稳定化的纤连蛋白结构域组合物、方法和使用

摘要

本发明涉及基于III型纤连蛋白(FN3)蛋白质的共有序列的蛋白质支架，所述III型纤连蛋白(FN3)蛋白质例如来自人纤连蛋白（人生腱蛋白）的第十个FN3重复序列，包括编码蛋白质支架的分离的核酸、载体、宿主细胞、及其制备和使用方法。本发明的蛋白质支架分子显示出增强的热和化学稳定性，同时存在六个可修饰的环结构域，其可经工程改造为形成能够结合靶标的结合配偶体，用于在诊断和/或治疗组合物、方法和装置中应用。

说明书

背景技术

技术领域

本发明涉及具有新性质的蛋白质支架，所述新性质包括结合细胞靶标 的能力。更具体而言，本发明涉及基于III型纤连蛋白(FN3)重复序列的共有 序列的蛋白质支架。

关于本领域的讨论

当靶标分子需要具有高亲和性和特异性时，单克隆抗体是最广泛使用 的治疗性蛋白质类型。但是，可被工程改造成结合这种靶标的非抗体蛋白质 在生物医药行业中也具有很大的重要性。这些“另类的支架”蛋白质可具有 优于传统抗体的优点，因为它们尺寸小、缺乏二硫键、稳定性高和能够在原 核生物宿主中表达。新纯化方法是可容易应用的；它们容易地缀合至药物/ 毒素，有效穿透到组织内，并且容易地格式化成多特异性结合物(Skerra 2000 J Mol Recognit(《分子识别杂志》)13(4)：167-87；Binz和Pluckthun 2005 Curr Opin Biotechnol(《生物技术近期述评》)16(4)：459-69)。

一种这样的另类支架是免疫球蛋白(Ig)折叠。这个折叠存在于抗体以及 数千种非抗体蛋白质的可变区。已证实，一种这样的Ig蛋白，即人纤连蛋 白的第十个III型纤连蛋白(FN3)重复序列，能容忍表面所暴露的环中的许多 突变而保持总体的Ig折叠结构。因此，已建立了这些环的氨基酸变体的文 库，并选择出了针对多个不同靶标的特异性结合物(Koide等人，1998 JMol Biol(《分子生物学杂志》)284(4)：1141-51；Karatan等人2004 ChemBiol(《化学生物学》)11(6)：835-44)。已发现这种经工程改造的FN3结 构域以高亲和力结合靶标，同时保持重要的生物物理性质(Parker等人， 2005 Protein Eng Des Sel(《蛋白质工程、设计与选择》)18(9)：435-44)。

潜在的另选支架分子的合乎需要的物理性质包括热稳定性高以及热折 叠和解折叠之间可逆。已应用了几种方法来提高蛋白质和酶的表观热稳定 性，包括基于与高度相似的热稳定性序列的比较进行的合理设计、稳定化的 二硫桥的设计、增加α-螺旋倾向的突变、盐桥的工程改造、蛋白质表面电 荷的变更、定向进化和共有序列的组成(Lechmann和Wyss 2001 Curr Opin Biotechnol(《生物技术近期述评》)12(4)：371-5)。高热稳定性是这种支 架的期望性质，因为它可提高所获得的重组蛋白质的产率，改善纯化的分子 的可溶性，改善细胞内支架的活性，降低免疫原性和尽可能减少在制造中需 要冷链。

发明内容

本发明提供基于III型纤连蛋白(FN3)重复序列蛋白的蛋白质支架、编码 核酸或互补核酸、载体、宿主细胞、组合物、组合、制剂、装置、及其制备 和使用方法。在一个优选的实施例中，蛋白质支架由来自人生腱蛋白C(下 文称“生腱蛋白”)的多个FN3结构域的共有序列组成。在又一个优选的 实施例中，本发明的蛋白质支架是15个FN3结构域的共有序列(SEQ ID NO： 1-15)或其变体。在本发明的一个特定方面，本发明的蛋白质支架具有取代 残基，所述取代残基引起该支架蛋白显示出抵抗热和化学变性的能力增强。 本发明的蛋白质支架可以通过本领域已知的方法进行工程改造，包括在支架 内的指定环区域处插入残基，以形成对于结合配偶体选择性的结合结构域。 结合配偶体可以是可溶分子或细胞锚定分子，例如受体蛋白质的细胞外结构 域。

在一个实施方案中，本文描述的就固有热和化学稳定性选择的SEQ ID NO：16(Tencon)的基于共有区的序列中的特异性取代使Tencon支架的热稳 定性改善高达11℃，并且使GdmCl诱导的变性的中点从3.4M转变为大于 5M。在一个实施例中，对于SEQ ID NO：16(Tencon)的特异性取代是单一 的，例如N46V、E14P和E86I，并且在一个另选的实施例中，取代是多重 的，例如N46V和E86I、E14P和N46V和E86I中的全部、以及L17A和 N46V和E86I中的全部。稳定性增强的基于Tencon的多肽提供具有改善的 易于纯化、制备和增加的储存期限的支架。通过将随机化的肽引入稳定化的 支架的环内，可以产生总体稳定性改善的经工程改造的结合配偶体。

本发明的蛋白质支架可以作为单体单元使用或连接，以形成具有相同 或不同结合配偶体特异性的聚合物结构。基于Tencon蛋白质支架的分子可 以进一步进行修饰，以增强与生物分布、在体内的持久性、或治疗功效例如 与分子的结合相关的一种或多种体内性质，所述分子改变细胞、特别是上皮 细胞摄取，例如抗体的Fc区，或设计为结合血清蛋白质例如白蛋白结合结 构域的分子。在另外的实施例中，可使本发明的蛋白质支架结合到可编码该 蛋白质支架的核酸分子。

本发明还提供至少一种用于在宿主细胞中表达至少一种其序列与多个 FN3结构域的共有序列相关的蛋白质支架多肽的方法，所述方法包括将本文 所述的宿主细胞在其中至少一种蛋白质支架以可检测和/或可回收的量表达 的条件下进行培养。

本发明还提供至少一种组合物，其包含：(a)基于多个FN3结构域的共 有序列的蛋白质支架和/或本文所述的编码核酸；和(b)合适的和/或可药用的 载体或稀释剂。

本发明进一步包括生成基于III型纤连蛋白(FN3)重复序列蛋白的蛋白质 支架的文库的方法，所述III型纤连蛋白(FN3)重复序列蛋白优选为多个FN3 结构域的共有序列，其更优选地为来自具有增强的热和化学稳定性的人生腱 蛋白的多个FN3结构域的共有序列。文库可通过改变单环的氨基酸组成或 者通过同时改变支架分子的多个环或另外的位置来产生。被改变的环可相应 地延长或缩短。可将这种文库产生成包括每个位置处的所有可能的氨基酸或 者指定的氨基酸子集。文库成员可用于通过展示进行筛选，如体外展示 (DNA、RNA、核糖体展示等)、酵母展示、细菌展示和噬菌体展示。

本发明的蛋白质支架提供增强的生物物理学性质，例如在高渗透强度 条件下的稳定性和在高浓度下的可溶性。支架蛋白的结构域不是二硫键连接 的，使得其能够在缺乏二硫键形成所需的酶的系统中表达和折叠，所述系统 包括原核生物系统，例如大肠杆菌(E.coli)和体外转录/翻译系统，例如兔 网织红细胞裂解物系统。

在另外的一个方面，本发明提供通过用靶标淘选本发明的支架文库并 检测结合物来生成结合特定靶标的支架分子的方法。在其他相关的方面，本 发明包括可用于产生具有期望的活性(例如能够以一定的亲和力结合靶标蛋 白)的蛋白质支架并使其亲和力成熟的方法。亲和力成熟可通过反复进行几 轮诱变并用诸如噬菌体展示或体外展示的系统进行选择来完成。此过程中的 诱变可以是对特定的支架残基的定点诱变、易错PCR所致的随机诱变、 DNA改组和/或这些技术的组合所产生的结果。本发明进一步提供了本文描 述的任何发明。

附图说明

图1图1.在NuPAGE 4-12％Bis-Tris胶(英潍捷基公司(Invitrogen))上 进行并用考马斯蓝染色对纯化的Tencon所进行的SDS-PAGE分析。N代表 天然条件，并且R代表还原条件。

图2示出在PBS中的Tencon的圆二色性分析。

图3示出在PBS中的来自生腱蛋白的第三个FN3结构域和Tencon的圆 二色性分析，其中分别获得54℃和78℃的解链温度。

图4示出pTencon-pIX的噬菌粒质粒设计。表达是由Lac启动子来驱 动，并且分泌是通过OmpA信号序列进行。

图5示出myc-Tencon可以在M13噬菌体上展示，使用ELISA证实噬 菌体与抗Myc包被的孔、CNTO95包被的孔和未包被的孔的结合。

图6是描述人生腱蛋白的第三个FN3结构域的环结构的图。

图7示出通过IgG选择的ELISA输出的筛选，由此就与生物素化的 IgG或作为对照的生物素化的HSA的结合测试各个克隆。

图8A-B是曲线图，其示出如通过280nm的荧光激发和360nm的发射 测量的关于GdmCl诱导的单一突变型(A)和组合突变型(B)的变性。

具体实施方式

缩写

ADCC＝抗体依赖细胞介导的细胞毒性；CDC＝补体依赖细胞毒性； DSC＝差示扫描量热法ΔG＝吉布斯自由能；IgG＝免疫球蛋白G；Tm＝解链 温度；

定义和术语解释

术语“抗体”或“抗体部分”意欲涵盖抗体及其消化片段、指定部分 和变体，包括但不限于抗体模拟物或者包含模拟某抗体或其指定片段或部分 的结构和/或功能的抗体部分，包括但不限于单链抗体、单结构域抗体、微 型抗体及其片段。功能片段包括结合至所关注的靶标抗原的抗原结合片段。 例如，术语抗体涵盖能够结合靶标抗原或其部分的抗体片段，包括但不限于 Fab片段(例如通过木瓜蛋白酶消化)、Fab′片段(例如通过胃蛋白酶消化 和部分还原)和F(ab’)₂片段(例如通过胃蛋白酶消化)、facb片段(例如 通过纤溶酶消化)、pFc’片段(例如通过胃蛋白酶或纤溶酶消化)、Fd片 段(例如通过胃蛋白酶消化、部分还原和重聚集)、Fv或scFv片段(例如 通过分子生物学技术)。抗体或片段可衍生自任何哺乳动物，例如、但不限 于人、小鼠、兔、大鼠、啮齿动物、灵长类、骆驼科、山羊或其任何组合， 并且包括分离的人、灵长类、啮齿动物、哺乳动物、嵌合、人源化和/或 CDR-移植抗体、免疫球蛋白、切割产物和其他指定部分及其变体。

