少，趋于一恒定值。这一阶段主要是各种离子在IEF时的电迁移过程，这 一过程对应于电迁移电导的变化。在高盐蛋白质样品的IPG-IEF测试时，起始电导较大（超过 0.02μS/cm），IEF结束后，所得胶条蛋白质区带十分模糊，且区带较少。转入SDS-PAGE，所 得能识别的二维电泳图谱蛋白斑点明显较少，且模糊。而标准蛋白质样品对应的IPG-IEF测试 电导率曲线时，起始电迁移电导率在标准IPG-IEF电迁移起始电导率范围在0.008μS/cm至0.02 μS/cm之间。IEF结束后，所得胶条蛋白质区带十分清晰，且区带条数较多。转入SDS-PAGE， 所得能识别的二维电泳图谱蛋白斑点较多。所以，在高盐蛋白导致的高电流条件下，IEF的聚 焦效果一般较差，成功率低。因此，对于IPG-IEF电泳测试，可以通过监测对比起始状态下的 起始电迁移电导率大小来衡量蛋白质样品前处理脱盐效果的好坏，预测聚焦的效果和成功率； 当测试运行开始时电导率过高，可提前终止IPG-IEF测试，减少后续的损失。而当蛋白样品 IPG-IEF起始电导低于0.008μS/cm，则说明此测试胶条水化不完全，和/或电极接触不良，和/ 或上样成分漏加或误加等偶然原因，此时IEF的实验成功率很低，应及时纠正或终止测试。

实施例2

高盐蛋白质样品的non-IPG-IEF测试识别

步骤一、蛋白样品的获取：利用透析脱盐或凝胶过滤脱盐或超滤脱盐，选择不同脱盐程 度处理的样品，之后冷冻干燥。备用。

步骤二、non-IPG胶条的处理及加样：水化方式：被动水化；胶条类别：non-IPG Strips； 胶条长度：7cm；胶条pH：3-10；水化时间：12h左右；上样量：100μg/条；上样体积：125μL/ 条；环境温度：25度。

步骤三、IEF测试程序：

3.1：电压：500V，升压方式：0V-500V的线性升压，时间：5h左右。

3.2：电压：2000V，电压调节方式：从500V到2000V之间的快速升压，时间：5min；

3.3：电压：200V，恒压，时间：在0小时至8小时之间。

如图3所示，为标准non-IPG-IEF测试时电导率随时间变化的对比分析（pH3-10胶条， 2.0%pH3-10CA，电极距离6.3cm）。不同蛋白质样品的non-IPG-IEF测试时，起始时的电导 率为较大值，随着IEF测试进行，电导率迅速下降，然后缓缓减少，趋于一恒定值。这一阶段 主要是各种离子在IEF时的电迁移过程，这一过程对应电迁移电导率的变化。在标准条件下得 到标准non-IPG-IEF电导随时间变化关系（以pH3-10胶条、2.0%pH3-10CA、电极距离6.3cm 的测试为例）：电迁移电导率变化从0.20μS/cm到0.01μS/cm之间，持续时间在0min到150min 之间；扩散电导率在0.003μS/cm至0.01μS/cm之间，持续时间在150min到600min之间或 者更长。

在标准条件下，蛋白质样品non-IPG-IEF对应的起始电导率变化从0.04μS/cm到0.2 μS/cm之间，持续时间在5分钟至40分钟之间。当蛋白样品non-IPG-IEF起始电导率超过0.2 μS/cm，说明此样品中含有较高浓度的盐类，此时IEF的聚焦效果一般较差，成功率低。而当 蛋白样品non-IPG-IEF起始电导低于0.04μS/cm，则说明此测试胶条水化不完全，和/或电极接 触不良，和/或上样成分漏加或误加等偶然原因，此时IEF的实验成功率很低，应及时纠正或 终止测试。

因此，对于non-IPG-IEF电泳测试也可以通过监测对比起始状态下的电导率大小来衡 量蛋白质样品前处理脱盐效果的好坏，或/和评判实验操作的正确与错误，预测聚焦的效果和 成功率；如起始电导率过高或过低，均可提前终止non-IPG-IEF测试，减少后续的损失。

如图6所示，为高盐蛋白样品和蛋白标准品的non-IPG-IEF测试时电导率随时间变化 的对比分析。可以看出，高盐与标准蛋白样品起始电导差别较大，随着IEF测试进行，电导率 迅速下降，然后缓缓减少，趋于一恒定值。这一阶段主要是各种离子在IEF时的电迁移过程， 这一过程对应于电迁移电导的变化。在高盐蛋白质样品的IPG-IEF测试时，起始电迁移电导率 较大（超过0.2μS/cm），IEF结束后，所得胶条蛋白质区带十分模糊，且区带较少。转入 SDS-PAGE，所得能识别的二维电泳图谱蛋白斑点明显较少，且模糊。而标准蛋白质样品对应 的non-IPG-IEF测试电导率曲线时，起始电导在标准non-IPG-IEF电迁移起始电导率范围内 （0.04-0.2μS/cm）。IEF结束后，所得胶条蛋白质区带十分清晰，且条数较多。转入SDS-PAGE， 所得能识别的二维电泳图谱蛋白斑点较多。所以，在高盐蛋白导致的高电流条件下，IEF的聚 焦效果一般较差，成功率低。而当蛋白样品non-IPG-IEF起始电导低于0.04μS/cm，则说明此 测试胶条水化不完全，和/或电极接触不良，和/或上样成分漏加或误加等偶然原因，此时IEF 的实验成功率很低，应及时纠正或终止测试。因此，对于non-IPG-IEF电泳测试，可以通过监 测对比起始状态下的起始电迁移电导率大小来衡量蛋白质样品前处理脱盐效果的好坏，和/或 上评估IEF操作的正确与错误，预测聚焦的效果和成功率；当测试运行开始时电导率过高或过 低，可提前终止non-IPG-IEF测试，减少后续的损失。

综上，如图4所示，为IPG-IEF和non-IPG-IEF测试时电导率随时间变化的对比分析。 无论是non-IPG-IEF还是IPG-IEF测试，起始时的电导率同样为较大值，随着IEF测试的进行， 电导快速下降，然后缓缓减少，趋于某一恒定值。一般的IPG-IEF测试时起始电迁移电导率为 0.008-0.02μS/cm；达到聚焦稳定状态的条件下，扩散电导率较低，一般在0.001-0.003μS/cm 波动，持续75-600分钟或更长。一般的non-IPG-IEF测试时起始电迁移电导率曲线为0.04-0.2 μS/cm之间；扩散电导率维持在0.003-0.01μS/cm处波动，持续150-600分钟或更长。因此， 通过电迁移电导率、起始电迁移电导率、扩散电导率和电迁移电导率持续时间的对比分析，能 够识别区分IPG-IEF和non-IPG-IEF的电泳聚焦测试。