抗小麦黄花叶病毒的簇毛麦4VS染色体的特异分子标记

摘要

本发明公开了抗小麦黄花叶病毒的簇毛麦4VS染色体的特异分子标记，属于生物技术领域。首先公开了能追踪簇毛麦4VS染色体的两个分子标记CINAU66和CINAU295。在含有簇毛麦4VS染色体的材料中，标记引物CINAU66F/CINAU66R能扩增出约950bp的产物，标记引物CINAU295F/CINAU295R能扩增出约380bp的产物，这些引物能特异追踪簇毛麦4VS染色体。本发明公开的抗小麦黄花叶病毒的簇毛麦4VS染色体，可为小麦抗黄花叶病毒育种提供新的基因资源；能特异追踪簇毛麦4VS染色体的特异分子标记，可用于分子标记辅助选择育种。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗小麦黄花叶病毒的簇毛麦4VS染色体的特异分子标记。

背景技术

小麦黄花叶病（wheat yellow mosaic，WYMV）是由小麦黄花叶病毒（wheat yellow mosaic  bymovirus）引起的一种土传病毒病害，其传播介体禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）的休眠孢 子囊在土壤干燥条件下可存活数年以上，通过农事操作、病土、病根残体等传播，或通过带介 体土壤混杂在种子里进行远距离传播。发生小麦黄花叶病的田块，一般可减产20-30%，严重 时可达70%，甚至绝收（刘伟华等，2004；Liu等，2005a，2005b）。我国每年小麦黄花叶病 发生面积多达1000万亩以上，且呈现逐年扩展趋势，发生流行的威胁正在逐步增加，对小麦 生产造成了重大损失（陈剑平，2005；孙炳剑等，2011）。

选育和推广抗病品种是控制小麦黄花叶病最经济、有效的途径。我国已育成了仪宁小麦、 宁丰小麦、宁麦9号、宁麦13、扬辐麦9311及扬辐麦4号等高抗新品种，有效控制了该病害 的蔓延（何震天等，2009）。但目前育种工作中主要利用小麦2D和5A染色体长臂上的主效抗 黄花叶病位点（Nishio等，2010；Zhu等，2012），小麦抗黄花叶病的遗传基础较为狭窄。因 此，发掘和利用新的抗黄花叶病遗传资源，定位和克隆抗病新基因是小麦抗黄花叶病遗传改良 工作中的一个迫切需求。

栽培品种遗传基础日趋狭窄已成为小麦育种取得突破性进展的主要瓶颈(李振声，2010)。 小麦近缘种属蕴藏丰富的抗生物和非生物胁迫以及高产、优质因子等基因资源，通过远缘杂交 将近缘物种中的优良基因导入普通小麦，是拓宽小麦遗传基础、推进小麦育种取得突破性进展 的有效途径（吉万全等，2001；张增艳等，2004；王述民等，2011）。

簇毛麦（Haynaldia villosa,基因组VV）原产于地中海沿岸，是栽培小麦的二倍体近缘物 种，兼抗白粉病、条锈病、全蚀病、眼斑病和黄花叶病等多种病害（Gradzielewska，2006）。 南京农业大学细胞遗传研究所自上世纪70年代起开始开展将簇毛麦优异基因导入普通小麦的 研究，利用远缘杂交和染色体工程手段育成了小麦-簇毛麦1V-7V整套异附加系、涉及4V和 6V染色体的异代换系和抗白粉病的T6VS·6AL易位系。为了进一步研究簇毛麦所携的优异基 因，首先对簇毛麦、小麦-簇毛麦双二倍体、小麦-簇毛麦4V二体异附加系、4V（4D）异代换 系、T4VS·4DL纯合补偿性易位系进行了多年多点的小麦黄花叶病抗性鉴定，并开展了簇毛麦 4VS染色体特异分子标记的开发和筛选等研究。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供抗小麦黄花叶病毒的簇毛麦4VS染色 体的特异分子标记。

本发明的另一目的在于提供所述抗小麦黄花叶病毒的簇毛麦4VS染色体的特异分子标记 的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

簇毛麦4VS染色体的特异性分子标记，选自标记CINAU66和标记CINAU295中的任意一 种；标记CINAU66的引物序列为：CINAU66F：SEQ ID NO.1，CINAU66R：SEQ ID NO.2， 用标记CINAU66的引物从含有簇毛麦4VS染色体的抗病植株中能扩增出约950bp的特异条带； 标记CINAU295的引物序列为：CINAU295F：SEQ ID NO.3，CINAU295R：SEQ ID NO.4，用 标记CINAU295的引物从含有簇毛麦4VS染色体的抗病植株中扩增出约380bp的特异条带。

本发明所述的簇毛麦4VS染色体的特异性分子标记引物，选自CINAU66F/CINAU66R或 CINAU295F/CINAU295R中的任意一对，引物CINAU66F序列为：SEQ ID NO.1，引物 CINAU66R序列为：SEQ ID NO.2，引物CINAU295F序列为：SEQ ID NO.3，引物CINAU295R 序列为SEQ ID NO.4。

