表达融合外源表位N蛋白的重组小反刍兽疫病毒的构建及应用

摘要

本发明涉及免疫标记疫苗领域。具体地，本发明涉及表达融合外源表位N蛋白的重组小反刍兽疫病毒的构建及应用。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫标记疫苗领域。具体地，本发明涉及表达融合外源表 位N蛋白的重组小反刍兽疫病毒的构建及应用。

背景技术

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒 属的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的急性、 烈性传染病；临床以发热、口炎、腹泻和肺炎为特征。对山羊和绵羊等小 反刍动物危害严重，给畜牧业造成重大经济损失[1]。PPR于2007年传入 我国西部边境地区，导致局部疫情，对我国畜牧养殖业形成严重威胁。小 反刍兽疫病毒基因组为不分节段的单股负链RNA，基因组长15948bp。 从3’至5’依次分布着N、P、M、F、H、L基因，分别编码核蛋白(N)、磷 酸蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合基质蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大聚合蛋 白(L)这六种结构蛋白，P基因还编码两种非结构蛋白C和V。N蛋白为小 反刍兽疫病毒的核衣壳蛋白，是PPRV中含量最丰富和免疫原性最强的结 构蛋白，在病毒的复制和转录中起主要的作用，其抗原性稳定，在病毒感 染的动物血清中针对N蛋白的抗体占主导地位，主要用于检测诊断研究 [2-4]，是引入外源表位用以构建标记疫苗的合适靶蛋白。

防治小反刍兽疫的主要措施就是进行疫苗免疫接种。常用的PPRV疫 苗株Nigeria 75/1是在Vero细胞上多次传代致弱所获得，是一种安全经济 的疫苗，但该疫苗的缺陷在于无法区分自然感染动物与免疫接种动物[5]。 我国西部小反刍兽疫疫情的防控需要有效的血清学监控，因此标记疫苗的 研制有其必要性和紧迫性。本研究室小反刍兽疫病毒反向遗传操作平台的 建立为小反刍兽疫标记疫苗的构建提供全新的技术途径[6]，在此基础之上 本研究于PPRV N蛋白羧基端分别引入HA、FLAG、5B19表位，利用反 向遗传操作技术，分别成功拯救出表达融合外源表位N蛋白的重组病毒， 并对重组病毒的生物学特性进行了研究。

发明内容

核衣壳蛋白(nucleocapsid，N)是小反刍兽疫病毒(peste des petits  ruminants virus，PPRV)中含量最丰富和免疫原性最强的结构蛋白，是引入 外源表位用以构建标记疫苗的合适靶蛋白。为构建小反刍兽疫标记疫苗， 首先分别构建了在N蛋白羧基端引入外源表位(HA：YPYDVPDYA；FLAG： DYKDDDDK；小鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19： SPLLGCIGSTCAEDGN)的融合基因N^HA、N^FLAG、N^5B19，并克隆至pCAGGS 载体，以其替代PPRV反向遗传拯救系统中的表达天然PPRV N蛋白的辅 助质粒后仍能够成功拯救出小反刍兽疫病毒，且拯救效率前后相差无几， 表明融合外源表位后对N蛋白的功能影响不大。随后分别以N^HA、N^FLAG、 N^5B19基因替换PPRV感染性克隆中的N基因，体外救获表达融合外源表 位N蛋白的重组病毒。蛋白印迹试验和间接免疫荧光试验表明分别融合外 源表位的N蛋白获得了正确表达；体外生长动力学试验分析表明重组病毒 的生长最高滴度虽比亲本毒低，但并不影响其今后作为标记疫苗的使用。 小鼠免疫试验表明，本研究构建的三种标记疫苗rPPRV/GFP/N^HA、 rPPRV/GFP/N^FLAG、rPPRV/GFP/N^5B19都能够诱导特异性的针对外源表位的 抗体，具有显著的标记作用，同时诱导的PPRV病毒中和抗体能够100％ 转阳。这些结果初步表明标记疫苗在山羊、绵羊等小反刍动物上使用的使 用价值，不但能够提供区别自然感染和疫苗免疫感染的外源标记基因的抗 体，还能够提供显著的PPRV病毒中和抗体以预防小反刍兽疫，是预防小 反刍兽疫的新一代的标记弱毒疫苗。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.一种重组小反刍兽疫病毒，在所述病毒的基因组中，在编码磷酸 蛋白(P)和基质蛋白(M)的基因之间插入有编码绿色荧光蛋白(GFP)的基 因，其特征在于：在所述病毒的基因组中，在编码核蛋白(N)的基因的羧 基端融合有编码外源表位的基因。