术语“表位”意指能够特异性结合至抗体或经工程改造的结合结构域 例如基于支架的蛋白质的一个或多个环的蛋白质决定簇。表位通常由分子的 化学活性表面基团例如氨基酸或糖侧链组成，且通常具有特定的三维结构特 征，以及比电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于与前者而不是后者 的结合在变性溶剂存在的情况下会丧失。构象表位起因于靶标分子的构象折 叠，所述构象表位在来自靶标分子线性序列的不同部分的氨基酸在3维空间 中以紧密接近性集合时出现。这种构象表位一般分布在质膜的细胞外侧上。

本文所用的术语“Fc”、“含Fc的蛋白质”或“含Fc的分子”是指具 有至少一个免疫球蛋白CH2和CH3域的单体、二聚体或异二聚体蛋白质。 CH2和CH3域可以形成蛋白质/分子(例如抗体)的二聚体区域的至少一部 分。

本文所用的术语“稳定性”指分子在生理条件下维持折叠的状态的能 力，从而使得它保留至少一种其正常功能活性，例如与靶标分子如细胞因子 或血清蛋白质的结合。蛋白质稳定性和蛋白质易感性的测量可以被看作是蛋 白质完整性的相同或不同方面。蛋白质对下述是敏感或“易感的”：通过 热、通过紫外线或电离辐射引起的变性，环境同渗容摩和pH中的变化(如 果在液体溶液中)、通过小孔尺寸过滤、紫外线辐射、电离辐射例如通过γ 照射、化学或热脱水强加的机械剪切力，或任何其他可以引起蛋白质结构破 坏的作用或力。分子的稳定性可以使用标准方法进行测定。例如，分子的稳 定性可以通过测量热解链(“TM”)温度进行测定。TM是在其下1/2的分子变 得解折叠的以°摄氏(℃)表示的温度。一般来说，TM越高，该分子越稳 定。除了热外，化学环境也改变蛋白质维持特定的三维结构的能力。

化学变性同样可以通过多种方法进行测量。化学变性剂是已知破坏蛋 白质内的非共价相互作用和共价键的试剂，所述非共价相互作用和共价键包 括氢键、静电键、范德华力、疏水相互作用或二硫键。化学变性剂包括盐酸 胍、硫氰酸胍、尿素、丙酮、有机溶剂(DMF、苯、乙腈)、盐(硫酸铵 溴化锂、氯化锂、溴化钠、氯化钙、氯化钠)；还原剂(例如二硫苏糖醇、 β-巯基乙醇、二硝基硫代苯和氢化物例如硼氢化钠)、非离子和离子型洗涤 剂、酸(例如盐酸(HCl)、乙酸(CH₃COOH)、卤化乙酸)、疏水分子(例如 磷脂)、和靶向变性剂(Jain R.K和Hamilton A.D.，Angew.Chem.(《应 用化学》)114(4)，2002)。变性程度的定量可以依赖功能性质例如结合靶 标分子的能力的丧失，或通过物理化学性质例如聚集的倾向、先前溶剂无法 接近的残基的暴露、或二硫键的破坏或形成。

就稳定性丧失而言，即蛋白质的“变性”意指其中赋予该蛋白质的功 能性质的一些或全部三维构象已丧失的过程，具有活性和/或可溶性的伴随 丧失。在变性过程中被破坏的力包括分子内键，包括但不限于静电键、疏水 键、范德华力、氢键和二硫键。蛋白质变性可以通过施加于该蛋白质或包含 该蛋白质的溶液的力引起，所述力例如机械力(例如，压缩力或剪切力)、 热、渗透应激、pH的变化、电场或磁场、电离辐射、紫外线辐射和脱水、 和通过化学变性剂。

本文所用的“治疗有效的”处理或量指足够数量的量，以引起病症或 其症状原因的可检测的减轻或改善。“改善”指接受该治疗的患者中病症的 有害效应的减轻。本发明的受试者优选是人，然而，可以设想需要用于有害 状况、病症或疾病的治疗的任何动物可以用设计用于那个目的的基于支架的 蛋白质进行处理。

综述

本发明提供基于III型纤连蛋白(FN3)重复序列蛋白的共有序列的分离 的、重组的和/或合成的蛋白质支架，包括但不限于衍生自哺乳动物的支 架，以及组合物和包含至少一种编码基于该共有FN3序列的蛋白质支架的 多核苷酸的编码核酸分子。本发明进一步包括但不限于制备和使用这种核酸 和蛋白质支架的方法，包括作为开发平台、以及用于诊断组合物和治疗组合 物、方法和装置。

本发明的蛋白质支架由于其小型致密尺寸而提供超过基于更大型免疫 球蛋白的生物治疗药物的优点。特别地，生物分子的尺寸和形状可以影响其 被局部、经口或跨越血脑屏障施用的能力；在低成本系统例如大肠杆菌中表 达的能力；经工程改造成与多重靶标或相同靶标的多重表位结合的双特异性 或多特异性分子的能力，对于即与活性物、聚合物和探针缀合的适合性；被 配制为高浓度的能力；和这种分子有效穿透患病组织和肿瘤的能力。

此外，所述蛋白质支架具有抗体的许多性质，这和它们的与抗体可变 区相仿的折叠有关。这个取向使得FN3环能够像抗体互补决定区(CDR)那样 被暴露。它们应当能够结合细胞靶标，且可对环进行改变(例如亲和力成 熟)以改善某些结合性质或相关性质。

本发明的蛋白质支架的六个环中的三个拓扑对应于置于在性质中已知 是高变的可变结构域的环(高变结构域环(HVL))处的抗体的结合结构域、 在如由Kabat定义为互补决定区(CDR)的残基的位置处，即抗体的抗原结合 区，而剩余的三个环是以类似于抗体CDR的方式进行表面暴露的。这些环 横跨于或置于下表3和图6中所示的SEQ ID NO：16的残基13-16、22-28、 38-43、51-54、60-64和75-81之处或附近。优选地，将残基22-28、51-54 和75-81之处或附近的环区域加以改变，以获得结合特异性和亲和力。将这 些环区域中的一个或多个与其他环区域和/或其他链段随机化排列，但保持 它们的序列作为主链部分，以扩充文库，并可从该文库选择出对特定的蛋白 质靶标具有高亲和力的强效结合物。所述环区域中的一个或多个可像抗体 CDR与靶标蛋白发生相互作用那样与该蛋白发生相互作用。

本发明的支架可掺入其他的亚单位，例如通过共价相互作用掺入。可 将抗体恒定区的全部或一部分附着至该支架，以赋予抗体样性质，尤其是与 Fc区相关的那些性质，例如补体活性(ADCC)、半寿期等。例如，可例如通 过修饰C1q结合和/或FcγR结合从而改变CDC活性和/或ADCC活性，来提 供和/或控制效应子功能。“效应子功能”负责激活或减弱生物活性(例如 在受试者中)。效应子功能的例子包括但不限于：C1q结合；补体依赖性细 胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞 噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。这种效应子 功能可以需要Fc区以与结合结构域(例如蛋白质支架环)组合，并且可以 使用多种测定(例如Fc结合测定、ADCC测定、CDC测定等)进行评估。

另外的部分可以与基于支架的多肽或变体附加或结合，例如毒素缀合 物、白蛋白或白蛋白结合物、聚乙二醇(PEG)分子可以附着至支架分子用于 期望性质。这些部分可以是与支架编码序列的内嵌式融合物，并且可以通过 标准技术生成，例如通过使用可公开获得的编码核苷酸序列构建的重组融合 物编码载体表达融合蛋白。作为另外一种选择，化学方法可以用于将该部分 附着至重组产生的基于支架的蛋白质。

本发明的支架可以以单聚形式用作单特异性支架，或者以多聚体形式 用作双特异性或多特异性支架(针对不同的蛋白质靶标或同一蛋白质靶标上 的多个表位)。在每个支架单位之间的附着可以是共价或非共价的。例如， 二聚双特异性支架有一个亚单位对第一靶标蛋白或表位具有特异性，而第二 个亚单位对第二靶标蛋白或表位有特异性。支架的各亚单位可以以多种能提 高抗原结合的价位从而提高抗原结合的亲合力的构象进行连接。

