用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统及分离方法

摘要

提供一种用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统及分离方法。用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统包括流动相储罐、第一输液装置和第二输液装置、第一进样装置和第二进样装置、分离装置、集存装置、至少两个排液装置和流路切换装置。在实施每一维液相色谱分离时，该集存装置收集需要进行下一步液相色谱分离的目标中间馏分并将其储存在集存器中；在第二维或更多维的液相色谱分离时，通过第二进样装置的进样混合器使来自集存器的全部目标中间馏分与流动相混合，并用该第一输液装置和第二输液装置对其输送的流动相的量进行调节和计量，使得该进样混合液中的洗脱剂浓度低于该目标中间馏分中所有需要在该维分离中保留的目标蛋白的临界迁移洗脱剂浓度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统，具体地，涉及一种用于蛋白在线快速分离的多维液相色谱分离系统。本发明还涉及使用该液相色谱分离系统进行蛋白分离的分离方法。

背景技术

液相色谱是分析、分离和纯化蛋白最有效的方法，其广泛应用于从天然的动植物体液提取和分离活性蛋白，及基因工程生产的各种重组蛋白药物的制备和生产，也是生化实验室必不可缺的设备，如在蛋白组学研究中为寻找“标记”蛋白的蛋白及多肽分离。由于这样的生物大分子所存在的环境成分十分复杂，通常称之为复杂成分中的生物大分子的分离和分析。色谱柱是色谱分析的核心。科学家一直在尽力提高色谱柱效以用一根色谱柱就能解决一般较复杂的物质分离和分析问题。对分离小分子溶质而言，液相色谱柱的理论塔板数一般为10⁴-10⁵。然而，对于更复杂混合物的分析，比如细胞中的成份、体液及动物组织中成分的分离，目前商品色谱柱的分离度远远达不到要求，因此必须要用二维液相色谱法（2D-LC）或多维液相色谱法（mD-LC）才能部分地解决这些问题。2D-LC和mD-LC技术已经成为当前色谱研究的热点和未来发展的方向。

进行2D-LC和mD-LC分离有离线（off-line）和在线（on-line）两种方式。

早期的2D-LC分离法主要是离线的方式，就是将一维液相分离后的馏分收集后对该一维馏分，或不经过处理直接进一少部分样，或须进行处理（浓集或缓冲液交换）后，再将其一部分，或全部进样到第二维色谱柱进行分离。离线方式具有费时、难于操作、样品易污染、回收率低和重复性差等缺点。

为适应2D-LC和mD-LC法的研究，多个公司都开始开发在线模式的2D-LC和mD-LC法，很快就生产了这种类型的色谱仪。但原则上这些色谱仪都是在已有色谱仪的基础上加以改进，增加了一组并联的色谱柱（2-3根），且在这些并联色谱柱之间加上切换接口，以使从一根色谱柱流出的馏分能在线地转到另一个柱以进行下一个模式分离。然而，这些在线2D-LC和mD-LC法存在着诸多问题，例如不同模式的色谱的组合需要解决流动相兼容性的问题，接口衔接也是很关键的技术问题。

mD-LC技术中的切换接口是整个系统的关键。常用的有样品环交替储存转移样品、平行柱交替富集分析样品和捕集柱富集样品以及无接口的整体两根色谱柱。然而这些仪器均存在致命的缺陷。有接口的在线2D-LC和mD-LC用液相色谱仪均只能将一维收集的样品的1-10%进样（仅限几微升）到第二维色谱分离，无法用其于蛋白质制备，尤其是无法实施工业化生产；而无接口的这种混合模式柱的两种流动相必须兼容，只能在一些特定情况下，如强阳离子交换色谱（SCX）填料在前，反相液相色谱（RPLC）填料在后的情况下方可实现如此的在线二维分离，如果二者填充顺序相反，则该无切换器法就无法使用。

在此科学发展的背景下，科学家又提出了“混合模式色谱”（mixed-modechromatography，MMC）法，即在液相色谱中同时应用两种或两种以上的作用力使溶质进行保留和分离的色谱方法。该方法具有更高的选择性和高色谱柱负载量，这为半制备和制备型色谱的发展提供了新的选择和思路。然而，与传统的色谱柱只能用于由一种力控制的一种分离模式比较，因其还是以一种作用力为主，而另外一种作用力为辅，从而达到改善该主分离里的效果，故也只能达到“一柱一用”的效果。

早在上世纪的80年代初，Guiochon等人（Chromatographia，第17卷，第3期，第121-124页，1983）提出了用二维色谱柱实施2D-LC的方法。因其所称的二维是指空间上的二维（平面）色谱，其二维色谱柱为方形（10cm x 10cm），如同通常的薄层色谱版，且申请了专利，但未得到推广，甚至未见到任何用于实际的报道。而通常讲的二维色谱法指的是用圆柱形的色谱柱。在两年前，本专利的申请人等使用了圆柱形二维色谱柱提出了“在线蛋白单柱二维液相色谱法”，在普通色谱仪上加了几个阀门和几个螺旋形的样品环后，用一根圆柱形的二维色谱柱对蛋白实施了2D-LC分离，达到了快速分离的目的。然而该方法还存在以下几个问题：（1）因受色谱仪最大流速（仅为5毫升/分钟）和集存装置中每个集存管的最大体积（仅为5毫升）的限制，其仅能在分析规模上进行，无法放大到制备规模，更无法再放大到生产规模；（2）因该仪器只用一根色谱柱分离蛋白，无法实施只有用多个色谱柱才能进行的mD-LC法纯化的高纯度（如注射胰岛素的纯度要求蛋白＞99%）的目的；（3）因无强有力的理论支持，只能凭借经验，用手动进行操作，无法设计程序用计算软件控制，而这又是当今现代化仪器的必要条件，且未包括多肽在应用范围之内；（4）所用色谱柱是专门制备的“2D-LC”，尚无商业化产品，其他人难以实施；以及（5）更为重要的是，所有支持该方法实施的只是几种设备的附件，在现有色谱仪上的无序拼凑，既无对制造一种新设备的整体构思的框架，也没有任何可供实施的技术方案和技术参数。与用平板形2D色谱柱来实施2D-LC相比较，用圆柱形2D色谱柱（简称2D柱）具有更多的优点。

尽管如此，该色谱法又有潜在的如下优点：蛋白的2D-LC分析的全部操作，包括收集从第一分离模式的流出液到这些流出液的收集并储存、在高流速条件下的在线缓冲溶液的交换和色谱系统的再平衡以及二次进样到该同一个二维色谱柱后，用第二分离模式的分离，均在一封闭的体系中进行，从而实现了“在线蛋白的单柱二维色谱快速分析”。该体系的特征是它不仅能防止环境的污染，而且目标蛋白可定量地，完全地转移到第二维色谱分离，如此可将蛋白组学中的低丰度功能蛋白的检测下限，或灵敏度提高10-100倍，将会大大加快当今的蛋白组学的“自上而下-质谱分析”策略的速度。如采用MMC中的混合模式柱，因其柱负荷又较通常色谱柱高很多，将其用在蛋白药物的大规模生产，会大大的节约成本。

考虑到该方法的潜在优点，申请人通过深入研究，在原有基本属零件的“堆积”的基础上研究开发了一种新的现代化的用于蛋白分离的新型设备——蛋白多维液相色谱纯化系统。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的多维液相色谱分离系统以及利用该系统分离和纯化蛋白和多肽的新方法，其能够实现包括多肽在内的蛋白（以下简称为蛋白）的在线快速分析、分离和规模化制备，从缩短纯化工艺，提高二维及多维分离中各蛋白速度和回收率，防止来自环境的污染，减少分离过程的耗时和成本。

申请人最近发现，在反相液相色谱（RPLC）、疏水相互作用色谱（HIC）、亲合色谱（AFC）、离子交换色谱（IEC）四类液相色谱模式中，在线性梯度洗脱条件下对蛋白进行液相色谱分离时，蛋白在色谱柱中的保留行为存在着“停滞-迁移”的普遍现象，而且每种蛋白都有自己特有“停滞-迁移”区域或时间空间。换言之，当流动相中洗脱剂的浓度小于某个蛋白的临界迁移洗脱剂浓度C_CMP时，该蛋白就不会从色谱柱中被洗脱。当洗脱剂的浓度逐渐升高达到C_CMP时，蛋白才会依他们各自的“停滞-迁移”的空间，逐个被移动并被洗脱。该临界迁移洗脱剂浓度C_CMP对应的保留时间为临界迁移时间t_CMP。因此从梯度开始（t＝0）到t_CMP之间的时间空间，就为实施蛋白分离纯化提供了进行各种色谱分离的辅助操作空间。只要是在线性浓度梯度洗脱条件保持不变的前提下，只要进入色谱柱的流体中洗脱剂的浓度低于C_CMP，蛋白的保留时间就将保持不变。

下面以图1为例来说明蛋白的“停滞-迁移”现象。

图1所用的是一长1mm,直径10mm的饼形色谱柱，又称色谱饼，其中图1A、图1B和图1C分别为联苯、碳酸酐酶和十五肽（GEPPPGKPADDAGLV）在非同步进样条件下在RPLC线性梯度洗脱中的色谱图，而图1D、图1E和图1F分别表示联苯、碳酸酐酶和十五肽的保留时间与其非同步进样时间之间的关系。其中所采用的色谱条件为：色谱饼（10mm x 1mm内径），装填RPLC填料（颗粒直径3μm，孔径30nm）；流动相为乙腈-水（0.1%三氟醋酸）。

在RPLC线性梯度洗脱条件（洗脱剂为乙腈-水溶液）下，分别对小分子溶质联苯、生物大分子碳酸酐酶和十五三种样品进行非同步进样（即在梯度开始后经过每推后一定的间隔时间（图1中为1分钟），换言之，该样品是在不同的洗脱剂浓度下进样的）下的液相色谱分离，所得的色谱图分别如图1A、图1B和图1C所示，将上述三种样品的保留时间t_R对线性梯度时间t（下横座标）和洗脱剂浓度C_MeCN（上横座标）作图，所得的保留行为曲线如图1D、图1E和图1F所示。可见，作为小分子化合物的联苯与作为碳酸酐酶以及作为多肽的十五肽均表现出了两种完全不同的保留行为。碳酸酐酶和十五肽的保留行为曲线具有明显的水平直线部分和上升部分，两部分之间存在着明显的拐点，该拐点在图1D和1E中以箭头标出，称作“临界迁移点”，其在上下横坐标上的对应数值分别为碳酸酐酶和十五肽在RPLC下的“临界迁移时间t_CMP”和“临界迁移洗脱剂浓度C_CMP”。当进样滞后于梯度的时间t小于t_CMP时（即当洗脱剂乙腈的浓度低于C_CMP时），碳酸酐酶和十五肽不会被洗脱，而当进样滞后于梯度的时间，既t_i大于t_CMP时（即当洗脱剂乙腈的浓度高于C_CMP时），碳酸酐酶和十五肽才会从色谱饼上洗脱，这就是蛋白和多肽在色谱饼，或色谱柱上的“停滞-迁移”现象。正是由于蛋白和多肽在色谱饼或色谱柱上的这种“停滞-迁移”现象的发现，才会为在如此薄的色谱饼上进行蛋白和多肽的快速和高效分离奠定了理论基础。

根据上述发现，本申请提出一种新型多维液相色谱分离系统以及使用此系统分离蛋白的方法。

因此，本发明的一个方面是提供一种用于蛋白分离的mD-LC分离系统，该mD-LC系统包括检测装置，其特征在于，所述mD-LC分离系统包括：

（1）流动相储罐，其用于储存多维液相色谱分离的流动相的液体；

（2）第一输液装置和第二输液装置，所述第一输液装置和第二输液装置彼此独立地从所述流动相储罐取出适用于液相色谱分离的流动相并将该流动相输送至所述多维液相色谱分离系统中指定的流路中，并且可彼此独立地调节和计量流量；