2.根据第1项所述的重组小反刍兽疫病毒，其中所述外源表位是 HA。

3.根据第2项所述的重组小反刍兽疫病毒，其基因组的核酸序列如 SEQ ID No.1的1116-17936位所示。

4.根据第1项所述的重组小反刍兽疫病毒，其中所述外源表位是 FLAG。

5.根据第4项所述的重组小反刍兽疫病毒，其基因组的核酸序列如 SEQ ID No.2的1116-17933位所示。

6.根据第1项所述的重组小反刍兽疫病毒，其中所述外源表位是 5B19。

7.根据第6项所述的重组小反刍兽疫病毒，其基因组的核酸序列如 SEQ ID No.3的1116-17957位所示。

8.根据第1-7项中任一项所述的重组小反刍兽疫病毒在制备标记的 小反刍兽疫病毒疫苗中的用途。

9.利用根据第1-7项中任一项所述的重组小反刍兽疫病毒制备的标 记的小反刍兽疫病毒疫苗。

10.根据第1-7项中任一项所述的重组小反刍兽疫病毒用作标记的小 反刍兽疫病毒疫苗的用途。

附图说明

图1：融合外源表位的重组病毒的构建。图1A：将分别以引物pprv-N-F 和pprv-N^HA-R(或pprv-N^FLAG-R或pprv-N^5B19-R)、pprv-P-F和pprv-P-R扩 增的PCR产物①(或③)和②克隆至质粒pCI-12II-N/P/M-GFP的XhoI位点； 图中E表示外源表位HA、FLAG、5B19。图1B：用Rsr II酶切来自质粒 pBlue-F/H/L的F-H-L片段，克隆至同样酶切的质粒pCI-12II-N^HA/P/M-GFP (或pNg75/1-GFP/N^FLAG或pNg75/1-GFP/N^5B19)，图中E表示外源表位HA、 FLAG、5B19。

图2：辅助质粒pCAGGS-N^HA、pCAGGS-N^FLAG、pCAGGS-N^5B19对病 毒拯救的影响。A、C、E：用辅助质粒pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-L 拯救rPPRV/GFP病毒；B：用辅助质粒pCAGGS-N^HA、pCAGGS-P、 pCAGGS-L拯救rPPRV/GFP病毒(其对照组为图A)；D：用辅助质粒 pCAGGS-N^FLAG、pCAGGS-P、pCAGGS-L拯救rPPRV/GFP病毒(其对照组 为图C)；F：用辅助质粒pCAGGS-N^5B19、pCAGGS-P、pCAGGS-L拯救 rPPRV/GFP病毒(其对照组为图E)。

图3：蛋白印迹检测外源表位在重组病毒感染vero细胞中的表达。I： 免疫印迹检测感染rPPRV/GFP/N^HA的细胞表达的HA表位；II：免疫印迹检 测感染rPPRV/GFP/N^FLAG的细胞表达的FLAG表位；III：免疫印迹检测感染 rPPRV/GFP/N^5B19的细胞表达的5B19表位；A：使用鼠抗HA单抗；C：使用 鼠抗FLAG单抗；E：使用鼠抗5B19单抗；B、D、F：使用兔抗PPRV N多 抗；1：标准蛋白分子量；2：阴性对照(mock)；3：rPPRV/GFP感染细胞； I-4：rPPRV/GFP/N^HA感染的细胞；II-4：rPPRV/GFP/N^FLAG感染的细胞； III-4：rPPRV/GFP/N^5B19感染的细胞。