支架蛋白的生成和生产

至少一种本发明的支架蛋白可任选地通过细胞系、混合细胞系、永生 化的细胞或永生化的细胞的克隆群体来生产，这是本领域熟知的。参见例 如，Ausubel等人，编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NY，NY(1987-2001)(《分子生物学现行规范》，约翰·威立父 子出版公司，纽约州，纽约市，1987-2001年)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^nd Edition，Cold Spring Harbor，N Y 1989(《分 子克隆：实验手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约，1989年)； Harlow和Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY (1989)(《抗体：实验手册》，冷泉港实验室出版社，纽约，1989年)； Colligan等人(编辑)，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons， Inc.，NY(1994-2001)(《免疫学现行规范》，约翰·威立父子出版公司，纽 约，1994-2001年)；Colligan等人，Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY，NY，(1997-2001)(《蛋白质科学现行规范》，约翰·威利 父子出版公司，纽约，1997-2001年)。

可将来自支架蛋白的氨基酸进行改变、添加和/或缺失，以减少免疫原 性或者降低、增强或修饰结合、亲和力、结合速率(on-rate)、解离速率(off- rate)、亲合力、特异性、半寿期、稳定性、可溶性或任何其他合适的特性， 这是本领域已知的。

可对生物活性的基于支架的蛋白质进行工程改造，但保留对抗原的高 亲和力和其他有利的生物学性质。为实现这个目标，可任选地通过使用亲本 序列和经工程改造的序列的三维模型分析亲本序列和多种概念性的工程改造 产物的过程来制备支架蛋白。三维模型是本领域技术人员可公共获得的和熟 悉的。有计算机程序可供图解和展示选定的候选序列的可能三维构象结构并 能测量可能的免疫原性(例如Xencor，Inc.(Monrovia，CA)的Immunofilter程 序)。对这些展示的检查允许分析残基在候选序列的功能发挥中的可能作 用，即分析会影响候选支架蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从亲本 序列和参比序列选择残基并进行组合，使得获得期望的特性，如对靶标抗原 的亲和力。作为另外一种选择，或者除上述程序之外，可使用其他合适的工 程改造方法。

筛选

使用核苷酸(DNA或RNA展示)或肽展示文库例如体外展示，可以 方便地实现就与相似蛋白质或片段的特异性结合筛选工程改造的基于支架的 蛋白质或包含具有变化多样的(variegated)残基或结构域的基于支架的蛋白质 的文库。这种方法涉及在一大批肽中筛选具有所需功能或结构的单个成员。 所展示的具有或不具有核苷酸序列的肽长度可为3-5000个或更多个核苷酸或 氨基酸，经常长5-100个氨基酸，且通常长约8-25个氨基酸。除了用于生成 肽文库的直接化学合成方法之外，有几种重组DNA方法也得到了描述。一种 类型涉及在噬菌体或细胞表面上展示肽序列。每个噬菌体或细胞包含编码特 定展示的肽序列的核苷酸序列。

本发明的蛋白质支架能以宽范围的亲和力(K_D)结合人蛋白质或其他哺乳 动物蛋白质。在一个优选的实施例中，如由本领域技术人员实践的，如通过 表面等离子体共振或Kinexa方法测定的，本发明的至少一个蛋白质支架可 以任选以高亲和力结合靶标蛋白，例如其K_D等于或小于约10^-7M，例如但 不限于0.1-9.9(或其中的任何范围或数值)X 10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12、10^-13、10^-14、10^-15或其中的任何范围或数值。

蛋白质支架对于抗原的亲和力或亲合力可使用任何合适的方法通过实 验确定。(参见例如Berzofsky等人，“Antibody-Antigen Interactions，”In Fundamental Immunology，Paul，W.E.，Ed.，Raven Press：New York，NY(1984) (“抗体-抗原相互作用”，《基础免疫学》，Paul，W.E.，编辑，乌鸦出版 社：纽约市，纽约州，1984年)；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and Company：New York，NY(1992)(《免疫学》，W.H.弗里曼公司：纽约市， 纽约州，1992年)以及本文所述的方法)。如果在不同的条件(例如同渗 容摩、pH)下测量，则所测得的特定蛋白质支架-抗原相互作用的亲和力可 不同。因此，亲和力及其他的抗原结合参数(例如K_D、K_on、K_off)的测量 优选地用蛋白质支架和抗原的标准化溶液以及标准化缓冲液(如本文所述的 缓冲液)来进行。

可用本发明的蛋白质支架进行竞争性测定法，以确定何种蛋白质、抗 体和其他拮抗剂与本发明的蛋白质支架竞争与靶标蛋白的结合和/或共享表 位区域。这些测定法是本领域普通技术人员熟知的，用来评估各种拮抗剂或 配体之间对某种蛋白质上的有限数目的结合位点的竞争。将蛋白质和/或抗 体在竞争之前或之后进行固定化、分离或捕获，并将结合到靶标蛋白的样品 与未结合的样品分离，例如通过倾析(在蛋白质/抗体进行预先不溶解化的 情况下)或通过离心(在蛋白质/抗体在竞争性反应后沉淀出来的情况下) 进行分离。另外，可通过蛋白质支架与靶标蛋白的结合或无结合是否会使功 能发生改变，例如蛋白质支架分子是否会抑制或增强例如标记物的酶活性， 来确定竞争性结合。可使用ELISA和其他的功能测定法，这是本领域公知 的。

核酸分子

本发明的编码蛋白质支架的核酸分子可为RNA的形式，如mRNA、 hnRNA、tRNA或任何其他形式，或者为DNA的形式，包括但不限于通过 克隆获得的或合成产生的cDNA和基因组DNA、或其任何组合。DNA可以 为三链的、双链的或单链的或其任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任 何部分可以是编码链，也称为有义链，或其可以是非编码链，也称作反义 链。

本发明的分离核酸分子可包括包含开放读码框(ORF)、任选地具有一个 或多个内含子的核酸分子，例如但不限于至少一个蛋白质支架的至少一个指 定部分；包含与靶标蛋白结合的蛋白质支架或环区域的编码序列的核酸分 子；以及包含基本上不同于上述那些的核苷酸序列、但由于遗传密码的简并 性仍编码该蛋白质支架的核酸分子，如本文所述和/或如本领域已知的。当 然，遗传密码是本领域所熟知的。因此，生成这种编码本发明的特异性蛋白 质支架的简并核酸变体对于本领域技术人员将是常规之举。参见，例如 Ausubel等人，同上，并且此类核酸变体包括在本发明中。

如本文所指出的，包含编码蛋白质支架的核酸的本发明的核酸分子可 包括但不限于单独编码蛋白质支架片段的氨基酸序列的那些核酸；整个蛋白 质支架或其部分的编码序列；蛋白质支架、片段或部分的编码序列以及另外 的序列，例如具有或不具有上述另外的编码序列的至少一种信号前导肽或融 合肽的编码序列，例如至少一个内含子，连同另外的非编码序列，包括但不 限于非编码5′和3′序列，如在转录、mRNA加工(包括剪接和聚腺苷化信号 (例如mRNA的核糖体结合和稳定性))中发挥作用的转录的非翻译序 列；编码另外的氨基酸，例如提供另外的功能的那些氨基酸的另外编码序 列。因此，可将编码蛋白质支架的序列融合至标记序列，如编码有助于包含 蛋白质支架片段或部分的融合蛋白质支架的纯化的肽的序列。

核酸分子

本发明还提供编码本发明的组合物的核酸，其作为分离的多核苷酸或 作为表达载体的部分，所述表达载体包括与所述组合物或它们的定向诱变剂 的原核生物、真核生物或丝状噬菌体表达、分泌和/或展示相容的载体。

本发明的分离的核酸可用以下方法技术制备：(a)重组方法、(b)合成技 术、(c)纯化技术和/或(d)它们的组合，这是本领域公知的。

在本发明的实践中有用的多核苷酸将编码本文描述的蛋白质支架的功能 部分。本发明的多核苷酸涵盖可用来与编码本发明的蛋白质支架的多核苷酸 进行选择性杂交的核酸序列。本发明提供在选择性杂交条件下与本文所公开 的多核苷酸杂交的分离的核酸。因此，该实施例的多核苷酸可用于分离、检 测和/或定量包含此类多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可用于在保 藏的文库中鉴定、分离或扩增部分或全长克隆。在一些实施例中，多核苷酸 是分离的基因组或cDNA序列，或者与来自人或哺乳动物核酸文库的cDNA 互补。

所述核酸可方便地包含除了本发明的多核苷酸之外的序列。例如，可以 将包含一个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点插入核酸中以帮助该多 核苷酸的分离。此外，可以插入可翻译序列以帮助分离翻译出的本发明多核 苷酸。例如，六组氨酸标记序列为纯化本发明的蛋白质提供了便利手段。本 发明的核酸除编码序列以外，任选是用于本发明的多核苷酸的克隆和/或表达 的载体、衔接子或接头。

可将额外序列加入这些克隆和/或表达序列来优化它们在克隆和/或表达 中的功能，以帮助分离所述多核苷酸，或改进该多核苷酸向细胞中的导入。 克隆载体、表达载体、衔接子和接头的使用是本领域熟知的。

如本文所指出的，包含编码蛋白质支架的核酸的本发明的核酸分子可 包括但不限于单独编码蛋白质支架片段的氨基酸序列的那些核酸；整个蛋白 质支架或其部分的编码序列；蛋白质支架、片段或部分的编码序列以及另外 的序列，例如具有或不具有上述另外的编码序列的至少一种信号前导肽或融 合肽的编码序列，例如至少一个内含子，连同另外的非编码序列，包括但不 限于非编码5′和3′序列，如在转录、mRNA加工(包括剪接和聚腺苷化信号 (例如mRNA的核糖体结合和稳定性))中发挥作用的转录的非翻译序 列；编码另外的氨基酸，例如提供另外的功能的那些氨基酸的另外编码序 列。因此，可将编码蛋白质支架的序列融合至标记序列，如编码有助于包含 蛋白质支架片段或部分的融合蛋白质支架的纯化的肽的序列。