（3）第一进样装置和第二进样装置，所述第二进样装置还包括进样混合器；

其中，第一进样装置可使用六位进样阀，用于进原样；而第二进样装置则用于二维及多维色谱纯化过程；

（4）分离装置，其包括色谱柱切换单元和n根色谱柱，或者包括具有m种以上的q根分离功能的色谱柱，其中所述色谱柱切换单元使进入所述分离装置的液体选择性地流入所述n根色谱柱中的一根色谱柱，n为非负整数，m为所述多维液相色谱分离系统中所用的不同分离模式的数量，并且n与m之间满足下式：

m≥n                            （式1）

当使用q根混合模式色谱柱并实现m个（m≥2）分离模式进行有效分离时

n=m-q_i                          （式2）

其中，i为正整数，q为具有m种分离模式的色谱柱个数；

（5）集存装置，其包括p个集存装置切换单元，其中p大于或等于1，所述集存装置使进入所述集存装置的液体选择性地流入所述集存装置中的至少一个集存装置；

（6）至少二个排液装置，所述mD-LC分离系统中的液体从所述排液装置排出至系统外；

其中，作为所述第一进样装置的六位进样阀的排液孔可作为所述多维液相色谱分离系统的第一排废装置；同时，第二排液装置既可用于馏分收集，也可用于排出废液；

（7）流路切换装置由与上述装置相连的阀门和管路连接所组成，通过对所述流路切换装置中的阀门进行切换，所述流路切换装置除了形成常规液相色谱分离中的流路外，还形成用于进行mD-LC分离的流路；

其中，在第一维分离时，所述第一输液装置将适用于该第一维分离的流动相输送至第一进样装置，所述第一进样装置从系统外引入包含待分离蛋白的待分离样品（原样）并使其随来自第一输液装置的流动相一同进入所述分离装置，所述分离装置对该待分离样品进行第一维液相色谱分离并由此得到不同的馏分；

在每一维分离时，通过所述集存装置收集经分离后得到的不同馏分中需要进行进一步液相色谱分离的中间馏分并将该中间馏分储存在至少一个集存装置中，并将不需要进一步分离的馏分通过所述排液装置从系统中排出；

在第二维或更多维分离时，所述第一输液装置将适用于液相色谱分离的，具有合适组成的流动相送至所述集存装置并将其储存于所述至少一个集存装置中的一种中间馏分的全部，或部分随着该流动相一同被输送至所述进样混合器中，所述第二输液装置从所述流动相储罐取出适用于液相色谱分离的，具有合适组成的流动相并将该流动相输送至所述进样混合器中，所述进样混合器使来自所述至少一个集存装置的中间馏分的全部，或部分和流动相与来自所述第二输液装置的流动相混合从而得到具有合适组成的第二维进样混合液，所述分离装置再对所述进样混合液进行第二维或更多维的液相色谱分离并由此得到不同的二维分离后馏分。

其中，所述第一输液装置和第二输液装置对其输送的用于第二维或更多维分离的所说的具有合适组成的流动相的量，是由调节和计量，从而使得用于第二维或更多维分离的所述进样混合液中的洗脱剂浓度低于该进样混合液所包含的中间馏分中的所有需要在该第二维或更多维分离中得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度。

在周期性清洗色谱系统时，可将强洗脱液接入任何一个管路和装置中。例如，当该色谱系统或部分分离装置需要周期性清洗时，该第一和第二输液系统可输送任何强洗脱溶剂。

在本申请中，“蛋白”也包括作为蛋白、人工合成多肽以及蛋白的水解产物的多肽，“蛋白样品”、“原样”是指包含目标蛋白及多肽的混合物。

在本申请中，“分离”是指液相色谱分离。

在本申请中，液相色谱的“分离模式”与“分离机理”是同义词。

在本申请中，如众所周知的，液相色谱分离的“维”数是指在该液相色谱分离流程中所实施的液相色谱所用圆柱形色谱柱的不同分离模式数（即待分离的样品进入圆柱形液相色谱柱用不同分离模式进行分离的次数），“多维液相色谱”是指包括二维液相色谱在内的和多于二维的更多维液相色谱（例如三维液相色谱），换言之，“mD-LC”也包括“2D-LC”。

在本申请中，“色谱柱”是指圆柱形液相色谱柱（简称色谱柱），“具有i种分离模式的色谱柱”是指具有i种分离模式并可用于i种不同的分离过程的液相色谱柱。本领域技术人员容易理解，当i=1时，该色谱柱为仅具有一种液相色谱分离模式，从而可用于一种分离过程的色谱柱（本申请中称作“一维色谱柱”）；当i≥2时，该色谱柱为具有两种或更多种液相色谱分离模式，从而可用于两种或更多种不同的分离模式的一根色谱柱（本申请中也称作“混合模式，或混合模式色谱柱（MMC柱）”）。在极个别情况下，如RPLC分离多肽，也可实施单一模式的二维色谱分离。

在本申请中，如众所周知的，“馏分”是指将进入色谱柱的液相分离后得到的具有不同保留时间目标产品的部分。“中间馏分”指经上一维分离后得到的各馏分中还需要进行进一步分离的目标产品馏分。

在本申请中，“适用于液相色谱分离的流动相”是指该流动相能够作为某一维液相色谱分离中的流动相而使得相应的蛋白得以分离。对于本领域技术人员而言，结合待分离蛋白的性质、分离时所选用的色谱原理以及所用色谱柱的种类来确定合适流动相的方法是公知的。

以处理量的不同来区分，根据本发明的多维液相色谱分离系统可用于分析用途（分析型多维液相色谱分离系统小于10mg）、并制备用途（半制备型mD-LC分离系统）10mg至100mg,制备级100mg至100g，生产用途（生产型mD-LC分离系统）大于>100g。本领域技术人员容易理解，用于上述不同用途的mD-LC分离系统中的各个装置将具有不同的尺寸。对于制备和生产用途的mD-LC分离系统而言，本说明书中的术语“进样”可理解为“进料”，“样品”可理解为“原料”，“产物”可理解为“产品”。

流动相储罐

所述用于储存流动相的流动相储罐是本领域技术人员所公知的。本领域技术人员容易理解，流动相储罐的数量与本发明的mD-LC分离系统中所用的流动相种类和规模相关。相对于常规液相色谱分离系统，本发明的液相色谱分离系统所用的流动相种类更多，因此所需要的流动相储罐数量也较多，例如，根据本发明的二维液相色谱分离系统需要使用≥4种不同的流动相溶液，则可包括4个流动相储罐，又如根据本发明的三维液相色谱分离系统需要使用5种或更多不同的流动相溶液，可包括5个流动相储罐及图2所示的两个输液系统可分别连四个流动相储罐，共8个流动相储罐。优选地，根据本发明的2D-LC、mD-LC分离系统分离系统包括至少4个流动相储罐。从分析到半制备到制备，再到生产规模可分别由容积1L的玻璃瓶到容积为吨级的不锈钢贮罐不等。对于大规模的，固定产品而言，因生产工艺固定，所用贮罐数可大大减小。

输液装置和进样装置

所述第一输液装置和所述第二输液装置可分别包括一个或多个泵，例如注射式计量泵、往复式计量泵和隔膜式计量泵。

可选地，所述第一输液装置和/或所述第二输液装置可分别由多元梯度单元和泵组成，所述多元梯度单元具有多个输液通道并且可输送和计量各通道流量。所述多元梯度单元是本领域技术人员所公知的，并且优选地每个输液装置具有至少4个通道。

可选地，所述第一输液装置和/或所述第二输液装置可分别为具有多个输液通道并且可输送和计量各通道流量的第一泵和第二泵。所述第一泵和第二泵优选地为分别具有至少4个通道的泵。

本领域技术人员容易根据所述mD-LC系统所需要的进样压力、流量以及泵送精度来确定前文所述的泵的型号和手动注射器进样或自动的进样阀进样。可选地，所述泵为本领域技术人员公知的大容量的高压泵，优选本领域技术人员公知的隔膜式超高压泵或往复式超高压泵。

对于分析型mD-LC分离系统，所述超高压泵优选地为将液体加压至40兆帕以下和40兆帕已上的超高压泵。对于制备型和生产型多维液相色谱分离系统，所述高压泵优选地为将液体加压至20兆帕以上的高压泵。

所述多维液相色谱系统为整体式，即所有硬件组装在一个壳体内，并且其操作由一个控制系统进行控制；或者所述多维液相色谱系统为分体式，即各个硬件和自控系统安装于两个或两个以上的壳体内，并且使用现有色谱仪的自控系统和其他操作的自控系统。

对于分析型mD-LC分离系统，所述高压泵的流量范围优选地为0.001至10毫升/分钟。对于制备型mD-LC分离系统，所述高压泵的流量范围优选地为0.01至100毫升/分钟。对于生产型mD-LC分离系统，所述高压泵的流量范围优选地为0.1至10升/分钟。

优选地，所述输液装置还包括脱气单元，所述脱气单元以公知方式除去所述流动相液体中的气体。

可选地，在所述流动相储罐和所述输液装置之间设有储罐阀门，所述储罐阀门可控制所述流动相储罐是否与所述输液装置连通。

优选地，根据本发明的mD-LC分离系统中的所述第一输液装置和第二输液装置能够输送的流动相流量之和高于通过梯度洗脱进行液相色谱分离时通常的流动相流量。

所述第一进样装置为本领域技术人员公知的用于常规液相色谱系统的进样器，该进样器可为手动进样器或自动进样器，色谱泵。例如，所述进样器可为常规的6通色谱进样阀，其将待分离的样品定量地送入根据本发明的多维液相色谱分离系统。

所述第二进样装置中的进样混合器可为本领域技术人员公知的任何适于使所述中间馏分与流动相充分混合的混合器。可选地，所述混合器包括但不限于混合罐或混合器。

所述混合罐可包括搅拌部件，所述搅拌部件的例子包括但不限于磁搅拌子，以电动机或发动机驱动的搅拌桨。

所述管道混合器的例子包括但不限于可为喷嘴式管道混合器、涡流式管道混合器、多孔板式管道混合器、异形板式管道混合器、静态管道混合器。

可选地，连通所述第二进样装置与所述第二输液装置的管路上设有阀门。

下一维的分离，如前所述，在通过所述第二进样装置将所述的从集存液装置中流出的，经上一维色谱分离后的，含有目标产品的中间馏分，在送入分离装置之前，就必须要要对第一输液装置推动的含有目标产品的中间馏分的上一维收集液的全部，或部分，再与由第二输液装置的输送的流动相的流量进行调节和计量，从而使得二者混合后的“含有目标产品中间馏分的稀释液，或“目标产品的再进样”溶液中洗脱剂浓度的最终浓度低于该目标产品的临界迁移洗脱剂浓度。本领域技术人员应能理解，对所述该下一维分离前的一维馏分样品的“前处理”（样品中的“缓冲液置换”防止样品的质量及体积过载）是实现第二维和更多维分离所必需的，换言之，正是因为根据本发明的输液装置和进样装置能够将中间馏分与流动相以特殊的方式混合并且使混合后的洗脱剂浓度低于需要得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度，才使本发明的多维液相色谱分离系统能够实现蛋白样品的多维液相色谱分离目标蛋白。

该特殊的混合方式的实施是，首先应注意的是，某种目标蛋白的临界迁移洗脱液浓度是针对将要进行该蛋白的液相色谱分离条件来确定的，该分离条件包括了流动相溶液的种类、分离模式以及色谱柱的特性，如此便确定了该蛋白在该分离条件下特有的临界迁移“洗脱液”浓度。该所对应的“洗脱液”是特指在该下一维分离时作为强洗脱剂的流动相溶液或置换剂，而该流动相溶液或置换剂浓度即为该蛋白在该分离条件下的临界迁移洗脱液浓度。相应地，对于所述进样混合液而言，其“洗脱液”浓度所指的洗脱液是在将要进行的液相色谱分离中作为强洗脱剂的流动相溶剂或置换剂。