图4：间接免疫荧光检测重组病毒感染Vero细胞后外源表位的表达。

图5：rPPRV/GFP/N^HA、rPPRV/GFP/N^FLAG、rPPRV/GFP/N^5B19和 rPPRV/GFP病毒在Vero细胞上的生长曲线。

图6：小鼠免疫试验。Ctl-5B19、Ctl-HA、Ctl-FLAG分别表示以 rPPRV/GFP免疫小鼠的血清分别检测5B19、HA、FLAG的抗体，作为各 自外源表位的阴性对照；*、#、$表示P＜0.05。

具体实施方式

材料和方法

1.重组质粒、病毒、动物和细胞

表达GFP的重组PPRV感染性克隆质粒pN75/1-GFP，辅助质粒 pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-L及pBlue-F/H/L、pCI-12II-N/P/M-GFP 质粒由本实验室构建并保存[7](参见发明专利，专利号：201010559545.8)； 表达GFP的重组小反刍兽疫病毒rPPRV/GFP由本实验室制备并保存[7] (参见国家发明专利，专利号：201010559545.8)，rPPRV/GFP滴度在Vero 细胞(ATCC No.CCL-81)上测定。BALB/C小鼠购自北京维通利华实验动物 技术有限公司。

2.主要试剂

Primer Star HS DNA聚合酶购自TaKaRa公司；快速克隆试剂盒 (ClonExpress^TM one step Cloning Kit)购自南京诺唯赞(vazyme)生物技术有 限公司；T4 DNA连接酶及其它限制性内切酶均购自NEB公司；抗HA taq  MAb购自北京中杉金桥生物技术有限公司；抗FLAG taq MAb购自北京中 杉金桥生物技术有限公司；兔抗PPRV N蛋白的高免血清由本实验室制备 并保存(该高免血清由原核表达的PPRV N蛋白经纯化后免疫新西兰大白 兔所获得，具体参见文献[8])；鼠抗5B19的高免血清由本实验室制备并保 存(在上海捷瑞生物工程有限公司合成偶联多肽5B19-KLH[完全商品化 的]，该多肽多次免疫BALB/c小鼠获得抗5B19的高免血清)；TRITC标 记山羊抗鼠IgG荧光抗体、TRITC标记山羊抗兔IgG荧光抗体、辣根过氧 化物酶(HRP)标记的兔抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊 抗兔IgG抗体购自Sigma公司；鼠源反转录酶(M-MLV)试剂盒以及磷酸钙 转染试剂盒(Calcium phosphate Transfection Kit)均购自Invitrogen公司；小 量病毒RNA抽提试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司。

3.引物

根据GenBank中PPRV Nigeria 75/1毒株的全长基因组(HQ197753.1) 基因序列，结合外源表位特点，设计将融合外源表位的N基因克隆至感染 性全长cDNA的引物以及RT-PCR鉴定引物。引物由上海捷瑞生物工程有 限公司合成(表1)。