本发明所述的分子标记在鉴定含簇毛麦4VS染色体小麦中的应用。

本发明所述的分子标记在分子标记辅助选择育种中的应用。

本发明所述的分子标记引物在鉴定含簇毛麦4VS染色体小麦中的应用。

本发明所述的分子标记引物在分子标记辅助选择育种中的应用。

利用本发明所述的分子标记引物标记抗小麦黄花叶病毒的簇毛麦4VS染色体的方法，包 括以下步骤：

（1）以待鉴定材料的DNA作为模板，用权利要求2所述的分子标记CINAU66或CINAU295 的引物进行PCR扩增；

PCR扩增体系为：含20-100ngDNA的1μL DNA模板，1.0μL10×PCR buffer，0.8μL MgCl₂， 0.8μL dNTP，左、右引物各0.2μL，0.15μL Taq DNA polymerase，5.85μL ddH₂O；

PCR程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火50秒，72℃延伸1分10秒，35 个循环；72℃延伸10分钟；10℃保存；

PCR产物检测：PCR产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比39:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上 电泳分离，再用银染法检测；

（2）两对标记引物鉴定簇毛麦4VS染色体的标准为：用标记CINAU66的引物进行PCR扩增， 能扩增出约950bp特异条带的植株为含有簇毛麦4VS染色体的植株；用标记CINAU295的 引物进行PCR扩增，能扩增出约380bp特异条带的植株为含有簇毛麦4VS染色体的植株。

本发明中的涉及簇毛麦4VS染色体的结构变异体对小麦黄花叶病的抗性稳定，在四个环 境中（2007在南京六合试验点；2008-2010连续三年在江苏扬州试验点）均对小麦黄花叶病表 现高抗。

本发明中能特异追踪簇毛麦4VS染色体的两个标记的引物是分别以小麦EST（BE500311 和BE637507）序列为模板设计而得到的(图4)。

有益效果：

1、本发明中公开的来自簇毛麦4VS染色体的结构变异体对小麦黄花叶病的抗性稳定，在 四个环境中（2007在南京六合试验点；2008-2010连续三年在江苏扬州试验点）均对小麦黄花 叶病表现高抗。来自簇毛麦4VS染色体的抗小麦黄花叶病基因在小麦抗病育种中具有较高的 利用价值。

2、本发明中公开的能特异追踪抗小麦黄花叶病的簇毛麦4VS染色体的两对分子标记的引 物（CINAU66F/CINAU66R和CINAU295F/CINAU295R）是基于小麦EST序列设计而成，用 来鉴定植株中是否簇毛麦4VS染色体，简单易行、方便快捷、扩增稳定。

3、标记引物CINAU66F/CINAU66R和CINAU295F/CINAU295R扩增的产物与簇毛麦4VS 染色体紧密相连，所以用这两对标记引物进行PCR扩增，利用分子标记辅助选择簇毛麦4VS 染色体的准确性高。

附图说明

图1：小麦-簇毛麦T4VS·4DL纯合补偿性易位系。(a):小麦-簇毛麦T4VS·4DL纯合易位系根 尖有丝分裂染色体中期GISH图，簇毛麦总基因组DNA用fluorescein-12-dUTP标记，呈现绿 色信号；(b):小麦-簇毛麦T4VS·4DL纯合易位系根尖有丝分裂染色体中期FISH图,重复序列 克隆pSc119.2用biotin-16-dUTP标记，呈现绿色信号，重复序列克隆pAs1用 digoxigenin-11-dUTP标记，呈现红色信号。

图2：小麦抗黄花叶病单株抗性鉴定分级标准

图3：小麦-簇毛麦双二倍体(a)、小麦-簇毛麦4V（4D）异代换系(b)、T4VS·4DL纯合补偿 性易位系(c)普通小麦镇9523的小麦黄花叶病抗性鉴定结果

图4：两对标记引物CINAU66F/CINAU66R和CINAU295F/CINAU295R所对应的小麦EST （BE500311和BE637507）序列及引物序列位置

图5：用簇毛麦、小麦-簇毛麦双二倍体、小麦-簇毛麦1V-7V二体异附加系、4V（4D）异代换 系、T4VS·4DL纯合补偿性易位系和普通小麦中国春的DNA作为模板，分别用本发明中的两 对标记引物CINAU66F/CINAU66R(a)和CINAU295F/CINAU295R(b)进行PCR扩增，结果表 明标记引物CINAU66F/CINAU66R在抗病材料簇毛麦、小麦-簇毛麦双二倍体、小麦-簇毛麦 4V二体异附加系、4V（4D）异代换系、T4VS·4DL纯合补偿性易位系中均扩增出约950bp的 特异条带，标记引物CINAU295F/CINAU295R均扩增出约380bp的特异条带；而这两对标记 引物在感病的对照普通小麦中国春中均未扩增出相应的特异条带。箭头所示为特异条带。

注：

M：Marker；1：簇毛麦；2：小麦-簇毛麦双二倍体；3：硬粒小麦；4：中国春；5：T4VS·4DL 纯合补偿性易位系；6：T4VL·5DL纯合易位系；7-13：小麦-簇毛麦1V-7V二体异附加系.