对于包括噬菌体感染的细菌的细菌表达，优选的分泌信号是pelB或 ompA分泌信号，但其他的分泌信号多肽结构域也可以如美国专利No. 5,658,727中所述地使用。在噬菌体展示中，下游可翻译的DNA序列编码丝 状噬菌体外被蛋白，例如pIII或pIX蛋白质。优选的噬菌体蛋白质可得自丝 状噬菌体M13、f1、fd和类似等价的丝状噬菌体。因此，下游可翻译的 DNA序列编码氨基酸残基序列，其对应于且优选等同于丝状噬菌体基因III 或基因IX外被多肽。这种外被蛋白的序列是已知的且在公共数据库例如 NCBI中可取得的。

cDNA或基因组文库可用基于本发明多核苷酸的序列(例如本文所公开 的那些)的探针进行筛选。探针可以用于与基因组DNA或cDNA序列杂交 以分离相同或不同生物中的同源基因。本领域的技术人员将会知道各种严格 度的杂交可用于测定；并且杂交或洗涤介质可以是严格的。随着用于杂交的 条件变得更严格，在发生双链体形成的探针和靶之间必须存在更大程度的互 补性。可通过温度、离子强度、pH和部分变性溶剂(如甲酰胺)的存在中的 一者或多者，来控制严格性程度。例如，通过(例如)在0％至50％的范围 内操纵甲酰胺的浓度使反应物溶液的极性变化，从而方便地改变杂交的严格 性。对于可检测结合所需的互补性程度(序列同一性)将根据杂交介质和/或 洗涤介质的严格性而变化。互补性程度将最佳为100％或70-100％或其中的任 何范围或数值。然而，应当理解探针和引物中较小的序列变异可以通过减少 杂交和/或洗涤介质的严格性进行补偿。

在本发明的一个方面，使用用于掺入随机化密码子的技术构建多核苷 酸，以便使所得到的多肽在一个或多个特定残基处变化多样，或在该序列内 的特定位置处添加残基。多种策略可用于制备改变的多肽序列的文库，包括 随机、半合理和合理方法。合理和半合理方法具有超过随机策略的优点，因 为对引入编码序列内的变化的后果具有更多控制。另外，通过集中于该基因 的某些区域中的变异，可以在所选位置中研究所有可能的氨基酸变体整体。

建立于共同的NNK或NNS多样化方案的文库在每一个位置和所有20 种氨基酸中引入可能的32种不同的密码子。这种文库在理论上对于每n个数 目的残基增长32n。然而，实际上，噬菌体展示限于具有10⁹至10¹⁰种变体的 取样文库，暗示如果待在文库中实现完全序列覆盖，则仅6-7个残基可以被 靶向以用于变化多样。因此，可以应用通过鉴定待变化多样的关键位置且选 择相应的多样化方案来生成支架变体的文库的半合理或“集中”方法。“密 码子集合”指用于编码期望的变体氨基酸的一组不同核苷酸三联体序列。密 码子命名的标准形式是IUB编码的那种，这是本领域已知的和本文描述的。 “非随机密码子集合”指编码选择氨基酸的密码子集合。在某些位置处具有 所选核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是领域熟知的，例如TRIM方法 (Knappek等人；J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)(1999)，296：57-86； Garrard&Henner，Gene(《基因》)(1993)，128：103)。具有某些密码子集合 的这种核苷酸集合可以使用商购可得的核苷酸或核苷试剂和设备进行合成。

“密码子集合”是用于编码期望的变体氨基酸的一组不同核苷酸三联体 序列。密码子集合可以使用指定特定核苷酸或核苷酸的等摩尔混合物的符号 来表示，如下文根据IUB编码所示的。

TUB编码

G鸟嘌呤

A腺嘌呤

T胸腺嘧啶

C胞嘧啶

R(A或G)

Y(C或T)

M(A或C)

K(G或T)

S(C或G)

W(A或T)

H(A或C或T)

B(C或G或T)

V(A或C或G)

D(A或G或T)

N(A或C或G或T)

例如，在密码子集合DVK中，D可以是核苷酸A或G或T；V可以是 A或G或C；并且K可以是G或T。这个密码子集合可以代表18种不同密码 子，并且可以编码氨基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、 Asp、Glu、Gly和Cys。

集中的(例如非随机)文库可以使用NNK密码子和将变化多样集中于 所选残基而生成，或作为另外一种选择，具有非随机取代的变体可以使用例 如编码11个氨基酸(ACDEGKNRSYW)的DVK密码子和一个终止密码子而生 成。作为另外一种选择，Kunkel诱变可以用于使多肽的期望残基或区域变化 多样(Kunkel等人，Methods Enzymol.(《酶学方法》)154：367-382， 1987)。

标准克隆技术用于将所述文库克隆到载体内用于表达。该文库可以使用 已知系统进行表达，例如将该文库表达为融合蛋白。融合蛋白可以展示在任 何合适的噬菌体的表面上。用于在噬菌体的表面上展示包含抗体片段的融合 多肽的方法是熟知的(授予Griffith的US 6,969,108；授予McCafferty的US 6,172,197；授予Ladner的US 5,223,409；授予Griffiths的US 6,582,915；授予 Janda的US6472147)。用于从新多肽分离的文库可以展示在pIX上 (WO2009085462A1)。该文库还可以在体外翻译，例如使用核糖体展示 (Hanes和Pluckthun，Proc.Natl.Acad.Scie.USA(《美国国家科学院院 刊》)，94：4937，1997)、mRNA展示(Roberts和Szostak，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，94：12297，1997)、CIS-展示 (Odegrip等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)， 101：2806，2004)或其他无细胞系统(授予Kawasaki的US 5,643,768)。

具有多样化区域的文库可以使用包含编码Tencon序列(SEQ ID NO：16)的 多核苷酸或其预定突变体的载体生成。模板构建体可以具有用于多肽链的启 动子和信号序列。为了制备支架文库，使用诱变反应，所述诱变反应使用编 码该支架的环区域(A:B、B:C、C:D、D:E、E:F和F:G)的寡核苷酸。为了确保 所有所选位置都掺入随机化方案内，终止密码子(例如TAA)可以在期望预 期被多样化的每个区域中掺入。仅将出现其中终止密码子已被替换的克隆。

修饰的支架多肽

本发明的修饰的蛋白质支架和片段可包含一个或多个直接或间接地共 价键合到另一种蛋白质的部分。

在添加肽残基或制备内嵌式融合蛋白的情况下，这种残基的添加可以 通过来自多核苷酸序列的重组技术，如本文描述的。在附加的、附着的或缀 合的肽、蛋白质、有机化学品、无机化学品或原子或其任何组合的情况下， 键合到本发明的蛋白质支架或片段的另外部分一般经由与肽键不同的键。可 通过使蛋白质支架或片段与修饰剂反应，来生产本发明的修饰的蛋白质支 架。例如，可通过采用胺反应性修饰剂(例如PEG的MHS酯)以非位点特 异性方式将有机部分键合到蛋白质支架。包含与本发明的蛋白质支架的特定 位点键合的有机部分的修饰的蛋白质支架和片段可使用合适的方法制备，所 述方法例如逆向蛋白水解作用(Fisch等人，Bioconjugate Chem(《生物交 联化学》)，3：147-153(1992)；Werlen等人，Bioconjugate Chem.(《生物 交联化学》)，5：411-417(1994)；Kumaran等人，Protein Sci.(《蛋白质科 学》)6(10)：2233-2241(1997)；Itoh等人，Bioorg.Chem.(《生物有机化 学》)，24(1)：59-68(1996)；Capellas等人，Biotechnol.Bioeng.(《生物技 术和生物工程》)，56(4)：456-463(1997))，以及Hermanson，G.T.， Bioconjugate Techniques(《生物交联技术》)，Academic Press：San Diego， CA(美国学术出版社：圣地亚哥，加利福尼亚州)(1996)中所述的方法。

当聚合物或链附着至该支架蛋白时，该聚合物或链可以独立地是亲水 聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。如本文所用，术语“脂肪酸”包 括单羧酸和二羧酸。“亲水聚合基团”，该术语在本文中使用时是指在水中 比在辛烷中更易溶的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更易 溶。因此，本发明涵盖通过共价连接聚赖氨酸来进行修饰的蛋白质支架。适 用于修饰本发明的蛋白质支架的亲水聚合物可以是线型的或者带支链的，包 括例如聚烷二醇(例如PEG、单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水 化合物(例如葡聚糖、纤维素、寡糖、多糖等)、亲水氨基酸的聚合物(例 如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚环氧烷烃(例如聚环氧乙烷、 聚环氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本发明的蛋白质支架的亲 水聚合物作为单独的分子实体具有约800至约150,000道尔顿的分子量。例 如可使用PEG₅₀₀₀和PEG_20,000，其中下标是聚合物的平均分子量(道尔 顿)。亲水聚合基团可以由1至约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。 由脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水聚合物可以通过采用合适的方法制备。 例如，包含胺基的聚合物可以与脂肪酸或脂肪酸酯的羧基偶联，且脂肪酸或 脂肪酸酯上的活化羧基(例如用N，N-羰基二咪唑活化)可以与聚合物上的 羟基偶联。