其次，因为某种蛋白的临界迁移洗脱液浓度特定地与该蛋白自身的性质、所选用的流动相溶液种类以及所用的色谱柱相关，所以所有需要在第二维或更多维分离中得以保留的蛋白的临界迁移洗脱液浓度应当预先以实验方法确定。

例如，所述临界迁移洗脱液浓度可通过采用相同的分离条件对相应蛋白的纯样品，或者包含相应蛋白的混合物进行非同步进样条件下的线性梯度洗脱分离而预先确定。本领域技术人员将理解，一旦预先确定了某种蛋白在某种分离条件下的临界迁移洗脱液浓度，则该临界迁移洗脱液浓度可用于相同分离条件下的分离过程，而无需再次确定该临界迁移洗脱液浓度。

通过阅读上述说明，本领域技术人员应能够调节和计量所述第一输液装置和第二输液装置所输送的液体量，从而使所述进样混合液的洗脱液浓度低于所有需要在该维分离中得以保留的蛋白的临界迁移洗脱液浓度。

分离装置

所述分离装置的色谱柱或色谱饼可为本领域技术人员公知的任何可用于分离蛋白的色谱柱或色谱饼。根据本领域的公知常识，对于不同的待分离蛋白样品，本领域技术人员容易选择合适的色谱柱，或色谱饼用于分离。

在本申请中，“合适”的色谱柱或色谱饼是指该色谱柱具有所需要的液相色谱分离模式，并能够使进入该色谱柱的液体中的蛋白至少部分地得以分离。

所述色谱柱或色谱饼在处理量相同的情况下，色谱饼的柱压降低于常用类型的色谱柱，因而更加适合在高流速、低压条件下用作制备型或生产型的多维液相色谱分离系统。

在本申请中，所述的多孔阀是指孔数等于，或多于8以上的阀，例如10通阀，或更多通道的多通阀。

本领域技术人员容易理解，如果所述分离装置包括两根以上的色谱柱，则通过所述分离装置的色谱柱切换阀，而并非通常多维色谱中的专用切换装置，选择性地使所述色谱柱中的合适色谱柱连通至流路中。

当所述分离装置包括两根以上的色谱柱或色谱饼时，所述分离装置的色谱柱或色谱饼切换单元可包括至少一个多通阀，所述多通阀具有一个作为所述分离装置入口的阀门入口和n个与所述n个色谱柱一一对应地连通的阀门出口，所述多通阀通过对n个阀门出口进行切换而使进入所述分离装置的液体选择性地流入所述色谱柱，或色谱饼中的一根色谱柱。

优选地，所述分离装置的色谱柱或色谱饼切换阀包括第一多通阀和第二多通阀，所述第一多通阀具有一个作为所述分离装置入口的阀门入口和n个与所述n个色谱柱一一对应地连通的阀门出口，所述第二多通阀具有一个作为所述分离装置出口的阀门出口和n个与所述n个色谱柱一一对应地连通的阀门入口。通过所述第一多通阀的n个阀门出口之间的切换和所述第二多通阀的n个阀门入口之间的切换，可使所述色谱柱，或色谱饼中的一根色谱柱，或色谱饼连通，即流入所述分离装置的液体经过所述第一多通阀流入所述色谱柱，或色谱饼中的一根色谱柱，并经过所述第二多通阀从所述分离装置流出。

应注意的是，各维分离中所用的液相色谱分离模式可以相同或不同，因此，所述mD-LC分离系统中所用的分离模式数量m可以等于或小于该mD-LC分离系统的分离次数。优选地，该二维的分离模式为“正交型”模式中色谱柱的个数q，而代之为相同色谱柱进行2D-LC的切换阀门。当然，一般而言，相邻的两维分离所用的分离模式通常是不同的。

本领域技术人员容易理解，如果所述分离装置仅包括一根混合模式色谱柱，则所述分离装置可不包括色谱柱之间切换阀。

优选地，根据本发明的mD-LC分离系统还可包括除盐装置。用于液相色谱系统中的除盐装置是本领域技术人员所公知的，其用于从液体中除去至少部分的盐。例如，该常规除盐装置可为与所述分离装置的色谱柱相并联的排阻色谱柱除盐。

检测装置

所述检测装置包括可用于在液相色谱方法中检测不同蛋白组分的检测器。所述检测器可以是本领域技术人员公知的常用于液相色谱系统中的任何类型的检测器。优选地，在规模生产过程中流动相流速很高，必须加一个与检测器并联的排液孔以使其目标产品从排液孔中同时排出、检测和收集。该进入检测装置的流体中分出1/10至1/1000，并将该分出的部分送入检测器中。

集存装置所述集存装置的所述集存器可为储液管、储液罐、储液槽或者相互串联的储液管和/或储液罐和/或储液槽。所述集存器的数量p取决于待分离蛋白样品的复杂程度，并且与每一维分离时得到的馏分中被收集并储存以进行进一步分离的馏分数量相关。优选地，p可满足下式：

P≥max(x_j)                    (3)

其中x_j为第j维分离时进行收集和储存以进行进一步分离的中间馏分数。

可选地，所述集存装置的集存器的容积全部或部分地彼此不同。本领域技术人员容易理解，可将体积较大的馏分容纳于容积较大的集存器中，可将体积较小的馏分容纳于容积较小的集存器中，还可将一种馏分容纳于两个或多个集存器中。

优选地，所述集存装置除了包含满足式（3）的p个集存器以外，还包括一个容积小的集存器。所述容积小的集存器用于使不需要收集和储存的馏分快速通过所述收集和储液装置最终从排液口排出。

优选地，所述集存装置的集存器切换阀包括第三多通阀，或多位选择阀（见图2所示的11-1中的一个）和第四多通阀（见图所示的11-2中的同一根），所述第三多通阀具有一个作为所述储液装置入口的阀门入口和p个与所述p个集存器一一对应地连通的阀门出口，所述第四多通阀具有一个作为所述储液装置出口的阀门出口和p个与所述p个集存器一一对应地连通的阀门入口。通过对所述第三多通阀的p个阀门出口和所述第四多通阀的p个阀门入口进行切换，可使至少一个所述集存器连通，即流入所述集存装置的液体经过所述第三多通阀流入至少一个所述集存装置，并经过所述第四多通阀从所述集存装置流出。

更优选地，所述第三多通阀和第四多通阀均允许液体逆向地流过阀体，即允许液体从阀门出口流入并从阀门入口流出。此时，通过对所述第三多通阀的p个阀门出口和所述第四多通阀的p个阀门入口进行切换，可使至少一个集存装置连通，流入所述集存装置液体可经过所述第三多通阀流入至少一个所述集存装置，并经过所述第四多通阀从所述集存装置流出，流入所述集存装置的液体也可逆向地经过所述第四多通阀流入所述至少两个集存装置中的至少一个集存装置（即从所述第四多通阀的出口流入，并从所述第四多通阀的入口流向所述集存装置），并逆向地经过所述第三多通阀从所述集存装置流出（即从所述三多通阀的出口流入，并从所述三多通阀的入口流出所述集存装置）。

当用SEC模式除盐时，因为二维流出液体积较大且流出液中目标蛋白的浓度随时间在不断地变化，加之并不能一次性完全进样到SEC柱上，其集存装置为椭圆形，并伴随着用振荡器的搅拌使其混合均匀以便能分次、等量地将收集液进样到SEC柱上除盐。

排液装置

所述排液装置可为本领域技术人员公知的常用于液相色谱系统中的排液装置。通过所述排液装置排出系统外的液体既包括不需要进一步分离的作为最终分离产物的馏分，也包括流路中的废液。作为一种简单的情况，所述排液装置可为连通至系统外的管路。

优选地，根据本发明的液相色谱分离系统可包括第一排液装置和第二排液装置，其中所述第一排液装置可将来自所述检测装置的液体排出至系统外，所述第二排液装置可将来自所述储液装置的液体排出至系统外，从而使得第一排液装置能够排出进样时置换出的流动相，并使得第二排液装置能够排出目标产品和废液。

优选地，当根据本发明的液相色谱分离系统为制备或生产规模时，由于检测器的检测池不允许大体积液体流过，故需设置第三排液装置，该第三排液装置为直径远大于检测池直径的支管，与所述检测装置并联设置，并从分离装置接收流动相，从而使得90%以上的流动相能够从所述第三排液装置排出。

可选地，所述排液装置可为本领域技术人员公知的常用于液相色谱系统中的三个排液装置，第一排液装置排出进样时置换出的流动相，第二排液装置为目标产品排液口和大量废液的排液口，而第三排液装置则是为大规模生产用而专门设计的，通过一个二通阀而与检测器并联，该二通阀的两个孔大小可以调节，以使含有目标产品的90%至99.9%的流动相不经过检测器而排出到产品收集装置或废液收集装置，而仅有0.1%至10%的相同组成的流动向同步流过检测器。

流路切换装置

优选地，所述流路切换装置以选择性地构成以下流路中任何一种的方式来切换流路：

常规分离流路，其依次连通所述流动相储罐、所述第一输液装置、所述第一进样装置、所述分离装置、所述检测装置和所述第一排液装置；

第一维分离流路，其依次连通所述流动相储罐、所述第一输液装置、所述分离装置、所述检测装置、所述集存装置和所述第二排液装置；

收集中间馏分的第二维或更高维分离流路，其依次连通所述流动相储罐、所述第一输液装置、所述集存装置、所述第二进样装置、所述分离装置、所述集存装置、所述集存装置以及所述第二或第三排液装置，并且依次连通所述流动相储罐、所述第二输液装置和所述第二进样装置；

不收集中间馏分的第二维或更高维分离流路，其依次连通所述流动相储罐、所述第一输液装置、所述集存装置、所述第二进样装置、所述分离装置、所述检测装置和所述第一排液装置，并且依次连通所述流动相储罐、所述第二输液装置与所述第二进样装置。

在本申请中，流路中的各个部件“依次连通”是指通过阀门和管路将所述序列的各个装置在空间上通过管路依次连通，使流路中的流体在时间上依次先后经过所述序列中每一对相邻部件，以使得本发明的mD-LC分离系统中的液体能够依照所述部件序列的先后顺序流过所述部件序列中的各个部件。为简洁起见，所述部件序列不具体列出流路中的阀门和管路。

恒温装置

优选地，为了避免所分离的蛋白在分离过程中失活，根据本发明的mD-LC分离系统还包括恒温装置，所述恒温装置至少使所述集存装置保持在能够延长蛋白的失活时间的恒温条件下。可选地，所述恒温装置使整个根据本发明的mD-LC分离系统保持在能够延长蛋白的失活时间的恒温条件下。所述恒温温度优选地为4°C。例如，所述恒温装置可为恒温箱，该恒温箱装有冷却装置，从而使箱体内的空间保持恒温（优选地保持在4°C下），并将所述集存装置或者整个多维液相色谱分离系统容纳于该空间内。

所述恒温系统的全部或部分可以和色谱仪的其他部件组装在一个壳体内成为整体式系统，也可分开装成分体式系统。

灭菌装置

优选地，根据本发明的多维液相色谱分离系统还可包括灭菌装置，该灭菌装置以公知方式至少使存在于所述集存装置中的细菌被杀灭。可选地，所述灭菌装置使整个根据本发明的mD-LC分离系统中的细菌被至少部分地杀灭。所述灭菌装置可包括蒸汽发生装置和蒸汽注入或电热装置，所述蒸汽发生装置能够产生温度为140°C以上的蒸汽，所述蒸汽注入装置将所述蒸汽注入多维液相色谱分离系统的集存装置。

所述灭菌装置包括电加热装置，所述电加热装置通过电力直接进行加热，或者通过电加热所产生的热风来进行加热。

所述灭菌装置的全部或部分可以和色谱仪的其他部件组装在一个壳体内成为整体式系统，也可分开装成分体式系统。

自动化控制装置

优选地，为了实现自动化操作，根据本发明的mD-LC分离系统还可包括自动化控制装置，该自动化控制装置除了完成本领域技术人员公知的常规液相色谱自动化操作以外，还对所述分离装置、集存装置以及流路切换装置中的阀门进行自动切换。根据本发明的mD-LC分离系统为整体式或分体式的不同，该自动化控制装置为一个整体，也可分为两个独立的控制装置，前者为全新的“系统”，后者只是配合现有色谱仪使用的自控系统。