表1引物设计

注：限制性位点由下划线标注；外源表位由斜体标注；“粗体碱基”是为 了满足“六碱基原则”而额外添加的。

实施例1、融合外源表位的重组病毒的构建

以质粒pCAGGS-N为模板，以Epitope-F和HA-R为引物进行PCR扩 增，PCR产物经SacI和KpnI双酶切后克隆到pCAGGS的SacI和KpnI酶 切位点之间，构建pCAGGS-N^HA质粒并测序；以质粒pCAGGS-N为模板， 以Epitope-F和FLAG-R为引物进行PCR扩增，PCR产物经SacI和KpnI 双酶切后克隆到pCAGGS的SacI和KpnI酶切位点之间，构建 pCAGGS-N^FLAG质粒并测序；以pCAGGS-N为模板，以Epitope-F和 5B19-R1为引物进行PCR扩增，PCR产物经SacI单酶切后克隆到 pBlueScrip II KS(+)载体(购自stratagene公司)的SacI和EcoR V位点之 间，构建pBlue-5B19₁质粒，然后以pBlue-5B19₁质粒为模板，以Epitope-F 和5B19-R2为引物进行PCR扩增，PCR产物经SacI和KpnI双酶切后克 隆到pCAGGS的SacI和KpnI酶切位点之间，构建pCAGGS-N^5B19质粒并 测序。然后分别以pCAGGS-N^HA、pCAGGS-N^FLAG、pCAGGS-N^5B19为模板， 并相应地分别利用三对引物pprv-N-F和pprv-N^HA-R、pprv-N-F和 pprv-N^FLAG-R、pprv-N-F和pprv-N^5B19-R为正反向引物进行PCR扩增，分 别得到产物fN^HA、fN^FLAG、fN^5B19(见图1，fN^HA：①；fN^FLAG/fN^5B19：③)； 以pCI-12II-N/P/M-GFP为模板，以pprv-P-F和pprv-P-R为引物进行PCR 扩增所得产物fP(见图1，片段②)，将PCR产物fN^HA、fN^FLAG、fN^5B19分 别地和fP用快速克隆技术克隆到pCI-12II-N/P/M-GFP质粒的XhoI位点， 测序验证后分别命名为pCI-12II-N^HA/P/M-GFP、pCI-12II-N^FLAG/P/M-GFP、 pCI-12II-N^5B19/P/M-GFP(图1A)。用Rsr II处理pBlue-F/H/L，将F/H/L片 段分别克隆到pCI-12II-N^HA/P/M-GFP、pCI-12II-N^FLAG/P/M-GFP、 pCI-12II-N^5B19/P/M-GFP的Rsr II位点，构建得到感染性克隆质粒 pNg75/1-GFP/N^HA(其核酸序列如SEQ ID No.1所示，其中编码HA的序 列为SEQ ID No.1中的2798-2824位)、pNg75/1-GFP/N^FLAG(其核酸序列 如SEQ ID No.2所示，其中编码FLAG的序列为SEQ ID No.2中的 2798-2821位)、pNg75/1-GFP/N^5B19(其核酸序列如SEQ ID No.3所示，其 中编码5B19的序列为SEQ ID No.3中的2798-2845位)(图1B)。

实施例2、表达融合外源表位N蛋白的重组病毒的拯救

将感染性克隆质粒pNg75/1-GFP/N^HA与辅助质粒pCAGGS-N、 pCAGGS-P、pCAGGS-L共转染Vero细胞进行病毒的拯救，具体试验方法 参照文献[6]，将救获的病毒命名为rPPRV/GFP/N^HA(其编码核酸序列如 SEQ ID No.1中的1116-17936位所示)。同样方法救获重组病毒 rPPRV/GFP/N^FLAG(其编码核酸序列如SEQ ID No.2中的1116-17933位所 示)和rPPRV/GFP/N^5B19(其编码核酸序列如SEQ ID No.3中的1116-17957 位所示)。为了鉴定三种外源表位对N蛋白功能的影响，通过病毒拯救效 率来验证N蛋白的功能是否受到影响。病毒拯救后4～6天观察GFP的表 达情况，结果(图2)表明：其一，采用辅助质粒pCAGGS-N、pCAGGS-N^HA、 pCAGGS-N^FLAG、pCAGGS-N^5B19都能够顺利拯救出表达GFP的重组病毒 rPPRV/GFP，在荧光倒置显微镜下可观察到绿色荧光阳性信号，说明融合 所述三种外源表位后，N蛋白的功能并没有丧失；其二，从荧光细胞的数 量上看，两者无显著差异，表明融合所述三种外源表位对N蛋白功能应该 影响不大。

实施例3、重组病毒的RT-PCR鉴定

将感染性克隆质粒pNg75/1-GFP/N^HA与辅助质粒pCAGGS-N、 pCAGGS-P、pCAGGS-L共转染Vero细胞进行病毒的拯救，具体试验方法 参照文献[6]，救获融合HA表位的重组病毒rPPRV/GFP/N^HA。为确定HA 表位是否成功引入N基因的羧基端，对收获的rPPRV/GFP/N^HA病毒液和 rPPRV/GFP病毒液提取RNA，以NP-rtpcr-F和NP-rtpcr-R为引物进行 RT-PCR。扩增出来的片段与对照rPPRV/GFP经相同引物RT-PCR扩增出 来的片段大小一致，进一步测序分析表明HA表位已经成功的N蛋白的羧 基端。同样方法检测到FLAG和5B19表位成功的引入N蛋白的羧基端。