适用于修饰本发明的蛋白质支架的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的， 或者可含有一个或多个不饱和单位。适用于修饰本发明的蛋白质支架的脂肪 酸包括例如正十二烷酸(C₁₂，月桂酸)、正十四烷酸(C₁₄，肉豆蔻酸)、 正十八烷酸(C₁₈，硬脂酸)、正二十烷酸(C₂₀，花生酸)、正二十二烷酸 (C₂₂，山嵛酸)、正三十烷酸(C₃₀)、正四十烷酸(C₄₀)、顺式-Δ9-十八 烷酸(C₁₈，油酸)、全顺式-Δ5，8，11，14-二十碳四烯酸酯(C₂₀，花生四烯 酸)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸 酯包括包含直链或支链的低级烷基的二羧酸单酯。低级烷基基团可包含一个 至约十二个碳原子，优选地一个至约六个碳原子。

可通过若干个熟知的体外测定法来比较含Fc的蛋白质的功能性。具体 地说，所关注的是Fcγ受体的FcγRI、FcγRII和FcγRIII家族的成员的亲和 力。可利用重组可溶形式的受体或细胞结合形式的受体进行这些测量。此 外，例如可使用重组可溶性FcRn，通过BIAcore来测量FcRn的亲和力， FcRn这种受体起到延长1gG的循环半衰期的作用。利用基于细胞的功能性 分析(例如ADCC测定法和CDC测定法)可深入了解特定变体结构的可能 的功能结果。在一个实施例中，ADCC测定法被配置成将NK细胞作为主要 的效应细胞，从而反映对FcγRIIIA受体的功能效应。吞噬作用测定法也可 用于比较不同变体的免疫效应子功能，而测量细胞应答(例如过氧化物或炎 性介质释放)的测定法也可用于进行比较。例如在使用抗CD3抗体的变体 的情况中，也可使用体内模型来测量小鼠中T细胞活化，该活性依赖于接 合特定配体(例如Fcγ受体)的Fc域。

宿主细胞选择或宿主细胞工程改造

如本文所述，选择用于表达基于支架的蛋白质的宿主细胞对最终组成 是重要贡献者，包括但不限于当存在时，例如在免疫球蛋白CH2结构域中 装饰蛋白质(如果期望的话)的低聚糖部分的组成中的变化。因此，本发明 的一个方面涉及选择适当的宿主细胞，用于使用和/或开发表达所需治疗性 蛋白质的生产细胞。

此外，宿主细胞可具有哺乳动物来源，或可选自COS-1、COS-7、 HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、骨髓 瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞、或其任何衍生的、永生化的或转化的 细胞。

作为另外一种选择，宿主细胞可选自不能使多肽糖基化的物种或生物 体，例如原核细胞或生物体，例如具有天然或已工程改造的大肠杆菌属物 种、克雷白氏杆菌属物种(Klebsiella spp.)、或假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)的原核细胞或生物体。

选择结合结构域

所述多肽或融合蛋白或其组分和结构域也可通过从这种结构域或组分 的文库(例如噬菌体文库)中选择来获得。可通过插入随机寡核苷酸的文库 或含所关注序列的多核苷酸的文库来制备噬菌体文库，如来自免疫接种的动 物或人的B细胞的抗体结构域(Smith，G.P.1985.Science(《科学》)228： 1315-1317)。抗体噬菌体库在一个噬菌体中含有重链(H)和轻链(L)可变区 对，从而可表达单链Fv片段或Fab片段(Hoogenboom，等人，2000， Immunol.Today 21(8)371-8(Hoogenboom等人，2000年，《今日免疫 学》，第21卷，第8期，第371-378页))。可以操纵噬菌粒文库的多样 性，以增加和/或改变文库的多肽的特异性，从而产生且随后鉴定另外的、 期望的分子性质和编码其的多核苷酸。

除了抗体可变区外可以包括的靶标结合组分的其他文库是核糖体展 示、CIS-展示、酵母展示、细菌展示和哺乳动物细胞展示。核糖体展示是一 种将mRNA翻译为它们的同源蛋白质的同时保持蛋白质附接到RNA的方 法。通过RT-PCR回收核酸编码序列(Mattheakis，L.C.等人1994.所用方法 的实例Natl.Acad.Sci.USA 91，9022(Mattheakis，L.C.等人，1994年，《美 国科学院院刊》，第91卷，第9022页))。CIS-展示是另选的体外展示方 法，其中将文库构建为具有RepA的融合蛋白。在体外翻译过程中，RepA 与制备其的DNA顺式结合，从而提供在基因型和表型之间的直接连接 (Odegrip等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)， 101：2806，2004)。酵母展示是基于膜相关α-凝集素酵母粘着受体agal和 aga2的融合蛋白的构建，是杂交型系统的一部分(Broder，等人，1997. Nature Biotechnology，15：553-7(Broder等人，1997年，《自然生物技术》， 第15卷，第553-557页))。细菌展示是基于靶标与输出的与细胞膜或细 胞壁缔合的细菌蛋白的融合(Chen and Georgiou 2002.Biotechnol Bioeng， 79：496-503(Chen和Georgiou，2002年，《生物技术与生物工程》，第79 卷，第496-503页))。类似地，哺乳动物展示系统基于在含随机化序列的 多肽和分泌的、膜锚定蛋白质之间的融合蛋白的制备。

基于支架的分子的用途

本文描述的基于支架的分子且通过上述方法中的任何生成的组合物可 以用于诊断、监控、调节、治疗、减轻、帮助预防人疾病或特定病理学在细 胞、组织、器官、流体或一般的宿主中的发生率，或者减少人疾病或特定病 理学在细胞、组织、器官、流体或一般的宿主中的症状。对于特定目的工程 改造的基于支架的分子可以用于治疗免疫介导的或免疫缺陷疾病、代谢病、 心血管病症或疾病；恶性疾病；神经学病症或疾病；感染，例如细菌、病毒 或寄生虫感染；或其他已知或特定的相关状况，包括肿胀、疼痛、和组织坏 死或纤维变性。

这种方法可包括将有效量的包含至少一种支架蛋白的组合物或药物组 合物施用给需要症状、作用或机制的这种调节、治疗、减轻、预防或减少的 细胞、组织、器官、动物或患者。有效量可包含经由单次(例如推注 (bolus))、多次或连续施用的约0.001-500mg/kg的量，或者经由单次、多次 或连续施用的实现0.01-5000ug/ml血清浓度的量，或者其中的任何有效范围 或数值，这如本文所述或相关领域所知地使用已知方法来进行且确定。

包含基于支架的蛋白质的组合物

可使用本领域熟知用于捕获、固定化、分隔或沉积的分离程序分离靶 标结合支架蛋白，且纯化至商业可应用性必需的程度，所述靶标结合支架蛋 白为修饰或未修饰的，单价、二价或多价，和单重、二重或多重靶向的。

对于治疗用途，基于支架的蛋白质可以配制为具有合适的施用方式， 包括但不限于胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊 内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、 肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺 内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、 病灶内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或透皮方式。至少一种蛋白 质支架组合物可以制备用于以下述形式使用：片剂或胶囊；粉末、滴鼻剂或 气溶胶；凝胶、软膏、洗剂、悬浮液，或者掺入如本领域已知的治疗绷带或 “贴剂”递送系统内。本发明提供基于支架的蛋白质的稳定制剂，其优选是 水性磷酸盐缓冲盐水或混合的盐溶液，以及防腐溶液和制剂，以及适合于药 学或兽医学用途的多用途的防腐制剂，包含在可药用制剂中的至少一种基于 支架的蛋白质。合适的媒介物及其配制，包括其他人蛋白质例如人血清白蛋 白在内，在例如下述参考文献中描述：Remington：The Science and Practice of Pharmacy(《制药学科学与实践》)，第21版，Troy，D.B.编辑，Lipincott Williams and Wilkins，Philadelphia，PA(利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公 司，费城，宾夕法尼亚州)2006年，部分5，Pharmaceutical Manufacturing (药品制造)第691-1092页，尤其是参见第958-989页。

组合物可以与其他活性物一起使用，或与其他活性物一起掺入单一制 剂内，所述其他活性物已知对于治疗所示病状、状况或疾病是有利的，或可 以通过制备基于支架的蛋白质与新组合物和活性物的组合进行测试。

虽然已用一般的术语描述了本发明，但是本发明的实施例还将在以下 的实例中公开，所述实例不应理解为对本权利要求所保护的范围的限制。

实例1.Fc糖基化变体的构建

Tencon设计

可将来自人生腱蛋白的第三个FN3结构域(SEQ ID NO：3)用作能够被工 程改造成经由表面暴露环结合至特定靶标分子的另选支架，所述表面暴露环 在结构上与抗体互补决定区(CDR)类似。此结构域在其天然形式下在PBS中 的解链温度为54℃。为了产生具有类似的结构和改善的物理性质(如改善 的热稳定性)的支架分子，基于来自人生腱蛋白的15个FN3结构域(SEQ ID NO：1-15)的比对设计了共有序列。

表1中的多重序列比对的分析示出，这15个结构域具有范围为13至 80％的与彼此的序列同一性，其中平均序列同一性在29％的配对内。通过根 据表1中所示的比对在每个位置处掺入最保守(频繁)的氨基酸来设计共有 序列(SEQ ID NO：16)。在逐对比对中，本发明的共有序列(SEQ ID NO：16) 命名为Tencon，其在34-59％的位置处等同于来自生腱蛋白的FN3结构 域，具有43％的平均序列同一性。