任选地，根据本发明的mD-LC分离系统还可包括常规液体混合装置，该常规液体混合装置是本领域技术人员所公知的，其以公知方式使流路中的各种组分更充分地相互混合，例如，可将该常规液体混合装置设置于所述输液装置之后，从而使从该输送装置的流出液中的各种流动相液体更好地相互混合。

壳体

可选地，将根据本发明的mD-LC分离系统的部分或全部组件安装在一个或多个壳体内，从而形成整体式或分体式的仪器设备。例如，将所述输液装置、进样装置、分离装置、集存装置、流路切换装置、自动化控制装置、常规检测装置以及常规排液装置安装于一个壳体内，从而形成整体式的多维液相色谱仪，也可组装成两个以上壳体内的分体式“系统”。

二维液相色谱分离系统

特别地，本发明提供一种用于蛋白分离的使用圆柱形色谱柱的2D-LC分离系统（以下简称2D-LC分离系统），该2D-LC分离系统包括检测装置，其特征在于，所述2D-LC分离系统包括：

（1）流动相储罐，其储存用于2D-LC分离的流动相的液体；

（2）第一输液装置和第二输液装置，所述第一输液装置和第二输液装置彼此独立地从所述流动相储罐取出适用于液相色谱分离的流动相并将该流动相输送至所述2D-LC分离系统的流路中，并且可彼此独立地调节和计量流量；

（3）第一进样装置和第二进样装置，所述第二进样装置包括进样混合器；

（4）分离装置，其包括色谱柱切换单元和n根色谱柱，或者包括一根具有两种以上分离功能的色谱柱，其中所述色谱柱切换单元使进入所述分离装置的液体选择性地流入所述n根色谱柱中的一根色谱柱，n为非负整数且满足下式：

n＞q            (4)

当用通常的两根单分离模式色谱柱在该多维色谱系统上实施离线2D-LC时，

n=2，q=0，m=0；应注意的是，此处说明的是如何用通常色谱柱（即一根色谱柱只有一种分离模式）在该多维色谱系统上实施离线和在线2D-LC，故所用色谱柱的个数n=2，q=0，m=0。

当用一根2D色谱柱在该多维色谱系统上实施离线和在线2D-LC时，

n=m=q=1            (5)

（5）集存装置，其包括p个集存器和集存器切换阀，其中p大于或等于2，所述集存器切换单元使进入所述集存装置的液体选择性地流入所述集存装置中的至少一个集存器。

（6）至少二个排液装置，所述2D-LC分离系统中的液体从所述排液装置排出至系统外；

（7）流路切换装置，其由与上述装置相连的阀门和管路所组成，通过对所述流路切换装置中的阀门进行切换，所述流路切换装置除了形成常规液相色谱分离中的流路外，还形成用于进行2D-LC分离的流路；

其中，在第一维分离时，所述第一输液装置将适用于该第一维分离的流动相输送至第一进样装置[如图2中所示7，从左向右数的第一根色谱柱为2D柱，其它为通常的单分离模式柱]一根，所述第一进样装置从系统外引入原样品并使其随来自第一输液装置的流动相一同进入所述分离装置，所述分离装置对该待分离样品进行第一维液相色谱分离并由此得到不同的馏分，所述集存装置和所述馏分中需要进行进一步液相色谱分离的中间馏分并将该中间馏分储存在至少一个集存装置中，并将不需要进一步分离的馏分通过所述排液装置2从系统中排出；

在第二维分离时，所述第一输液装置将适用于液相色谱分离的流动相送至所述集存装置并将储存于所述至少一个集存器中的一种中间馏分随着该流动相一同被输送至所述进样混合器中，所述第二输液装置从所述流动相储罐取出适用于液相色谱分离的流动相并将该流动相输送至所述进样混合器中，所述进样混合器使来自所述至少一个集存器的中间馏分和流动相与来自所述第二输液装置的流动相混合从而得到进样混合液，所述分离装置对所述进样混合液进行第二维液相色谱分离并由此得到不同的馏分。

其中，所述第一输液装置和第二输液装置对其输送的用于第二维分离的流动相的量进行调节和计量，从而使得用于第二维分离的所述进样混合液中的洗脱剂浓度低于该进样混合液所包含的中间馏分中的所有需要在该第二维分离中得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度。

优选地，根据本发明的液相色谱分离系统可包括第一排液口和第二排液口和第三排液口，其中所述第一排液装置可将来自所述检测装置的液体排出至系统外，所述第二排液装置可将产品及来自所述进原样时排出废液储液装置的液体排出至系统外。

第三排液口是为大规模生产用而专门设计的，与检测器并联的二通阀，该阀的两个孔大小可以调节，以使含有目标产品的90~99.9%的流动相不经过检测器而排出到产品收集装置，或废液收集装置，只是0.1~10%的相同组成的流动向同步流过检测器。

优选地，所述流路切换装置以选择性地构成以下流路中任何一种的方式来切换流路：

常规分离流路，其依次连通所述流动相储罐、所述第一输液装置、所述第一进样装置、所述分离装置、所述检测装置和所述第一排液装置；

第一维分离流路，其依次连通所述流动相储罐、所述第一输液装置、所述分离装置、所述检测装置、所述集存装置和所述第二排液装置；

第二维分离流路，其依次连通所述流动相储罐、所述第一输液装置、所述馏、所述第二进样装置、所述分离装置、所述检测装置和所述第一排液装置，并且依次连通所述流动相储罐、第二输液装置与所述第二进样装置。

本发明的另一方面在于提供一种新的用于蛋白分离的mD-LC分离方法，该mD-LC分离方法包括以下步骤：

（1）预先准备：确定待分离的蛋白样品中所有需要在第二维或更多维分离中得以保留的蛋白在该第二维或更多维分离条件下的临界迁移洗脱剂浓度；

（2）第一维分离：通过梯度洗脱对蛋白样品进行常规液相色谱分离，从而得到不同的馏分；

（3）收集和储存中间馏分：收集并储存经上一维分离得到的馏分中需要进行进一步分离的中间馏分；

（4）第二维或更多维分离：将一种需要进行下一维分离的全部或部分的中间馏分与用于下一维分离的流动相混合从而得到下一维分离的进样混合物，将所述进样混合物进样至下一维分离的同一混合模式色谱柱或并联的另一模式或混合模式色谱柱中；随后，通过梯度洗脱，将保留在所述步骤（4）的下一维分离的色谱柱中的所述进样混合物进行第二维或更mD-LC分离，从而再次得到不同的馏分；对所有的由上一维分离得到且需要进行此维分离的中间馏分进行上述分离。

（5）重复上述步骤（3）和（4），从而得到所有的目标蛋白产物。

其中，在所述步骤（4）中，对用于所述下一维分离的流动相的量进行调节和计量，从而使得所述进样混合液中的洗脱剂浓度低于该进样混合液所包含的中间馏分中的所有需要在该第二维或更多维分离中得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度。

优选地，在所述步骤（4）中，通过高流速的流动相而使所述中间馏分进样至所述的并联的色谱柱中。

在本申请中，“高流速”的流动相是指该流动相的流速高于通过梯度洗脱进行液相色谱分离目标蛋白时所通常采用的流动相流速。

进一步优选地，在所述步骤（4）中，将所述中间馏分的进样至所述色谱柱的时间少于该中间馏分的分离时间的一半。

根据本发明的多维液相色谱分离方法可在线进行，也可离线进行。

在根据本发明的“在线馏分离方法”中，经上一维分离后的馏分通过在线方式收集，随后将需要进一步分离的中间馏分直接送至下一维分离。

在根据本发明的“离线mD-LC分离方法”中，经上一维分离后的馏分通过离线方式收集，再将需要进一步分离的中间馏分进行下一维分离。

通过本发明的mD-LC分离系统实施本发明的mD-LC分离方法

根据本发明的mD-LC分离方法可使用根据本发明的mD-LC分离系统来实施，其步骤如下：

（1）预先准备：确定待分离的蛋白样品中所有需要在第二维或更多维分离中得以保留的蛋白在该第二维或更多维分离条件下的临界迁移洗脱剂浓度C_CMP；

（2）第一维分离：通过所述流路切换装置形成用于第一维分离的流路，通过第一输液装置输送用于第一维分离的流动相，并通过第一进样装置将该蛋白样品进样至所述mD-LC分离系统内，在存在所述色谱柱切换单元时通过切换该色谱柱切换单元使得用于第一维分离的色谱柱连通，通过梯度洗脱使所述蛋白样品在所述色谱柱中分离成不同的馏分并用检测器检测；

（3）收集和储存中间馏分：通过切换所述馏中的集存器切换单元，使需要进行进一步分离的中间级分被收集并分别储存于不同的集存装置中，并将不需要进行进一步分离的馏分从第二排液口排出系统；

（4）第二维或更多维分离：上一维分离完成后，通过所述流路切换装置形成用于第二维或更多维分离的流路，并在存在所述色谱柱切换阀时通过切换该色谱柱切换发使得用于第二维或更多维分离的色谱柱连通；通过第一输液装置将用于下一维分离的流动相输送至集存装置，以使一种需要进行下一维分离的中间馏分从相应集存器中流出并进入所述第二输液装置的进样混合器中，同时通过第二输液装置将用于下一维分离的流动相送至所述进样混合器中，从而使所述中间馏分与所述流动相混合得到下一维分离的进样混合物；将所述进样混合物进样至下一维分离的色谱柱中，并且通过对所述第一输液装置和第二输液装置所输送的流动相的量进行调节和计量，使该进样混合物中的洗脱剂浓度低于该中间馏分中的所有需要在下一维分离中得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度，从而使所述蛋白保留于所述色谱柱中，从而完成第二维进样；

随后，通过梯度洗脱使所述进样混合物在所述色谱柱中分离成不同的馏分并用检测器检测；

对所有的由上一维分离得到且需要进行此维分离的中间馏分进行此步骤的分离；

（5）重复上述步骤（3）和（4），从而得到所有的目标蛋白产物。

（6）多维色谱的最后一维色谱分离可以是除盐。通常使用排阻色谱柱（SEC柱）。

二维液相色谱（2D-LC）分离方法

特别地，本发明提供一种新的用于蛋白分离的单柱2D-LC分离方法，该2D-LC分离方法包括以下步骤：

（1）预先准备：确定待分离的蛋白样品中所有需要在第二维分离中得以保留的蛋白在该第二维分离条件下的临界迁移洗脱剂浓度；

（2）第一维分离：用图2中的一根通常的单分离模式色谱柱对蛋白样品进行第一维液相色谱分离，从而得到不同的馏分；

（3）收集和储存中间馏分：收集并储存经第一维分离得到的馏分中需要进行第二维分离的中间馏分；

（4）第二维分离：将所述中间馏分与用于第二维分离的流动相混合从而得到进样混合物，将所述进样混合物的全部或部分的进样至第二维分离的色谱柱中；随后将所述进样混合物进行第二维液相色谱分离，从而得到目标蛋白产物；对所有的由第一维分离得到且需要进行第二维分离的中间馏分进行此步骤的分离。

其中，在所述步骤（4）中，对用于第二维分离的流动相的量进行调节和计量，从而使得所述进样混合液中的洗脱剂浓度低于该进样混合液所包含的中间馏分中的所有需要在该第二维分离中得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度。