实施例4、蛋白印迹检测

为了鉴定融合外源表位的N蛋白在重组病毒感染细胞中的表达情况， 按MOI为0.1将rPPRV/GFP/N^HA、rPPRV/GFP/N^FLAG、rPPRV/GFP/N^5B19病毒分别接种到Vero单层细胞上，当CPE达到80％左右，刮下细胞并离 心，细胞沉淀用细胞裂解液(RIPA裂解液，购自碧云天生物科技有限公司) 裂解，细胞裂解物经SDS-PAGE电泳分离后，半干转移法转至硝酸纤维素 膜上；5％脱脂乳4℃封闭过夜。分别以鼠抗HA taq MAb和兔抗PPRV N 蛋白高免血清为一抗，以HRP标记的兔抗小鼠IgG、HRP标记的山羊抗 兔IgG为二抗对rPPRV/GFP/N^HA处理后样品进行蛋白印迹(western blotting) 分析；分别以鼠抗FLAG taq MAb和兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗， 以HRP标记的兔抗小鼠IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗对 rPPRV/GFP/N^FLAG处理后样品进行蛋白印迹分析；分别以鼠抗5B19的高 免血清和兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗，以HRP标记的兔抗小鼠IgG、 HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗对rPPRV/GFP/N^5B19处理后样品进行蛋白 印迹分析。同时设立未感染的细胞对照(Mock)和rPPRV/GFP感染的细胞 对照。

结果显示，以鼠抗HA taq MAb为一抗进行western blotting检测，在 rPPRV/GFP/N^HA感染的细胞中可检测到正确大小的条带，约为59.0ku(图 3 I-A-4)，而在未感染的细胞以及rPPRV/GFP感染的细胞中均未检测到 条带(图3 I-A-2和I-A-3)；以兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗进行 western blotting检测，在rPPRV/GFP感染的细胞和rPPRV/GFP/N^HA感染的 细胞中同时检测到大小约为59.0ku的条带(图3 I-B-3和I-B-4)，而在未 感染的细胞中未检测到条带(图3 I-B-2)。上述结果表明，rPPRV/GFP/N^HA能够正确表达融合HA表位的N蛋白。以鼠抗FLAG taq MAb为一抗进行 western blotting检测，在rPPRV/GFP/N^FLAG感染的细胞中可检测到正确大 小的条带，约为59.0ku(图3 II-C-4)，而在未感染的细胞以及rPPRV/GFP 感染的细胞中均未检测到条带(图3 II-C-2和II-C-3)；以兔抗PPRV N蛋 白高免血清为一抗进行western blotting检测，在rPPRV/GFP感染的细胞和 rPPRV/GFP/N^FLAG感染的细胞中同时检测到大小约为59.0ku的条带(图3 II-D-3和II-D-4)，而在未感染的细胞中未检测到条带(图3 II-D-2)。上述 结果表明，rPPRV/GFP/N^FLAG能够正确表达融合FLAG表位的N蛋白。以 鼠抗5B19的高免血清为一抗进行western blotting检测，在 rPPRV/GFP/N^5B19感染的细胞中可检测到正确大小的条带，约为59.5ku(图 3 III-E-4)，而在未感染的细胞以及rPPRV/GFP感染的细胞中均未检测到 条带(图3 III-E-2和III-E-3)；以兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗进行 western blotting检测，在rPPRV/GFP感染的细胞和rPPRV/GFP/N^5B19感染 的细胞中同时检测到大小约为59.5ku的条带(图3 III-F-3和III-F-4)，而在 未感染的细胞中未检测到条带(图3 III-F-2)。上述结果表明， rPPRV/GFP/N^5B19能够正确表达融合5B19表位的N蛋白。综上结果可得重 组病毒能够正确表达融合外源表位的N蛋白。