蛋白质的表达与纯化

将Tencon(SEQ ID NO：16)的氨基酸序列回译，从而得到在SEQ ID NO： 17中所示的DNA序列。通过重叠PCR将此序列装配，亚克隆到经修饰的 pET15载体内，转化到BL21Star(DE3)大肠杆菌(英潍捷基公司)内，并铺 板到含有75μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂板上。挑取单个菌落，并且在含有 2％葡萄糖和100μg/mL羧苄青霉素的50ml TB培养基中在37℃下过夜生 长。用此培养物接种2.5L Ultra Yield烧瓶(Thomson Instrument Company)中的 500mL自诱导培养基(Overnight Express Instant TB培养基，Novagen)。在 ATR Multitron振荡培养箱中，用双程序(37℃、300rpm下3小时，然后30 ℃、250rpm下16小时)进行生长和表达。

收获培养物，在JL8.1转子中7000rpm下离心15分钟以沉淀细胞。将 细胞重悬浮于30ml缓冲液中，所述缓冲液含有20mM磷酸钠pH7.5、 500mM NaCl、10％甘油、20mM咪唑、0.37mg/mL溶菌酶、1X完全蛋白酶 抑制剂(无EDTA；罗氏公司(Roche))和Benzonase(西格玛奥德里奇公司 (Sigma-Aldrich)，终浓度0.25μl/ml)，并且用Misonix XL2020超声波发生 器在冰上以脉冲模式(打开5秒，关闭30秒)裂解5分钟。在JA-17转子 中17,000rpm离心30分钟，以除去不溶性物质。

在2步骤色谱过程中，从可溶性裂解物纯化出Tencon蛋白。首先，通 过固定化金属亲和层析捕捉该蛋白质：将2mL Ni-NTA琼脂糖小珠(Qiagen) 加到裂解物，并将其放在摇摆平台上4℃下保持1小时。然后将该树脂填充 到Poly-Prep柱(Bio-Rad)中，用20mM磷酸钠(pH7.5)、500mM NaCl、10％甘 油和20mM咪唑洗涤，以除去未结合的物质。用20mM磷酸钠(pH7.5)、 500mM NaCl、10％甘油和500mM咪唑将蛋白质从树脂洗脱下来。各流份通 过SDS-PAGE进行分析，是同时通过考马斯染色和通过使用HRP缀合的抗 His抗体(Immunology Consultants Laboratory)的蛋白质印迹来进行。将所需的 流份集中并向PBS pH7.4中透析。作为第二纯化步骤，将该蛋白质荷载到在 PBS中平衡的Superdex-75HiLoad 16/60柱(GE Healthcare)上。各流份通过 SDS-PAGE进行分析，将含有Tencon的各流份集中并用Centriprep UltraCel YM-3浓缩器(Amicon)进行浓缩。

用BioTek读板机测定蛋白质浓度，以测量样品在280nm处的吸光度。 通过考马斯染色(图1)、通过用抗His抗体进行的蛋白质印迹和通过用在 PBS中平衡的G3000SW-XL柱(TOSOH Biosciences)进行的HPLC-SEC，对 最终制品进行分析。SDS-PAGE分析表明Tencon在6和14kDa之间，这与 该单聚蛋白的10.7kDa的预期质量相符。获得了每升培养物＞50mg纯 Tencon蛋白的收率。

生物物理学表征

分别通过圆二色性光谱法和差示扫描量热法对Tencon的结构和稳定性 进行了表征。CD测量在AVIV光谱仪上在20℃下PBS中及0.2mg/mL浓度 下进行。图8中的光谱示出最小值在218nm处，这暗示如设计的对属于 FN3家族的蛋白质所预期的β-折叠结构。DSC数据是通过将来自生腱蛋白 或Tencon的第3个FN3结构域在PBS中的0.5mg/mL溶液在N-DSCII热量 计(Applied Thermodynamics)中以1℃/分钟的速率从35℃加热到95℃来获 得。首先，将关于缓冲液空白对照的曲线扣除，以产生图3中所示的特征 图。使用CpCalc(Applied Thermodynamics)软件，由此数据计算出第3个 FN3结构域和Tencon的解链温度分别为54℃和78℃。两种结构域的折叠和 解折叠在这些温度下都是可逆的。

免疫原性分析

使用模拟氨基酸序列对人的免疫原性的计算机程序，比较代表人生腱 蛋白的第3个FN3结构域、Tencon和几种治疗性抗体的氨基酸序列的预测 免疫原性(表2中所示)。嵌合单克隆抗体和人单克隆抗体(阿达木单抗) 用该程序分析后，接着应用容限阈值(去除与人种系编码序列有100％同一 性的9-聚体肽)。对生腱蛋白或Tencon则不应用容限阈值。容限阈值假定 T细胞对种系编码的单克隆抗体序列的容限宽，并将分析聚焦于主要在 CDR和侧翼结构域中的新序列。

这些分析基于衍生自被分析的序列的9-mer肽会结合一个或多个HLA 分子的可能性，预测出生腱蛋白和Tencon两者的免疫原性风险都是低的。 根据每种HLA等位基因的流行程度，对得分进行加权。对于每个序列，将 模型的得分进行加和，以提供描述每个序列的总体PIR的单个数值(得分总 和)。这个分析所得的结果总结于表2中。表中示出生腱蛋白具有最低的总 得分(11.9)。Tencon和生腱蛋白一样，得分表明主要为非结合物和低预测免 疫原性风险限制位(agretope)(得分＝13.2)。与治疗性抗体相比，生腱蛋白 序列和Tencon序列得分都有利。

通过pIX融合在M13噬菌体上展示Tencon

通过PCR和限制酶切消化克隆，将编码Tencon氨基酸序列的基因亚克 隆到噬菌粒表达载体pPep9中，得到载体pTencon-pIX。这个系统将N末端 进行了Myc标记的Tencon表达成C末端融合体融合到M13pIX蛋白的N 末端(图4)。Lac启动子使得在没有IPTG的情况下表达水平较低，而在 添加IPTG后表达增加。将OmpA信号序列附接到Tencon的N末端以有助 于有效地向周质迁移。在Tencon和pIX之间构建了短的TSGGGGS接头 (SEQ ID NO：141)，以防止这些蛋白质之间的空间相互作用。

为证实在M13噬菌体颗粒的表面上的展示，将pTencon-pIX转化到 XL1-Blue大肠杆菌内，并且用单个菌落接种补充有氨苄青霉素的5ml LB培 养物。使此培养物在37℃下生长直至达到对数中期，这时加入6¹⁰pfu VCSM13辅助噬菌体，并且将培养物于37℃下不伴随振荡温育10分钟，然 后伴随振荡温育50分钟。然后将辅助噬菌体拯救的培养物稀释到补充有氨 苄青霉素和卡那霉素的50ml 2YT培养基内，并且于37℃下伴随振荡生长直 至O.D.₆₀₀达到0.7，这时加入IPTG至1mM的终浓度并将温度降低到30 ℃。在16小时后，将培养物以4000×g离心20分钟，然后收集上清液并贮 存于4℃下用于分析。

用噬菌体颗粒与抗Myc抗体(英潍捷基公司)的结合来证实Myc- Tencon构建物在M13噬菌体表面上的展示。用抗Myc或抗αv抗体(阴性 对照)以2.5ug/mL的浓度将Maxisorp板包被过夜，并且用SuperBlock T20 (派斯公司(Pierce))进行封闭。在PBS中制备上述噬菌体中期培养物上清 液的两倍系列稀释液，并加到包被板的各孔。在1小时后，将板用TBST洗 涤，并且向每个孔加入抗M13HRP抗体，然后在1小时温育后用TBST洗 涤。加入Roche BD ELISA POD底物，在读板机(Tecan)上检测发光。图5示 出，Myc-Tencon噬菌体颗粒以浓度依赖性方式结合板的抗myc抗体包被的 孔，但不结合板的抗αv抗体包被的孔或板的未包被的对照孔，这证实了 Myc-Tencon在M13噬菌体颗粒上的特异性展示。

可构建出另外的噬菌粒载体，以将Tencon和文库成员(见实例2)展 示在M13噬菌体上作为与外被蛋白pIII的融合蛋白。对于这个系统，将 pIX的基因替换为编码截短版本的pIII的基因(Bass等人，1990)。与图4 中所示的系统相比较，另外的变化包括用DsbA的信号序列替换OmpA信号 序列，因为使用这个序列的分泌已证实对于稳定的另选支架分子的展示是有 利的(Steiner等人，2006)。

实例2：Tencon文库的生成

Tencon变体文库可通过多种不同的方法制作，这取决于所需的复杂性 和分子中突变的相对位置。优选用DNA合成方法来产生遍布于Tencon基因 的突变。也可用限制酶克隆来将含有该基因不同区域中的突变的各DNA片 段重组在一起。可通过使用简并寡核苷酸和寡核苷酸指导的诱变，在小的限 定区域(如单个Tencon环)中引入饱和诱变(Kunkel等人，1987)。

构建了Tencon文库即文库FG7，其被设计成使用寡核苷酸指导的诱变 以7个随机氨基酸替换FG环。合成了寡核苷酸(TconFG7-For-5’pho)，其在 编码FG环的位置处具有NNS的21碱基对(bp)简并序列，并具有两个与 Tencon编码序列有互补性的侧翼20-27bp核苷酸序列。在这个设计中，所有 二十种氨基酸都能够在FG环中得到体现。在核苷酸水平上计算出的多样性 为1.3×10⁹。

TconFG7-For5’pho：(SEQ ID NO：18)

GAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNSNNSNNSNNSNNSNNSN NSCCGCTGTCTGCGGAATTCAC

通过用含有AscI限制位点的茎环序列替换Tencon F:G环编码序列，构 建出寡核苷酸指导的诱变的模板pDsbA-Tencon-Asc-loop-Myc-pIII。这个系 统使得可以在诱变后转化前用AscI消化所得的DNA来除去背景模板 DNA。为纯化出单链DNA模板供进行诱变，将携带有pDsbA-Tencon-Asc- loop-Myc-pIII的大肠杆菌CJ236的单菌落挑取到含有羧苄青霉素(50ug/ml 终浓度)和氯霉素(10ug/ml)的5ml 2YT生长培养基中。在6小时后，加入 VCSM13辅助噬菌体至10¹⁰pfu/ml的终浓度，并不伴随振荡温育10分钟， 然后转移到含有羧苄青霉素(10ug/ml)和尿苷(0.25ug/ml)的150ml 2YT，并伴 随以200rpm的振荡在37℃下温育过夜。通过离心沉淀细胞，收集上清液， 并用PEG NaCl沉淀噬菌体。用QIAprep Spin M13试剂盒(Qiagen)按照生产 商说明书从这个沉淀纯化出单链DNA。

为使简并寡核苷酸对模板退火，将5ug的模板DNA与寡核苷酸 TconFG7-For-5-pho以10∶1的摩尔比在Tris-HCl(50mM，pH7.5)和MgCl2 (10mM)中进行组合，并在90℃下温育2分钟，60℃下温育3分钟和20℃下 温育5分钟。在退火反应后，向反应混合物加入ATP(10mM)、dNTP(各 25mM)、DTT(100mM)、T4连接酶(7单位)和T7DNA聚合酶(10单 位)，并在14℃下温育6小时，然后在20℃下温育12小时。所得到的 DNA使用PCR纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen))进行纯化，并在100uL的 水中回收。将文库DNA用10单位的AscI消化4小时，然后用Qiagen PCR 纯化试剂盒再次进行纯化。将最终的文库DNA回收在50uL水中。然后将 所得的双链DNA产物通过电穿孔转化到大肠杆菌MC1061F’中。

将转化体收集到20mL SOC培养基中，并且允许在37℃下恢复1小 时。恢复结束时，将转化液的等分试样进行系列稀释并接种在含有1％葡萄 糖的羧苄青霉素(100ug/ml)板上，以评估总转化子数目。然后用剩余的SOC 培养物接种含有羧苄青霉素和1％葡萄糖的1L 2xYT培养基，并生长至 OD₆₀₀达到0.6。将100mL的此培养物用M13辅助噬菌体接种至10¹⁰/mL， 并在37℃下进行温育，然后离心。将所得到的细胞团块重悬浮于含有羧苄 青霉素(100ug/mL)和卡那霉素(35ug/mL)的500mL新鲜的2xYT培养基中，并 在30℃下生长过夜，然后离心。通过加入PEG/NaCl沉淀出噬菌体颗粒，并 贮存于-80℃下。

设计了第二个文库BC6/FG7，以同时在Tencon的B:C环和F:G环内引 入多样性。为此，合成了两个寡核苷酸Tc-BC6-For-5’phos和POP149。正向 寡核苷酸被磷酸化并在编码B:C环的每个位置处含有18个碱基的NNS密码 子，而反向寡核苷酸在5’末端被生物素酰化并在编码F:G环的每个位置处 含有21个碱基的NNS密码子。两个寡核苷酸的侧翼都有两个与要进行诱变 的区域之前和之后的区域相同的18bp核苷酸序列(引物的细节见下)。

Tc-BC6-For-5’phos：(SEQ ID NO：19)

gactctctgcgtctgtcttggNNSNNSNNSNNSNNSNNSTTCGACTCTTTCCTGA TCCAGTACC

POP 2149：(SEQ ID NO：20)

GTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNAACA CCGTAGATAGAAACGGTG

为构建该文库，用t寡核苷酸Tc-CB6-For5’phos和POP2149进行16次 100uL PCR反应以扩增Tencon DNA模板，从而在该过程中将NNS密码子 同时引入B:C环和F:G环中。将双链PCR产物与磁性链霉亲和素珠粒 (Dynal)在B&W缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，2M NaCl，0.1％ Tween-20)中混合并温育20分钟，用磁铁吸下来，用B&W缓冲液洗涤两 次。用300uL 150mM NaOH将正向链从珠粒上洗脱下来。用这个“特大引 物(megaprimer)”(即理论多样性超过8×1016的长引物的混合物)与单链 文库模板退火。文库构建是如上文对FG7文库所述来进行。

实例3：IgG结合物的选择

为进行能结合IgG的Tencon文库成员的选择，用磺基-NHS-LC-生物素 (Pierce)将重组IgG(人IgG1亚型)进行生物素酰化，然后透析到PBS中。 为了选择，将200uL噬菌体展示文库FG7或BC6/FG7用200uL化学封闭剂 进行封闭，然后加入浓度为500nM(第1轮)或100nM(第2轮和第3 轮)的生物素酰化的IgG。在第1轮中用中和亲和素磁珠粒(Seradyne)回收 结合的噬菌体，或者在第2轮和第3轮中用链霉亲和素磁珠粒(Promega)回 收结合的噬菌体。用1ml的含tween的Tris缓冲盐水(TBST)洗涤5-10次， 然后用1ml的Tris缓冲盐水(TBS)洗涤2次，将未结合的噬菌体从珠粒洗涤 下来。通过加入对数中期的大肠杆菌MC1061F’将结合的噬菌体从珠粒上洗 脱下来。将受感染细胞铺板到补充有羧苄青霉素和葡萄糖的LB琼脂板上。 第二天，从板刮取细胞并使其生长至对数中期，然后用VCSM13辅助噬菌 体拯救并生长过夜。通过PEG/NaCl沉淀分离出噬菌体颗粒，用于下一轮的 选择。

经过3轮的针对IgG进行的淘选后，将输出结果(output)亚克隆到 pET27载体中，该载体通过PCR扩增Tencon基因而被修饰成包括连接酶非 依赖性克隆位点。将此PCR产物与该载体退火并转化到BL21-GOLD(DE3) 细胞(Stratagene)中。将单个菌落挑取到96深孔板(康宁公司(Corning))的 1mL培养物内，并且在37℃下过夜生长至饱和。第二天，用50微升的过夜 培养物接种新鲜的1mL培养物。使培养物在37℃下生长2小时，然后加入 IPTG至1mM并将温度降低到30℃。在诱导后16小时通过离心收获细胞， 然后用100微升的BugBuster(Novagen)进行裂解。所得的裂解物通过离心进 行澄清，并用于通过ELISA测试是否与IgG结合。

将Maxisorp板(Nunc)用0.1μg抗HIS抗体(Qiagen)包被过夜，用TB ST 洗涤，然后用Starting Block T20(Thermo Scientific)进行封闭。将在Starting Block中1∶4稀释的澄清裂解物加到各板，让其结合1小时，然后用TBST 洗涤。将生物素酰化的IgG或生物素酰化的HAS以1ug/ml的浓度加入，并 且在1小时温育后用TBST洗涤。通过加入链霉亲和素-HRP(Jackson Immunoresearch)并用POD化学发光底物进行检测，实现对结合的IgG或 HAS的检测。ELISA的结果在图7中示出。对如通过ELISA信号判断出结 合生物素酰化的IgG超过结合生物素酰化的HSA大于10倍的构建物进行测 序。在几次选择实验完成后，获得来自文库FG7的60个独特的结合序列和 来自文库BC6FG7的10个独特序列；表4示出IgG结合物的代表性序列， 其中B:C和/或F:G环显示至它们不同于SEQ ID NO：16的那些的程度。表4 中还示出了支架的其他区域中的许多突变。

相对于已被用作另选支架分子的来自人生腱蛋白的第3个FN3结构 域，此处所设计、表达且纯化的Tencon蛋白具有改善26℃的热稳定性。基 于这个稳定性增加，这个支架分子很可能更适于进行氨基酸取代并更容易制 造。在更稳定的支架的情形中，很可能可以更好地容忍会降低蛋白质稳定性 的突变，从而稳定性增强的支架很可能从支架变体的文库得到更多的有功 能、折叠良好的结合物。

表1

表2.

表3.环

环 SEQ ID NO：16的残基 氨基酸序列 A-B 13-16 TEDS B-C 22-28 TAPDAAF C-D 38-43 SEKVGE D-E 51-54 GSER E-F 60-64 GLKPG F-G 75-81 KGGHRSN

表4.结合IgG的支架

序列：

序列标识号1：

sppkdlvvtevteetvnlawdnemrvteylvvytpthegglemqfrvpgdqtstiiqelepgveyfirvfail enkksipvsarvat

序列标识号2：

tylpapeglkfksiketsvevewdpldiafetweiifrnmnkedegeitkslrrpetsyrqtglapgqeyeisl hivknntrgpglkrvtttrld

序列标识号3：

dapsqievkdvtdttalitwfkplaeidgieltygikdvpgdrttidltedenqysignlkpdteyevslisrrg dmssnpaketftt

SEQ ID No.4

tgldaprnlrrvsqtdnsitlewrngkaaidsyrikyapisggdhaevdvpksqqattkttltglrpgteygig vsavkedkesnpatinaateldtpkd

SEQ ID No.5

dtpkdlqvsetaetsltllwktplakfdryrlnyslptgqwvgvqlprnttsyvlrglepgqeynvlltaekgrh kskpakskparvk

SEQ ID No.6

qapelenltvtevgwdglrlnwtaadqayehfiiqvqeankveaarnltvpgslravdipglkaatpytvsi ygviqgyrtpvlsaeastge

SEQ ID No.7

etpnlgevvvaevgwdalklnwtapegayeyffiqvqeadtveaaqnltvpgglrstdlpglkaathytitir gvtqdfsttplsvevlte

SEQ ID No.8

evpdmgnltvtevswdalrlnwttpdgtydqftiqvqeadqveeahnltvpgslrsmeipglragtpytvtl hgevrghstrplavevvte