通过本发明的多维液相色谱分离系统或2D-LC分离系统实施本发明的2D-LC分离方法

根据本发明的mD-LC分离系统或2D-LC分离方法可使用根据本发明的2D-LC分离系统来实施，其步骤如下：

（1）预先准备：确定待分离的蛋白样品中所有需要在第二维分离中得以保留的蛋白在该第二维分离条件下的临界迁移洗脱剂浓度C_CMP；

（2）第一维分离：通过所述流路切换装置形成用于第一维分离的流路，通过第一输液装置输送用于第一维分离的流动相，并通过第一进样装置，如用图2中的一根通常的单分离模式色谱柱，将该蛋白样品进样至所述mD-LC分离系统内，在存在所述色谱柱切换阀时通过切换该色谱柱切换阀使得用于第一维分离的色谱柱连通，通过梯度洗脱使所述蛋白样品在所述色谱柱中分离成不同的馏分并在检测器中检测；

（3）收集和储存中间级分：通过切换所述集存液装置中的集存器切换单元，使需要进行进一步分离的中间馏分被收集并分别储存于不同的集存液装置中，并将不需要进行进一步分离的级分从第二排液口排出系统；

（4）第二维分离：第一维分离完成后，通过所述流路切换阀形成用于第二维分离的流路，并通过所述色谱柱切换阀6-1切换到第二维单模式色谱分离柱进行第二维色谱分离，切换阀使得用于第二维分离的色谱柱连通；通过第一输液装置将用于第二维分离的流动相输送至集存装置，以使一种需要进行第二维分离的中间馏分从其集存器中流出并进入所述第二输液装置的进样混合器中，同时通过第二输液装置将用于第二维分离的流动相送至所述进样混合器中，从而使所述中间馏分与所述流动相混合得到第二维分离的进样混合物，将所述进样混合物进样至第二维分离的色谱柱中，并且通过对所述第一输液装置和第二输液装置所输送的流动相的量进行调节和计量，使该进样混合物中的洗脱剂浓度低于该中间馏分中的所有需要在第二维分离中得以保留的目标蛋白的临界迁移洗脱剂浓度，从而使所述蛋白保留于所述色谱柱中，完成第二维进样；通过梯度洗脱使所述进样混合物在所述色谱柱中分离成不同的馏分通过色谱柱切换阀6-2进入到检测器中检测；对所有的由第一维分离得到且需要进行第二维分离的中间馏分进行此步骤的分离。

缓冲液交换和色谱系统的再平衡

在所述步骤（4）的进样之前或进样完成后，当上一维分离后的中间样品中的流动相组成与下一维分离的流动相组成不匹配时，根据本发明的mD-LC分离方法或二维液相色谱分离方法还可包括以下步骤：

缓冲液交换：将下一维分离中所用的流动相作为缓冲液，并使所述缓冲液流过所述下一维分离的色谱柱，其中所述缓冲液中的洗脱剂浓度低于所述中间馏分中所有需要在下一维分离得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度，从而至少部分地置换所述色谱柱中原有的流动相。

举例而言，从前一维分离流出的含有目标蛋白的收集液是会有已知组成的溶液1和溶液2的混合液，其组成可从梯度时间及该溶液1和溶液2的组成估算而知，但不同蛋白的保留时间不同，故不同蛋白收集液中的组成并不固定，可用溶液X表示，收集溶液一般都会在3mL以上，而该溶液X在溶液1或2推动下进入第二进样装置时，它是不与该推动液混合的，故在第二进样装置中与由第二输液装置推动的溶液3或4与溶液X混合后，从开始到完全进入色谱第二维分离柱的这一全过程为样品的缓冲溶液交换或缓冲溶液置换。

色谱系统的再平衡：在溶液X进样的过程中，事实上就将原来残留在色谱柱中的用于一维色谱分离的流动相进行了部分置换，这有助于色谱系统的再平衡，也可视其为第二维色谱体系平衡过程中的一部分，如需再继续实现完全平衡，就再用溶液3或4流过该色谱柱。

所述缓冲液交换和色谱系统的再平衡完成后，才能对所述中间馏分进行分离。

优选地，所述缓冲液交换和色谱系统的再平衡时的流动相流速高于通过梯度洗脱进行液相色谱分离时所通常采用的流动相流速。

优选地，可通过本发明的mD-LC分离系统来实施缓冲液交换，其中将下一维分离中所用的流动相作为缓冲液，通过第一输液装置和/或第二输液装置使所述缓冲液流过所述下一维分离的色谱柱，其中所述缓冲液中的洗脱剂浓度低于所述中间馏分中所有需要在下一维分离得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度，从而至少部分地置换所述色谱柱中原有的流动相。优选地，所述第一输液装置和/或第二输液装置所输送的缓冲液的流速高于通过梯度洗脱进行液相色谱分离时所通常采用的流动相流速。

特别地，在所述步骤（4）的进样之前或进样完成后，根据本发明的2D-LC分离方法可包括以下步骤：

缓冲液交换：将第二维分离中所用的流动相作为缓冲液，并使所述缓冲液流过所述第二维分离的色谱柱，其中所述缓冲液中的洗脱剂浓度低于所述中间馏分中所有需要在第二维分离得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度，从而至少部分地置换所述色谱柱中原有的流动相。优选地，所述第一输液装置和/或第二输液装置所输送的缓冲液的流速高于通过梯度洗脱进行液相色谱分离时所通常采用的流动相流速。

所述缓冲液交换和色谱系统的再平衡完成后，再对所述中间馏分进行第二维分离。

色谱柱的再生

色谱柱需要周期性地再生，可用合适的强洗脱溶液在高速条件下清洗色谱柱。本领域技术人员能够通过所采用的色谱分离模式来选择合适的强洗脱溶液。

通过阅读本申请所公开的技术内容，本领域技术人员应能理解，本发明人发现了蛋白的“停滞-迁移”现象并将其创造性地应用于液相色谱分离技术，从而设计出本发明的mD-LC分离系统和mD-LC分离方法，其中通过将再次进样时的进样混合物中的洗脱剂浓度保持在低于其中所有需要在下一维分离得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度，从而实现了将前一维分离后所得馏分全部进样至下一维分离的色谱柱，并且不需要将前一维分离后的馏分除盐，也无需任何特殊的柱间接头。

本发明的优势特别地在于能够实现全部目标中间馏分的定量转移，进而实现蛋白和多肽的快速分离。

附图说明

图1A-1F显示了在非同步进样条件下对联苯、碳酸酐酶和十五肽（GEPPPGKPADDAGLV）进行RPLC线性梯度洗脱的结果。

图2为示例性的mD-LC分离系统的流路结构图，图2中各部件为：

1、四元梯度单元

2、流动相储罐

2-1、溶液1

2-2、溶液2

2-3、溶液3

2-4、溶液4

3、泵A

4、六通阀组：包括一个六通进样阀和一个六通阀

4-1、六通进样阀4-1，其为第一进样（原样）装置

4-2、六通阀4-2，该六通阀4-2和相关阀门以及混合器12一起组成第二进样装置

5、三通阀：

5-1、三通阀5-1

5-2、三通阀5-2

5-3、三通阀5-3

5-4、三通阀5-4

6、多通阀组：包括2个多通阀

6-1、多通阀

6-2、多通阀导入流体到色谱柱（饼）

7、色谱柱（饼）组

8、低温恒温控制箱（包括灭菌装置）

9、泵B

10、集存装置

10-1、集存装置10-1

10-2、集存装置10-2

10-3、集存装置10-3

10-4、集存装置10-4

10-5、集存装置10-5

10-6、集存装置10-6

10-7、集存装置10-7

10-8、集存装置10-8

11、多通阀组：包括两个8通阀

11-1、八通阀1

11-2、八通阀2

12、混合器

13、检测器

14、色谱饼

15、镏分收集器

16、工作站

17-1、主排液口

17-2、二维进样时的废液排液口

17-3、大规模纯化蛋白时的排液口

18、振荡器

19、并联分流管

图中粗实线表示管线，而细实线表示数据线。

图3显示了通过商品柱奥岚WCX柱对7种蛋白的2D-LC（WCX，HIC）分离的结果。

图4显示了通过商品Shim-pack PA-CM的WCX柱和商品TSKgel G4000SWXLSEC除盐柱共两根色谱柱实施三维色谱3D-LC（WCX/HIC/SEC）对α-Chymotrypsin和Trypsin同时进行纯化并除盐的结果。

图5显示了在线单柱二维液相色谱柱（2D（WCX，HIC）快速纯化牛胰腺中的细胞色素C的结果。

具体实施方式

本发明的技术方案及其优势将通过阅读以下的具体实施方案而显而易见。

二维液相色谱(2D-LC)分离系统

特别地，在一个具体实施方案中，根据本发明的为如图2所示的mD-LC分离系统用于2D-LC的疏水色谱（HIC）和离子交换色谱（IEC）的分离系统，其包括：

（a）作为流动相储罐的4个储罐（分别为流动相储罐2-1至2-4）容积和材料可随系统规模而异，从100mL至100L，从玻璃材质到不锈钢材质不等。其中，所述流动相储罐2-1至2-4各自装有用于液相色谱分离的溶液，所述溶液分别表示成溶液1-2分别为HIC流动相的A溶液和B溶液，而溶液3-4分别为IEC流动相的A溶液和B溶液，其中溶液1和溶液2用作第一维色谱分离的溶液，而溶液3和溶液4用作第二维色谱分离的溶液。

（b）作为第一输液装置的泵A（3）和四元梯度单元1-2，作为第二输液装置的泵B（9）和四元梯度单元1-1，其4个通道均分别与流动相储罐2-1至2-4一一对应连通，并且能够独立地调节和计量4个通道的流量。

其中，泵A（3）和四元梯度单元1-2以及泵B（9）和四元梯度单元1-1均可为商品四元梯度泵，可用泵本身提供的动力输送和计量四种不同流动相通道的流量。

泵A（3）和四元梯度单元1-2主要用于第一维色谱分离，也用于将储存在集、存装置中的一维馏分送出配合二维色谱进样，或二维色谱分离。泵B（9）和四元梯度单元1-1主要用于第二维或多维色谱分离，并与泵A（3）联用实施二维或多维色谱进样和色谱分离。

泵A（3）和泵B（9）为高压泵，其流量范围优选为0.001至10毫升/分钟，精度±0.001mL,最大压力为40MPa；对于制备型多维液相色谱分离系统，泵A（3）和泵B（9）的流量范围优选为0.01至100毫升/分钟，精度±0.01mL,最大压力为20MPa；对于生产型多维液相色谱分离系统，泵A（3）和泵B（9）的流量范围优选为0.1至10升/分钟，精度±0.1mL最大压力为20MPa。

（c）作为第一进样装置的六通进样阀4-1和4-2以及作为第二进样装置的混合器12。

其中，六通进样阀4-1为一维进样和第一废液排出阀；六通阀4-2为第二维进样的控制阀，明确标注有“inject”和“load”阀位，以表明二维分离体系的工作状态。

所述六通进样阀4-1具有6个端口，其端口1-4孔连接以作为样品环，端口6孔与进样器排液口相连。所述样品环的容量例如为10毫升。所述六通进样阀4-1的阀内构造为：在进样状态下，所述六通进样阀4-1的端口1孔与端口2孔连通，端口3孔与端口4孔连通，而端口5孔与端口6孔连通；在非进样状态或进样准备状态下，端口1孔与端口6孔连通，端口2孔与端口3孔连通，而端口4孔与端口5孔连通。六通进样阀4-1的端口1孔与端口4孔分别与样品环的两端连通，而端口6孔与进样器排液口连通。

所述混合器12例如为喷嘴式管道混合器，其具有两个混合器入口（混合器入口M1和混合器入口M2）和一个混合器出口M0。所述混合器12的入口M1与泵B（9）的出口连通。混合器12将上一维馏分与下一维色谱分离所用流动相以合适比例在其中混合，从而使混合后的浓度低于二维色谱分离要求的“洗脱剂的最低浓度”。六通阀4-2和该混合器共同组成了第二进样装置。

（d）由色谱柱组7或色谱饼组14、作为色谱柱切换单元的多通阀6-1和多通阀6-2以及上述部件之间的连通管路所组成的分离装置。多通阀6-1和多通阀6-2用于控制目标蛋白进入色谱柱组7或色谱饼组14中的所需分离模式中的一个。