具体实施方式

1、簇毛麦4VS所携抗小麦黄花叶病基因的发掘

小麦抗黄花叶病的抗性鉴定标准分为0-5级（图2）（参考文献：Zhu X B,Wang H Y,Guo J,Wu Z  Z,Cao A Z,Bie T D,Nie M J,You F M,Cheng Z B,Xiao J,Liu Y Y,Cheng S H,Chen P D,Wang X E.Mapping  and validation of quantitative trait loci associated with wheat yellow mosaic bymovirus resistance in bread wheat. Theoretical and Applied Genetics,2012,124(1):177-188.）：0级为植株无症状；1级为植株矮缩不明显， 轻度花叶，一般不产生明显的条纹坏死斑，叶片不黄化或少数黄化；2级为植株矮缩不明显,轻 度花叶，产生明显的条纹坏死斑，叶片黄化明显；3级为植株轻度矮缩，花叶明显，条纹坏死 斑占叶面积1/2左右，部分叶片黄化，少数枯死，分蘖黄化矮缩；4级为植株明显矮缩，严重花 叶，条纹斑占叶面积3/4左右，心叶细弱扭曲或呈缩顶状，部分叶片和分蘖枯死；5级为植株严 重矮缩，大部分叶片和分蘖或整株枯死。抗病对照‘西风小麦’对小麦黄花叶病表现高抗，抗性 水平为0级；感病对照‘镇9523’则表现高感，抗级水平为5级。在四个环境中（2007在南京六合 试验点；2008-2010连续三年在江苏扬州试验点）对小麦-簇毛麦双二倍体、小麦-簇毛麦4V（4D） 异代换系、T4VS·4DL纯合补偿性易位系和普通小麦镇9523进行了小麦黄花叶病抗性鉴定，结 果发现凡是含有簇毛麦4VS染色体的材料都对小麦黄花叶病表现高抗（图3）。簇毛麦4VS染色 体所携抗小麦黄花叶病基因是以往研究不曾报道过的，可作为小麦抗黄花叶病育种新的基因资 源来加以利用。

2、特异追踪簇毛麦4VS染色体的分子标记引物的设计

在开发和筛选抗小麦黄花叶病的簇毛麦4VS染色体的特异分子标记研究中，两对分子标 记CINAU66和CINAU295能特异追踪簇毛麦4VS染色体（图5）。这两对标记的引物是根据小 麦第四部分同源群上的两个EST序列（BE500311和BE637507）（见参考文献Qi LL,Echalier B, Chao S,Lazo GR,Butler GE,Anderson OD et al(2004)A chromosome bin map of16,000expressed  sequence tag loci and distribution of genes among the three genomes of polyploid wheat.Genetics 168:701-712），采用在线引物设计软件Primer3V0.4.0设计而成 （http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）。

标记CINAU66的引物为CINAU66F：GCTGAAACAAGAGATTGGCTTA（SEQ ID NO.1） 和CINAU66R：GCCTTATGCCGCGTAATAGAT（SEQ ID NO.2）；（图4）

标记CINAU295的引物为CINAU295F：GGATGATCTGATTGCACTTT（SEQ ID NO.3） 和CINAU295R：GCATCTTTAACCTGTTGCTT（SEQ ID NO.4）。（图4）

3.标记引物CINAU66F/CINAU66R和CINAU295F/CINAU295R在涉及簇毛麦4VS染色 体材料中的分子检测

利用标记引物CINAU66F/CINAU66R在涉及簇毛麦4VS染色体结构变异体中进行PCR扩增 检测。结果表明：在高抗亲本簇毛麦、小麦-簇毛麦双二倍体、小麦-簇毛麦4V二体异附加系、 T4VS·4DL纯合补偿性易位系中均扩增出约950bp的特异条带，而在不含有簇毛麦4VS染色体的 高感材料中均未扩增出该特异条带（图5a）。

利用标记引物CINAU295F/CINAU295R在涉及簇毛麦4VS染色体结构变异体中进行PCR扩 增检测。结果表明：在高抗亲本簇毛麦、小麦-簇毛麦双二倍体、小麦-簇毛麦4V二体异附加系、 T4VS·4DL纯合补偿性易位系中均扩增出约380bp的特异条带，而在不含有簇毛麦4VS染色体的 高感材料中均未扩增出该特异条带（图5b）。

PCR试剂组成为：含20-100ng DNA的1.0μL DNA模板，1.0μL10×PCR buffer，0.8μLMgCl₂， 0.8μLdNTP，左右引物各0.2μL，0.15μL Taq DNA polymerase，5.85μL dd H₂O。

PCR程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火50秒，72℃延伸1分10秒， 35个循环；72℃延伸10分钟；10℃保存，PCR产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比为39:1 的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法进行染色。