SEQ ID No.9

dlpqlgdlavsevgwdglrlnwtaadnayehfviqvqevnkveaaqnltlpgslravdipgleaatpyrvsi ygvirgyrtpvlsaeastakepe

SEQ ID No.10

kepeignlnvsditpesfnlswmatdgifetftieiidsnrlletveynisgaertahisglppstdfivylsglap sirtktisatatte

SEQ ID No.11

alpllenltisdinpygftvswmasenafdsflvtvvdsgklldpqeftlsgtqrklelrglitgigyevmvsgft qghqtkplraeivte

SEQ ID No.12

aepevdnllvsdatpdgfrlswtadegvfdnfvlkirdtkkqsepleitllapertrdltglreateyeielygis kgrrsqtvsaiattam

SEQ ID No.13

gspkevifsditensatvswraptaqvesfrityvpitggtpsmvtvdgtktqtrlvklipgveylvsiiamkg feesepvsgsfttal

SEQ ID No.14

dgpsglvtanitdsealarwqpaiatvdsyvisytgekvpeitrtvsgntveyaltdlepateytlrifaekgpq ksstitakfttdl

SEQ ID No.15

dsprdltatevqsetalltwrpprasvtgyllvyesvdgtvkevivgpdttsysladlspsthytakiqalngpl rsnmiqtifttigl

SEQ ID No.16

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLT VPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT

SEQ ID No.17

ctgccggcgccgaaaaacctggttgtttctgaagttaccgaagactctctgcgtctgtcttggaccgcgccgga cgcggcgttcgactctttcctgatccagtaccaggaatctgaaaaagttggtgaagcgatcaacctgaccgttccgggt tctgaacgttcttacgacctgaccggtctgaaaccgggtaccgaatacaccgtttctatctacggtgttaaaggtggtca ccgttctaacccgctgtctgcggaattcaccacc

显示环的Tencon序列(SEQ ID NO：16)

A-B    B-C    C-D

1-LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEA-44

D-E    E-F    F-G

45-INLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT-89

实例4：Tencon的稳定化突变

突变体设计为改善本文上文描述的Tencon支架(SEQ ID NO：16)的折叠 稳定性。制备几个点突变，以产生SEQ ID NO：16的单个残基的取代，例如 N46V(Tencon17-SEQ ID NO：142)、E14P(Tencon18-SEQ ID NO：143)、 E11N(Tencon19-SEQ ID NO：144)、E37P(Tencon20-SEQ ID NO：145)、和 G73Y(Tencon21-SEQ ID NO：146)，所述点突变由程序PoPMuSiC v2.0预测 为改善稳定性(Dehouck，Grosfils等人2009)。先前已发现突变体E86I (Tencon22-SEQ ID NO：147)使同源蛋白质即来自人生腱蛋白的第3个FN3 结构域(WO2009/086116A2)稳定化。最后，在丙氨酸扫描实验过程中发现 L17A突变使Tencon显著稳定化，在所述实验中将Tencon的所有环残基独 立替换为丙氨酸(数据未示出)。在起始轮的稳定性测定(参见下文)后， 产生组合突变体N46V/E86I(Tencon 23-SEQ ID NO：148)、E14P/N46V/E86I (Tencon24-SEQ ID NO：149)、和L17A/N46V/E86I(Tencon25-SEQ ID NO：150)，以进一步增加稳定性。

表达和纯化

使用QuikChange诱变试剂盒(Stratagene)制备在Tencon编码序列中的突 变。将所得到的质粒转化到BL21-GOLD(DE3)大肠杆菌(Stratagene)内用于 表达。挑取单个菌落，并且在含有100μg/ml氨苄青霉素的2mL TB培养基 中在37℃下过夜生长。用此培养物接种在500mL带挡板烧瓶中的100mL自 身诱导的培养基(Overnight Express Instant TB培养基，Novagen)，然后在 37℃下生长16小时。

通过在4000×g下离心20分钟收获培养物，然后将形成团块的细胞按 照每克湿细胞团块重悬浮于5mL BugBuster HT(Novagen)中。在室温下温育 30分钟后，通过在30,000×g下离心20分钟将裂解物澄清，然后通过重力装 载到3mL Ni-NTA超流柱(superflow column)(Novagen)上。在装载后，用 15mL缓冲液洗涤每个柱，所述缓冲液含有50mM磷酸钠pH7.4、500mM NaCl和10mM咪唑。随后使用10mL缓冲液从柱上洗脱结合的蛋白质，所 述缓冲液含有50mM磷酸钠pH7.4、500mM NaCl和250mM咪唑。通过 SDS-PAGE评估蛋白质纯度。在生物物理分析前，将每种突变体充分透析到 PBS pH7.4内。从100mL培养物中对于每种突变体获得28-33mg纯化的蛋白 质。

热稳定性的表征

亲本Tencon和每种突变体的热稳定性通过毛细管差示扫描量热法(DSC) 进行测量。将每种样品针对PBS pH7.4充分透析，并且稀释至2-3mg/mL的 浓度。使用配备自动取样机的VP-DSC仪器(微凯尔公司(MicroCal， LLC))，测量这些样品的解链温度。将样品以每分钟1℃的速率从10℃加 热到95℃或100℃。在每次样品扫描之间完成仅缓冲液的扫描，以便计算用 于整合的基线。在扣除仅缓冲液的信号后，将数据拟合至二态解折叠模型。 通过对于每种样品重复扫描而不是将它从细胞中去除，测定热变性的可逆 性。通过比较来自第1次扫描与第2次扫描的曲线下面积来计算可逆性。 DSC实验的结果作为衍生自完成的解链曲线的数值呈现于表5中。与亲本 tencon序列相比较，单一突变体Tencon17、Tencon18、Tencon19和 Tencon22改善热稳定性。仅Tencon21是显著失稳的。组合突变体样品 Tencon23、Tencon24和Tencon25都具有稳定性的显著更大的增强，指示所 设计的突变就改善热稳定性而言是累加的。

通过盐酸胍的变性

如通过色氨酸荧光测量的，Tencon和每种突变体在用增加浓度的盐酸 胍(GdmCl)处理后保持折叠的能力用于评估稳定性。Tencon仅含有一个色氨 酸残基。色氨酸残基埋入疏水核心内，并且因此在360nm处的荧光发射是 这种蛋白质的折叠状态的灵敏量度。将200uL溶液吸取到黑色、非结合96 孔板(Greiner)内，以便产生17点滴定，所述溶液含有50mM磷酸钠pH7.0、 150mM NaCl和从0.48到6.63M的不同浓度的GdmCl。将含有tencon突变 体的10uL溶液加入整个板的每个孔中，以制备23uM的最终蛋白质浓度， 并且通过轻轻地来回吸液进行混合。在室温下温育24小时后，使用 Spectramax M5读板机(美国分子仪器公司(Molecular Devices))以在280nm 处激发和在360nm处发射来阅读荧光。由这种曲线生成的数据示于图8 中。使用下式将荧光信号转换为解折叠的流份(Pace 1986Methods Enzymol (《酶学方法》)131：266-80)：

f_u＝(y_F-y)/(y_F y_U)

其中y_F是折叠的样品的荧光信号，y_u是解折叠的样品的荧光信号。

通过与下式拟合来测定解折叠转变的中点和转变的斜率(Clarke，Hamill 等人1997)： $F=\frac{({\alpha }_N+{\beta }_N[D\left]\right)+({\alpha }_D+{\beta }_D[D\left]\right)\exp (m\left(\right[D]-{\left[D\right]}_{50\%})/\mathrm{RT})}{1|\exp \left(m\right(\left(\begin{array}{cc}\left[D\right]& [D{]}_{50\%}\end{array}\right))/\mathrm{RT})}$

其中F是在给定变性剂浓度时的荧光，α_N和α_D是天然和变性状态的y-截 距，β_N和β_D是天然和变性状态的基线的斜率，[D]是GdmCl的浓度，[D]_50％是GdmCl浓度，此时50％的样品是变性的，m是转变的斜率，R是气体常 数，T是温度。使用下式估计每种样品的折叠自由能(Pace 1986同上； Clarke，Hamill等人1997 J Mol Biol(《分子生物学杂志》)270(5)：771- 8)：ΔG＝m[D]_50％

对于这种曲线通常难以准确地测量转变的斜率m。另外，此处所述的 突变不预期改变tencon的折叠机制。因此，测量每种突变体的m值，然后 将该数值求平均值(Pace 1986同上)，以产生用于所有自由能计算的m＝ 3544卡/摩尔/M。这些计算的结果呈现于表5中。GdmCl解折叠实验的结果 证实，就热稳定性而言使Tencon稳定化的相同突变体还针对GdmCl诱导的 变性而使该蛋白质稳定化。

尺寸排阻色谱法

尺寸排阻色谱法(SEC)用于评估WT tencon和每种突变体的聚集状态。 将5uL每种样品以0.3mL/分钟的流量注射到Superdex 755/150柱(通用电 气医疗集团(GE Healthcare))上，使用PBS流动相。通过在280nm处的吸光 度监控来自柱的洗脱。为了评估聚集状态，先用球形分子量标准(西格玛公 司(Sigma))校准该柱。除了Tencon21外，测试的所有样品以与单体样品一 致的洗脱体积在一个峰中洗脱。Tencon21以2个峰洗脱，从而指示聚集物 的存在。

表5：

显而易见的是，本发明可以与前面的说明和实例中具体描述的方式不 同的方式来实施。根据上面的教导，可以作出本发明的多种修改形式和变型 形式，并且这些修改形式和变型形式落入所附权利要求的范围内。