所述色谱柱组7或色谱饼组14包括多根本领域技术人员公知的常用于蛋白分离的商用色谱柱及混合模式色谱柱或商用色谱饼及混合模式色谱饼，其总数为n根，为简洁起见将这些色谱柱/色谱饼统一记为色谱柱1、色谱柱2、色谱柱3、……、色谱柱n。多通阀6-1具有一个入口0和至少n个出口（分别记为出口1、出口2、出口3、……、出口n）。多通阀6-2具有一个出口0和n个入口（分别记为入口1、入口2、入口3、……、入口N）。多通阀6-1的入口0作为所述分离装置的入口，多通阀6-2的出口0作为所述分离装置的出口，多通阀6-1的出口1至出口n分别与色谱柱1至色谱柱n的入口一一对应地连通，而多通阀6-2的入口1至入口n分别与色谱柱1至色谱柱n的出口一一对应地连通。多通阀6-1和多通阀6-2的阀内构造为：在切换至某根色谱柱α（α为1至n的自然数）的状态下，多通阀6-1的入口0与对应于该色谱柱α的出口α连通，而多通阀6-2的出口0与对应于该色谱柱α的入口α连通。

其中，色谱饼组14可设置成装填在不朽钢、聚合材料的饼形空腔内的各种色谱分离介质，其可为一维、二维或者甚至多维模式，可作为色谱柱组7中的一员而与其他色谱柱并联地安装在一起，通过多通阀6-1和6-2，色谱饼组14可与色谱系统串联以实施各种形式的多维色谱分离。

（e）作为检测装置的检测器13，其为本领域技术人员公知的常用于检测蛋白质的检测器。可使用UV、折光、电化学、质谱等类型的检测器，可用于蛋白，或多肽检测的检测器均可使用，这些检测器可市购获得。

（f）由作为集存器的8个储液管（记为集存装置10-1至集存装置10-8）、作为集存器切换单元的八通阀11-1和八通阀11-2以及上述部件之间的连通管路所组成的集存装置。

所述集存装置由不锈钢、peek管或钛钢为材料制成，其可为容积不等、形状各异的螺旋管状、橄榄状空心管，以容纳和储备流出液。该集存装置的一端连接八通阀11-1，另一端接八通阀11-2。

八通阀11-1和11-2分别连接至8个集存装置的两端，每一个通路连接一个集存装置，从而控制馏分进入相应的集存装置。

其中，集存装置10-1至10-8的容量彼此相同且至少为2毫升，或者彼此不同且在2毫升至2升之间变化。八通阀11-1具有一个入口0和8个出口（出口1至出口8），而八通阀11-2具有一个出口0和8个入口（入口1至入口8）。八通阀11-1的入口0作为所述集存装置的入口，而八通阀11-2的出口0作为所述集存装置置的出口。八通阀11-1的出口1至出口8分别与集存装置10-1至集存装置10-8的一端连通，而八通阀11-2的入口1至入口8分别与集存装置10-1至集存装置10-8的另一端连通。八通阀11-1和八通阀11-2的阀内构造为：在切换至连通集存装置10-β（β为1至8的自然数）的状态下，八通阀11-1的入口0与出口β连通，而八通阀11-2的出口0与入口β连通。在切换至某个储液管的状态下，液体可依次经过八通阀11-1、该集存装置和八通阀11-2流过所述集存装置；同时，八通阀11-1和八通阀11-2均允许液体逆向地流动，此时，液体可依次经过八通阀11-2、该集存装置和八通阀11-1流过所述集存装置。

振荡器18用于对储放在橄榄形集存装置（例如图2中的10-1和10-2）中的收集液搅拌均匀。在将蛋白溶液进行除盐，或者只将收集液的一部分再进样到下一维分离时使用该振荡器18。

（g）作为第一排液装置的排液口17-1与三通阀5-4的端口2相连，作为第二排液装置的排液口17-2与六通阀4-2的6孔相连。

排液口包括三个排液口：接馏分收集器的主排液口17-1、二维进样时的废液排液口17-2和在大规模纯化蛋白时的排液口17-3。

排液口17-3包括与检测器13并联的并联分流管19。在大规模纯化蛋白时，为防止高流量流过检测器的检测池所产生的高压，将90%以上的流动相经该并联分流管流至馏分收集器15中，仅1%至10%的流动相流过检测池以作蛋白的“在线监测”用。

馏分收集器15专门用于收集纯化后的最终产品，当然也可用来收集想要的中间馏分，馏分收集器15可市购获得。

（h）作为流路切换装置的六通阀4-2、三通阀5-1、三通阀5-2、三通阀5-3、三通阀5-4以及上述阀门之间的连通管路。

其中，六通阀4-2具有6个端口（端口1至端口6），三通阀5-1、5-2、5-3和5-4各自具有3个端口（端口1、端口2和端口3）。六通阀4-2的阀内构造为：在该六通阀4-2的第一种切换状态4-2a下，端口1与端口2连通，端口3与端口4连通，而端口5与端口6连通；在该六通阀4-2的另一种切换状态4-2b下，端口1与端口6连通，端口2与端口3连通，而端口4与端口5连通。三通阀5-1、5-2、5-3和5-4的阀内构造为：在该三通阀5-1、5-2、5-3和5-4的第一种切换状态5-1a、5-2a、5-3a和5-4a下，其各自的端口1与端口2连通；在该三通阀5-1、5-2、5-3和5-4的另一种切换状态5-1b、5-2b、5-3b和5-4b下，其各自的端口1与端口3连通。六通进样阀4-1的端口2与泵1的出口连通。检测器的入口与作为分离装置出口的多通阀6-2的入口0连通，检测器的出口与三通阀5-4的端口1连通。六通阀4-2的端口1与八通阀11-2的出口0连通，六通阀4-2的端口2与六通进样阀4-1的端口3连通，六通阀4-2的端口3与三通阀5-1的端口1连通，六通阀4-2的端口4与三通阀5-2的端口2连通，六通阀4-2的端口6与排液口17-2连通。三通阀5-1的端口2与混合器入口M2连通，三通阀5-1的端口3与三通阀5-3的端口2连通。三通阀5-2的端口1与作为分离装置入口的多通阀1的入口0连通，三通阀5-3的端口3与混合器出口M0连通。三通阀5-3的端口1与多通阀1的入口0连通，三通阀5-2的端口3与三通阀5-4的端口3连通。三通阀5-4的端口2与排液口17-1连通。

（i）作为恒温装置的低温恒温控制箱8，该低温恒温控制箱使图中虚线方框以内的部件保持在4°C的恒温下。

该低温恒温控制箱包括灭菌装置，其为装有冷却装置的恒温箱，使箱体内的空间保持恒温在4°C，并将所述集存装置，或者整个多维液相色谱分离系统容纳于该空间内。该控温系统的全部或部分可以和色谱仪的其他部件组装在一个壳体内成为整体式系统，也可分开装成分体式系统。

所述灭菌装置包括蒸汽发生装置和蒸汽注入装置，或电加热装置。所述蒸汽发生装置能够产生温度为140°C以上的蒸汽，所述蒸汽注入装置将所述蒸汽注入多维液相色谱分离系统的集存装置。

该灭菌装置可采用电加热装置，所述电加热装置通过电力直接进行加热，或者通过电加热所产生的热风来进行加热。

（j）作为自动化装置的计算机控制装置，该计算机控制装置自动地控制四元梯度单元1-1和1-2、泵A（3）和泵B（9）以及低温恒温控制箱8的操作，并接收来自检测器13的信号。

工作站16依据该系统是分体式还是整体式来设计专用的操作软件。前者是与通常的液相色谱仪联合使用，故该系统只是配合色谱系统使用，其软件是一种设计；而后者则要把通常色谱仪的软件与本专利设计的多维色谱系统一并考虑，作为一个整体设计软件，最终成为一个不含有任何通常色谱仪工作站的全新的工作站。

所述流路切换装置通过以下方式来切换六通阀4-2、三通阀5-1、三通阀5-2、三通阀5-3和三通阀5-4从而形成不同的流路：

（A）常规分离流路：将六通阀4-2切换至状态4-2b（端口1与端口6连通，端口2与端口3连通，而端口4与端口5连通），三通阀5-1切换至状态5-1b（端口1与端口3连通），三通阀5-2切换至任何状态，三通阀5-3切换至状态5-3a（端口1与端口2连通），三通阀5-4切换至状态5-4a（端口1与端口2连通），从而形成依次连通流动相储罐、四元梯度单元1-2、泵A（3）、色谱柱组7/色谱饼组14、检测器13和排液口17-1的常规分离流路。

一方面，在上述常规分离流路的阀门状态下，进一步将六通进样阀4-1切换成进样状态（端口1与端口2连通，端口3与端口4连通，而端口5与端口6连通），从而使样品环连通至本发明的二维液相色谱分离系统的流路中，从而形成进样状态的常规分离流路（称作流路A0）。

另一方面，在上述常规分离流路的阀门状态下，进一步将六通进样阀4-1切换成非进样状态（端口1与端口6连通，端口2与端口3连通，而端口4与端口5连通），从而使样品环不与本发明的二维液相色谱分离系统的流路连通，从而形成非进样状态的常规分离流路（称作流路A）。

（B）第一维分离流路：将六通阀4-2切换至状态4-2b（端口1与端口6连通，端口2与端口3连通，而端口4与端口5连通），三通阀5-1切换至状态5-1b（端口1与端口3连通），三通阀5-2切换至状态5-2b（端口1与端口3连通），三通阀5-3切换状态5-3a（端口1与端口2连通），三通阀5-4切换至状态5-4b（端口1与端口3连通），从而形成依次连通流动相储罐、四元梯度单元1-2、泵A（3）、色谱柱组7/色谱饼组14、检测器13、储液管组10和排液口17-2的流路。

一方面，在上述流路的阀门状态下，进一步将六通进样阀4-1切换成进样状态（端口1与端口2连通，端口3与端口4连通，而端口5与端口6连通），从而使样品环连通至本发明的二维液相色谱分离系统的流路中，从而形成进样状态的第一维分离流路（称作流路B0）。

另一方面，在上述流路的阀门状态下，进一步将六通进样阀4-1切换成非进样状态（端口1与端口6连通，端口2与端口3连通，而端口4与端口5连通），从而使样品环不与本发明的二维液相色谱分离系统的流路连通，从而形成根据本发明的多维液相色谱分离中的第一维分离流路（称作流路B）。

（C）第二维分离流路：将六通阀4-2切换至状态4-2a（端口1与端口2连通，端口3与端口4连通，而端口5与端口6连通），三通阀5-1切换至状态5-1a（端口1与端口2连通），三通阀5-2切换至状态5-2a（端口1与端口2连通），三通阀5-3切换状态5-3b（端口1与端口3连通），三通阀5-4切换至状态5-4a（端口1与端口2连通），从而形成流动相储罐、四元梯度单元1-1、泵A（3）、储液管组10、混合器12、色谱柱组7/色谱饼组14、检测器13和排液口17-1依次连通并且四元梯度单元1-1、泵B（9）和混合器12依次连通的第二维分离流路。

一般而言，在本发明的二维液相色谱分离系统处于第二维分离流路的情况下，六通阀4-2切换至非进样状态（端口1与端口6连通，端口2与端口3连通，而端口4与端口5连通），从而形成根据本发明的不收集中间分离产物时的第二维分离流路（称作流路C）。

常规液相色谱分离（单维液相色谱分离）

按照以下步骤对图2所示的根据本发明的2D-LC分离系统进行操作，可实现蛋白样品的常规液相色谱分离（一维液相色谱分离）：

(1)按本领域技术人员共知的知识，选择合适组成的流动相，开启泵A（3），设置合适的梯度洗脱条件，包括起始浓度，线性，还是非线性的梯度洗脱模式，梯度的时间等。通过四元梯度单元1-2以合适的流量从流动相储罐取出并输送合适的溶剂（例如分别从流动相储罐1和流动相储罐2取出并输送溶剂1和溶剂2），并且使分离装置处于连通任何一根色谱柱或色谱饼的状态，使色谱系统进行必要的平衡。