实施例5、间接免疫荧光试验

为检测重组病毒在Vero细胞中的复制及融合外源表位N蛋白的表达 情况，将rPPRV/GFP/N^HA、rPPRV/GFP/N^FLAG、rPPRV/GFP/N^5B19病毒按 MOI为0.1分别接种于Vero单层细胞，待CPE约70％～80％时，依次以 3％的多聚甲醛室温固定细胞30min，0.5％Triton X-100透膜30min。分别 以鼠抗HA taq MAb和兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗，TRITC标记山 羊抗鼠IgG荧光抗体和TRITC标记山羊抗兔IgG荧光抗体为二抗对 rPPRV/GFP/N^HA处理后样品进行间接免疫荧光(IFA)检测；分别以鼠抗 FLAG taq MAb和兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗，TRITC标记山羊抗 鼠IgG荧光抗体和TRITC标记山羊抗兔IgG荧光抗体为二抗对 rPPRV/GFP/N^FLAG处理后样品进行IFA(间接免疫荧光)检测；分别以鼠抗 5B19的高免血清和兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗，TRITC标记山羊 抗鼠IgG荧光抗体和TRITC标记山羊抗兔IgG荧光抗体为二抗对 rPPRV/GFP/N^5B19处理后样品进行IFA检测。同时设立未感染的细胞对照 (Mock)和rPPRV/GFP感染的细胞对照。

结果显示，以鼠抗HA taq MAb为一抗进行IFA检测，在 rPPRV/GFP/N^HA感染的细胞中可检测到HA表位的表达(图4A)，而在 rPPRV/GFP感染的细胞和未感染的细胞中未检测到HA表位的表达(图4B 和C)。以兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗进行IFA检测，在 rPPRV/GFP/N^HA感染的细胞和rPPRV/GFP感染的细胞中均检测到N蛋白 的表达(图4D和E)，而在未感染的细胞中未检测到N蛋白的表达(图4F)。 综上所述，rPPRV/GFP/N^HA能够正确表达融合HA表位的N蛋白。以鼠抗 FLAG taq MAb为一抗进行IFA检测，在rPPRV/GFP/N^FLAG感染的细胞中 可检测到FLAG表位的表达(图4G)，而在rPPRV/GFP感染的细胞和未感 染的细胞中未检测到FLAG表位的表达(图4H和I)。以兔抗PPRV N蛋白 高免血清为一抗进行IFA检测，在rPPRV/GFP/N^FLAG感染的细胞和 rPPRV/GFP感染的细胞中均检测到N蛋白的表达(图4J和K)，而在未感 染的细胞中未检测到N蛋白的表达(图4L)。综上所述，rPPRV/GFP/N^FLAG能够正确表达融合FLAG表位的N蛋白。以鼠抗5B19的高免血清为一抗 进行IFA检测，在rPPRV/GFP/N^5B19感染的细胞中可检测到5B19表位的 表达(图4M)，而在rPPRV/GFP感染的细胞和未感染的细胞中未检测到 5B19表位的表达(图4N和O)。以兔抗PPRV N蛋白高免血清为一抗进行 IFA检测，在rPPRV/GFP/N^5B19感染的细胞和rPPRV/GFP感染的细胞中均 检测到N蛋白的表达(图4P和Q)，而在未感染的细胞中未检测到N蛋白 的表达(图4R)。综上所述，rPPRV/GFP/N^5B19能够正确表达融合5B19表 位的N蛋白。综上结果可得重组病毒能够正确表达融合外源表位的N蛋 白。

实施例6、重组病毒的生长动力学分析

将rPPRV/GFP/N^HA、rPPRV/GFP/N^FLAG、rPPRV/GFP/N^5B19和 rPPRV/GFP病毒按MOI为0.01分别接种于Vero单层细胞上。分别在第3、 4、5、6、7和8天收获细胞，并冻融两次，随后在96孔细胞板进行病毒 滴度的滴定，绘制重组病毒在Vero细胞上的生长动力学曲线。