（2）进样：将六通进样阀4-1设置成非进样状态（通常在进样阀上标有“load”字样，此时进样阀的端口1与端口6连通，端口2与端口3连通，而端口4与端口5连通），向六通进样阀4-1的端口5送入混合蛋白样品（例如100μL），并使样品容纳于样品环中。接着就将进样阀的搬手转向标标有“inject”字样处，使样品进入色谱分离装置。这时进样阀设置成形成流路A0（进样时的常规分离流路）的状态。与此同时，该MD-LC系统的控制系统就会指令梯度洗脱系统同步开始工作。依此方式完成进样。

（3）常规液相色谱分离：进样完成后，将图2所示的根据本发明的2D-LC系统分离系统设置又会到流路A（未进样时的常规分离流路）的状态，通过梯度洗脱使蛋白样品在该色谱柱或色谱饼中分离成具有不同保留时间的各个馏分，并在检测器13中检测。分离后的样品从排液口17-1排出系统并收集。

在一个具体实施方案中，上述步骤（1）中的梯度洗脱为线性梯度洗脱。

在一个具体实施方案中，上述步骤（1）中的梯度洗脱为非线性梯度洗脱。

在一个具体实施方案中，上述步骤（1）中的梯度洗脱为非同步进样条件下的线性梯度洗脱。

根据需要进行分离的混合蛋白的性质，本领域技术人员可容易地选择合适的色谱柱类型，并可容易地选择作为液相色谱分离中的流动相的溶剂。以本领域的公知方式，本领域技术人员可容易地确定由泵A（3）输送溶剂的流量。

2D-LC分离流程

现以图2中的液相色谱分离系统为例，具体说明通过本发明的液相色谱分离系统来实施2D-LC分离的操作流程。

临界迁移时间t_CMP和临界迁移洗脱剂浓度C_CMP的计算

现以图1为例来说明t_CMP和C_CMP的计算方法。图1A显示了联苯（其为一种小分子有机物）、图1B显示了碳酸酐酶（一种大分子的蛋白）和图1C显示了15肽（GEPPPGKPADDAGLV）在非同步进样条件下（即进样时间与梯度洗脱时间不同，在图1中，后一次进样时间依次叫前一次进样推迟一分钟）的梯度洗脱分离（其中的液相色谱分离方法为常规液相色谱分离）。

图1E显示了碳酸酐酶的保留时间t_R与进样时间t_i的关系曲线。为了定量计算t_CMP，规定在第n_i次进样时的保留时间为t_R，n，第n_i-1次进样时的保留时间为t_R，n-1，从第1到第n_i次进样所得的t_R，1到t_R，n-1的n-1个t_R的平均值为t_Ra，标准偏差为±2σ。当平均值标准偏差＞2σ时，表明蛋白在色谱柱上发生了显著移动。根据以上标准，可确定蛋白发生显著移动的时刻应当落在t_R，n-1到t_R，1，即在图1D中垂直箭头所指的两次进样之间的区间内。

对图1D中垂直箭头右方的数据点进行拟合，用于拟合的函数为：

$>t_R=a+b{t}_i+c{t}_i^2$>（式3）

其中a、b、c为待拟合的常数，其与蛋白本身的特性相关。拟合后得到式（4）：

$>t_R=0.0707t_i^2-1.7985t_i+32.652$>（式4）

其中R²=0.9992。

将t_R=t_Ra+2σ带入式7，此时所得的ti即是临界迁移时间t_CMP。

随后，利用式（5）和式（6）分别求出临界迁移洗脱剂浓度C_CMP：

C_CMP=t_CMP×t_g                            （式5）

其中，t_g为线性梯度陡度，即单位时间内洗脱剂浓度的变化率，其计算方法为：

t_g=V％/t_T                                （式6）

其中，V％为线性梯度洗脱中以体积分数表示的洗脱剂浓度变化量，t_T为V％所对应的该线性梯度洗脱的进行时间。实际上，二维分离的进样时间较t_T早3-5分钟，这是因为其对该具体的实施例中的碳酸酐酶而言是合适的。

操作流程

（1）根据上文所述的方法，确定蛋白样品中每种需要在第二维或更多维分离中得以保留的蛋白的C_CMP。

（2）选择合适组成的流动相，开启泵A（3），设置合适的梯度洗脱条件，包括起始浓度，线性，还是非线性的梯度洗脱模式，梯度的时间等。通过四元梯度单元1-2以合适的流量从流动相储罐取出并输送合适的溶剂（例如分别从流动相储罐1和流动相储罐2取出并输送溶剂1和溶剂2），并且使分离装置处于连通任何一根色谱柱或色谱饼的状态，使色谱系统进行必要的平衡，

（3）第一维分离：将六通进样阀4-1设置成“load”状态（端口1与端口6连通，端口2与端口3连通，而端口4与端口5连通），向六通进样阀4-1的端口5送入混合蛋白样品（例如100μL），并使样品容纳于样品环中。随后，将图1所示的根据本发明的2D-LC分离系统设置成形成流路B0（进样时的第一维分离流路）的状态，开启泵A（3），通过四元梯度单元1-2以合适的流量从流动相储罐取出并输送合适的溶剂，从而使容纳于样品环中的样品进入根据本发明的2D-LC分离系统。随后将图2所示的根据本发明的2D-LC分离系统设置成形成流路B（非进样时的第一维分离流路）的状态，开启泵A（3），通过四元梯度单元1-2以合适的流量从流动相储罐取出并输送作为第一维液相色谱分离的流动相的合适溶剂（例如分别从储罐1和储罐2取出并输送溶剂1和溶剂2），并且通过多通阀6-1和6-2使用于第一维色谱分离的色谱柱或色谱饼连通，通过梯度洗脱使混合蛋白样品在该色谱柱或色谱饼中分离成具有不同保留时间的各个馏分，并在检测器13中检测。

（4）收集和储存中间馏分：对于需要进行第二维液相色谱分离的馏分，通过切换八通阀11-1和八通阀11-2使储液管10-2至集存装置10-8的任何一个被连通，从而将该馏分收集并储存于该集存装置中。对于不需要进行第二维液相色谱分离的馏分，通过切换八通阀11-1和八通阀11-2使集存装置10-1被连通，从而使该馏分经过集存装置10-1流过检测器13，并从至排液口17-2图中无标识排出系统。当所有馏分均已储存于某个集存装置中或被排出系统后，第一维液相色谱分离完成。

（5）第二维分离：随后将图1所示的根据本发明的2D-LC分离系统设置成形成流路C（第二维分离流路）的状态，切换八通阀11-1和八通阀11-2以使得任何一个装有经第一维液相色谱分离得到的中间馏分的集存装置被连通，切换多通阀6-1和6-2使用于第二维色谱分离的色谱柱或色谱饼被连通。开启泵A（3），通过四元梯度单元1-2以合适的流量从流动相储罐取出并输送合适的溶剂（例如从储罐3取出并输送溶剂3），以使该集存装置中的中间级分流入混合器12中，同时开启泵B（9），通过四元梯度单元1-1以合适的流量从流动相储罐取出并输送作为第二维液相色谱分离的流动相的合适溶剂（例如分别从储罐3和储罐4取出并输送溶剂3和溶剂4），从而使所述中间级分与所述流动相混合得到第二维分离的进样混合物，将所述进样混合物进样至第二维分离的色谱柱中，并且通过对泵A（3）和四元梯度单元1-2以及泵B（9）和四元梯度单元1-1的流量进行调节，使该进样混合物中的洗脱剂浓度C低于该中间馏分中的所有需要在第二维分离中得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度，从而使这些蛋白保留于所述色谱柱或色谱饼中，完成第二维进样。

随后，通过梯度洗脱使所述进样混合物在所述色谱柱或色谱饼中分离成不同的馏分并在检测器13中检测。经过第二维液相色谱分离分离后的样品从排液口17-2排出系统并收集于级分收集器15中。

重复此步骤的操作，使集存装置中所有需要进行第二维液相色谱分离的中间级分都得以分离。

在一个具体实施方案中，上述步骤（4）中的梯度洗脱为线性梯度洗脱。

在一个具体实施方案中，上述步骤（4）中的梯度洗脱为非线性梯度洗脱。

根据需要进行分离的混合蛋白的性质，本领域技术人员可容易地选择合适的色谱柱或色谱饼用于第一维色谱分离和第二维色谱分离，并可容易地选择作为第一维色谱分离和第二维色谱分离中的流动相溶剂。

缓冲液交换

在前述二维液相色谱分离流程的步骤（4）中的第二维进样之前或进样过程中完成后，根据本发明的多维液相色谱分离方法或2D-LC分离方法还可包括以下步骤：

①缓冲液交换：将第二维分离中所用的流动相作为缓冲液（例如流动相储罐3和流动相储罐4中的溶液3和溶液4），通过泵A（3）和/或泵B（9）将该缓冲液输送至第二维分离的色谱柱或色谱饼中，其中所述缓冲液中的洗脱剂浓度高或低于所述中间馏分中所有需要在下一维分离得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度，从而至少部分地置换所述色谱柱中原有的第一位分离的流动相（如溶剂1和溶剂2）。

②如将所收集的经前一维分离后的馏分作为流动相X（X表明其组成已知，但对不同蛋白而言，组成均不相同），也将其视为缓冲液，如上述的相同方式，进行缓冲液交换，则第二次进样便与缓冲溶液交换同时进行。随后再对所述中间馏分进行第二维分离。

③在二次进样完成后，将收集液从集存装置中推动出来的流动相如溶液2又与溶液3或4，或以适当比例混合，实现2D-LC体系的再平衡。

④色谱柱须周期性的用强洗脱剂对其进行清洗，可用溶液泵A或B从贮液罐中取出任何一种溶液清洗之。

更多维液相色谱分离系统

虽然前述具体实施方案是针对图2所示的2D-LC分离系统及其操作方法进行说明，本领域技术人员容易将其扩展至更多维液相色谱分离系统。

本领域技术人员应理解，与图2的2D-LC分离系统相比，更多维液相色谱分离系统可包括更多的流动相储罐，而其输液装置也相应地具有更多的输液通道。

根据本领域的公知常识，本领域技术人员应当能对图2的2D-LC分离系统的流路切换装置作适当的改变，使得经过第二维分离后得到的需要进一步分离的馏分不从系统中流出，而是作为中间馏分而再次被收集并储存于集存装置中，并在后续的更多维分离中通过与前述第二维分离步骤相同的方式将该中间馏分进一步分离。

以下是通过图2的二维液相色谱分离系统来分离蛋白样品的实施例。

实施例1通过商品柱奥岚WCX柱对7种蛋白的2D-LC（WCX×HIC）分离

根据前述的二维液相色谱分离系统和二维液相色谱分离方法，本实施例从含肌红蛋白（Myo）、核糖核酸酶（RNase）、细胞色素c（Cyt-c）、α-糜原蛋白（α-Chy）、溶菌酶（Lys）、碳酸酐酶（Car）和α-淀粉酶（α-Amy）从该7种蛋白的混合物中完全分离出这。其中，第一维分离采用弱阳离子交换（WCX）分离模式，而第二维分离采用疏水相互作用（HIC）分离模式。此实施例中使用的色谱柱为商用Shim-pack PA-CM的WCX色谱柱，实为WCX/HIC混合模式色谱柱（150毫米×7.9毫米），在WCX模式的第一维分离和HIC模式的第二维分离中均使用该色谱柱。

分离结果如图3所示，图中还给出了盐浓度随时间的变化曲线。根据前文所述的2D-LC分离流程进行分离：

在WCX模式的第一维分离中，用泵1输送用于WCX模式（图3的左边（图3中左方的3、4峰））的流动相的盐溶液并进行梯度洗脱，使Myo、RNase和Lys得到分离（图3左方的1、2、5峰），而Car和α-Amy不保留（图3左方的6、7峰），Cyt-c和α-Chy也不能完全分开（图3左方的3、4峰）。因此，经第一维分离得到了Myo、RNase和Lys蛋白，并将含Car和α-Amy的中间馏分以及含Cyt-c和α-Chy的中间馏分分别收集在集存装置的储液管10-2和储液管10-3中。

第一维分离结束后，提高盐的浓度，根据前文所述的方法进行二次进样、缓冲液置换、同时实施了第二维的HIC分离系统的再平衡（图3中盐浓度曲线的平台区域内）。其方法是用泵B（9）向混合器12中输送HIC的A液，并通过调节泵A（3）和泵B（9）中液体的流量使得经混合后的浓度落在Cyt-c和α-Chy的临界迁移洗脱剂浓度C_CMP以内（该C_CMP准确数值已通过，如图1所示的常规液相色谱分析而预先得到）。在该二次进样、缓冲液置换和第二维分离系统的再平衡后，中间馏分Cyt-c和α-Chy会全部保留在该同一根色谱柱中。随后通过梯度洗脱进行HIC模式下的再下一步色谱维分离，Cyt-c和α-Chy被分离开来（图3中的3’和4’峰）。

如上述方式将含有含Car和α-Amy的中间馏分再次进样次、缓冲液交换，第三次系统（但为第二次HIC分离）再平衡。其方式为：用泵B（9）向混合器12中输送HIC的A液，并通过调节泵A（3）和泵B（9）中液体的流量使得经混合后的洗脱剂浓度落在Car和α-Amy的临界迁移洗脱剂浓度C_CMP以内（该C_CMP已通过常规液相色谱分析而预先得到）。该上述的三个过程完成后，中间馏分中的Car和α-Amy全部保留在色谱柱中。随后通过梯度洗脱进行HIC模式下的色谱分离，Car和α-Amy被分离开来（图3中的6’和7’峰）。

如上所述，利用根据本发明的液相色谱分离系统，在80分钟内完成了前述7种蛋白的完全分离。

此实施例中的色谱柱、流动相以及色谱条件如下：

色谱柱：[西安奥岚科技开发公司生产的WCX柱，100mm x 4.6mm）；

HIC流动相：A液20mmol/L KH₂PO₄+3.0mol/L(NH₄)₂SO₄(pH=6.5)；B液：20mmol/L KH₂PO₄(pH=6.5)；

WCX流动相：A液10mmol/L KH₂PO₄(pH：6.5)；B液：10mmol/L KH₂PO₄+1mol/LNaCl(pH=6.5)；

色谱条件：

0-15分钟：100%A-80%A(20%B)，2.0mL/min；

15-20分钟：80%A(20%B)-50%A(50%B)；

20-25分钟：50%A(50%B)；

25-28分钟：100%C，4.0mL/min；

28-33分钟：100%C，1.0mL/min+混合泵：100%C，3.0mL/min；

33-53分钟：100%C-100%D，2.0mL/min；

53-56分钟：100%C，4.0mL/min；

56-61分钟：100%C，1.0mL/min+混合泵：100%C，3.0mL/min；

61-81分钟：100%C-100%D，2.0mL/min；

81分钟至结束：100%D。

实施例2通过商品Shim-pack PA-CM  的WCX柱和商品TSKgelG4000SWXLSEC柱共两色谱柱实施三维（多维）3D-LC（WCX×HIC×SEC）对α-糜原蛋白(α-Chy)和胰蛋白酶（Try）同时进行纯化并除盐。G4000SWXL

根据前述的2D-LC分离系统和2D-LC分离方法，本实施例从按常规方法制备且除油后的牛胰腺提取液中同时提纯α-Chy和Try，然后再对分离所得到的蛋白分别除盐。其中，第一维分离采用WCX模式，第二维分离采用HIC模式。因二维流出液体积较大且流出液中目标蛋白的浓度随时间在不断地变化，加之并不能一次性完全进样到SEC柱上，必须收集在椭圆形的储液管中，并伴随着用振荡器的搅拌使其混合均匀后，分次进样到第三维采用SEC模式除盐。分离结果如图4所示，图中还给出了盐浓度随时间的变化曲线。根据前文所述的2D-LC分离流程进行分离：

在WCX模式的第一维分离中，用泵A（3）输送用于WCX模式的流动相的盐溶液并进行梯度洗脱，使α-Chy和Try蛋白初步分离（图4中的1、2峰），然而经初步分离后的纯度尚不能达到要求。因此，将初步分离后的含α-Chy和Try蛋白的中间馏分别收集在储液装置的储液管10-2和储液管10-3中。

第一维分离结束后，根据前文所述的方法将含Try(1)和α-Chy(2)蛋白的中间馏分[（在图4中色谱峰Try(1)和α-Chy(2)）分别收集在两个集存装置内。根据前文所述的方法进行二次进样α-Chy(2)、缓冲液置换、同时实施了第二维的HIC分离系统的再平衡（图4中间所示的盐浓度曲线的平台区域部分）。其方法是用泵B（9）向混合器12中输送用于HIC分离模式的A液，并通过调节泵A（3）和泵B（9）中液体的流量使得经混合后的浓度落在α-Chy的临界迁移洗脱剂浓度C_CMP以内（该C_CMP准确数值已通过，如图1所示的常规液相色谱分析而预先得到）。在该二次进样、缓冲液置换和第二维分离系统的再平衡后，中间馏分α-Chy会全部保留在该同一根色谱柱中。随后通过梯度洗脱进行HIC分离模式下的再下一步色谱维分离后以得到纯化后的α-Chy（2’）。

根据前文所述的方法进行二次进样Try(1)、缓冲液置换、同时实施了下一维的第二次HIC分离系统的再平衡（图4右方所示的盐浓度曲线的平台区域那）。其方法是用泵B（9）向混合器12中输送用于HIC分离模式的A液，并通过调节泵A（3）和泵B（9）中液体的流量使得经混合后的浓度落在Try(1)的临界迁移洗脱剂浓度C_CMP以内（该C_CMP准确数值已通过，如图1所示的常规液相色谱分析而预先得到）。在该二次进样、缓冲液置换和第二维分离系统的再平衡后，中间馏分Try(1)会全部保留在该同一根色谱柱中。随后通过梯度洗脱进行HIC模式下的再下一步色谱维分离后以得到纯化后的Try(1’)。

将经二维色谱纯化后的α-Chy和Try分别收集在的一个，椭圆形集、储液管中，振荡5min使所收集的样品混匀后分别进样到商品TSKgelG4000SW_xl SEC柱中除盐。

如上所述，利用根据本发明的液相色谱分离系统，在70分钟内完成了α-Chy和Try蛋白的分离提纯，其纯度分别达82%和95%，总质量回收率分别为85.0%和83.5%，活性回收率分别为59.4%和76.5%，因在线收集、储存，和再进样机除盐，与通常的离线除盐后的质量和活性回收率50~70%比较，除盐后该二蛋白的质量和活性回收率大大地提高到80~90%。

分离中采用非线性梯度洗脱模式，其中所用的色谱柱、流动相以及色谱条件如下：

WCX色谱柱：商品Shim-pack PA-CM(100mm×7.5mm I.D)。

WCX用流动相：A液为0.02M的三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl，pH 6.5）；B液为0.02M的Tris-HCl+1.0M的氯化钠（pH 6.5）；

HIC用流动相：C液由3.0M的硫酸铵+0.05M的磷酸二氢钾（PBS，pH 7.0）组成；D液为0.02M的PBS（pH 7.0）。

SEC色谱柱：TSK-GEL G4000SWXL（300x7.8mm,I.D.流动相：0.02mol/LNaCl溶液`。流速：1.0mL/min,

梯度洗脱条件：

0-20分钟：100%A-50%A(50%B)，1.0mL/min；

20-25分钟：50%C(50%D)，3.0mL/min；

25-30分钟：50%C(50%D)，1.0mL/min+100%C,1.0mL/min；

30-40分钟：50%C(50%D)-100%D，1.0mL/min；

40-45分钟：50%C(50%D)，3.0mL/min；

45-50分钟：50%C(50%D)，1.0mL/min+100%C，1.0mL/min；

50-60分钟：50%C(50%D)–100%D，1.0mL/min；

60-65分钟：100%D结束。

进样量：α-Chy 10μL，Trypsin 20μL，Trypsin和α-Chy的蛋白浓度均为10mg/mL。

实施例3，在线单柱二维液相色谱柱（2D（WCX，HIC）快速纯化牛胰腺中的细胞色素c

首先从牛胰腺中粗提取细胞色素c：将新鲜的牛胰脏去除油脂和结缔组织并洗净后迅速放入-20°C的冰箱中保存的；取冷冻牛胰腺切片后，用绞肉机绞成肉粉末，然后加入2倍体积经硫酸酸化（pH=4）水在搅拌条件下提取，每隔3小时再用1mo/L H₂SO₄调节pH一次，使pH稳定至3.5-4.0之间，在低温下（4°C）搅拌提取12小时以上；用1.0mol/L的NH₄OH调pH至6.5，用四层纱布压挤过滤，收集滤液，在4°C下静置；最后在10,000rpm转速下离心20min，收集上清液即为细胞色素c的粗提液。所有操作应在4°C进行，滤液仍在-20°C条件下保存备用。

此实施例所用的色谱方法为：如图5所示，在第一维色谱分离中，在流动相流速为1.0mL/min和0至1.0mol/L的NaCl的线性梯度洗脱的洗脱条件下，在5.5-10.5min区间内，在线收集含Cyt c的一维样品到定量环中保存。接着利用2.5mL/min大流速，使用3.0mol/L的硫酸铵快速平衡色谱系统10min，然后以实施例3中所示的一维和二维的色谱分离方法的操作相同，以流速为1.0mL/min，将一维收集液从集、储环中排出，并同时与从B泵输送的，在流速为2.0mL/min的条件下送出3.0mol/L溶液在色谱仪的混合器中混合，如此可将原来第一维收集液中盐浓度从极低提高到2.0mol/L，足以能在该相同2D（WCX，HIC）柱中在HIC分离模式下具有足够强的保留能力，该过程能在7.0min内完成。最后将保留的蛋白用3.0mol/L硫酸铵到进行线性梯度洗脱10min，并收集在43.5-46.5min时间范围内的馏分。

此实施例中所用的色谱柱、流动相以及色谱条件如下：

西安奥岚-2D（WCX,HIC）色谱柱（硅胶基质，颗粒直径，5μm,孔径30nm;50mm×4.6mmI.D）。

IEC模式：溶液1，20mmol/L KH₂PO₄（pH=6.5）；溶液2，20mmol/L KH₂PO₄+1mol/L NaCl（pH=6.5）；

HIC模式：溶液3，20mmol/L KH₂PO₄+3.0mol/L(NH₄)₂SO₄（pH=6.5）；溶液4，20mmol/L KH₂PO₄（pH=6.5）。

非线性梯度洗脱模式（图5中的虚线所示）：

0-20分钟：100%溶液1，0-100%；溶液2，流速为1.0mL/min；

20-30分钟：100%溶液3，流速为2.5mL/min；

30-37分钟：A泵100%，溶液3，1.0mL/min+B泵100%溶液3，2.0mL/min；

37-47分钟：100%溶液3-100%溶液4，流速为1.0mL/min；

47-52分钟：100%D。

将分别经WCX和HIC的一维，二维分离和收集的从牛胰腺的提取液中的Cytc样品，在经处理后，经过纯度扫描后各个电泳带中目标蛋白Cyt c的纯度见表1。

表1牛胰腺中Cyt c分离纯化电泳薄层扫描数据

为将IEC×HIC二维液相色谱分离结果的检验还用反相液相色谱对IEC-HIC二维液相色谱收集的Cyt c的纯度进行了测定，并对其纯度进行RPLC色谱分析，经计算其纯度达到97%以上。