生长动力学曲线显示，rPPRV/GFP/N^HA、rPPRV/GFP/N^FLAG、 rPPRV/GFP/N^5B19三种重组病毒与rPPRV/GFP的病毒滴度均在第五天达到 峰值，但三种重组病毒的最高滴度(rPPRV/GFP/N^HA：10^6.2TCID₅₀/mL； rPPRV/GFP/N^FLAG：10^5.4TCID₅₀/mL；rPPRV/GFP/N^5B19：10^6.9TCID₅₀/mL) 低于亲本毒rPPRV/GFP，rPPRV/GFP/N^HA与rPPRV/GFP、rPPRV/GFP/N^FLAG与rPPRV/GFP、rPPRV/GFP/N^5B19与rPPRV/GFP两两配对样本T检验结果 (P＜0.05)表明rPPRV/GFP/N^HA、rPPRV/GFP/N^FLAG、rPPRV/GFP/N^5B19生长 复制能力受到一定程度的影响。

实施例7、小鼠免疫试验

本实验室已证实rPPRV/GFP重组毒与疫苗株Nigeria75/1的感染与生 长复制能力相近[6]。为确定重组病毒rPPRV/GFP/N^HA、rPPRV/GFP/N^FLAG、 rPPRV/GFP/N^5B19在Vero细胞上的生长复制能力，将rPPRV/GFP/N^HA、 rPPRV/GFP/N^FLAG、rPPRV/GFP/N^5B19和rPPRV/GFP稀释成1.5× 10⁶TCID₅₀/ml，经腹腔(200ul)和两后腿肌肉(每条腿各50ul)共注射4.5× 10⁵TCID₅₀剂量各免疫5只BALB/C小鼠(其中rPPRV/GFP免疫组为4只)， 免疫后3周按相同剂量和免疫途径进行加强免疫，分别于免疫前、2次免 疫后2周采血分离血清，采用ELISA方法检测Ha、flag和5B19的抗体， 同时检测PPRV病毒中和抗体。ELISA方法：将HA、Flag、5B19三种多 肽进行人工合成(中科亚光生物科技有限公司)。将合成的多肽以0.5μg/孔 的包被96孔酶标板，4℃过夜，PBST(0.05％Tween20)洗涤4遍，3％的鱼 皮胶溶液37℃封闭2h，PBST洗涤4遍，待检血清用3％的脱脂乳溶液以 1∶50进行稀释，每孔加入100μl，37℃反应1h，PBST洗涤4次，每次 5min。加入1∶5000稀释后的HRP-兔抗鼠IgG(Sigma)100μl，37℃反应 1h，PBST洗涤3次。以TMB作为底物，50μl/孔，37℃作用10min。加 入50μl/孔的0.5M H₂SO₄终止反应，在酶标仪上测定OD450nm值。根据 P/N值确定阴性、阳性血清的判定标准。小反刍兽疫病毒中和抗体检测方 法参见之前报道的文献[6，9，10]。病毒中和抗体滴度≥10判定为阳性。

结果如图6所示，2次免疫后2周的外源表位特异性抗体比免疫前有 大幅度的提高，t检验表明免疫前后的外源表位抗体差异显著(图6，*、#、 $P＜0.05)。同时，PPRV病毒中和抗体转阳率在2次免疫后2周后都100％ 转阳。表明本研究构建的标记疫苗具有良好的应用价值。

讨论：

由于Nigeria75/1疫苗株免疫效力确实，持续期长，而且经过数十年 的使用，非常安全可靠，因此是构建标记疫苗的极其合适的毒株。为此我 们采用本研究室新建立的采用PPR弱毒疫苗株Nigeria75/1的反向遗传操 作系统[6]，通过融合外源表位(HA、FLAG、5B19)至N蛋白羧基端来构建 标记疫苗。

本研究标记疫苗的构建重在探索，在重组病毒rPPRV/GFP的基础上 构建表达融合外源表位(HA、FLAG、5B19)N蛋白的重组病毒 rPPRV/GFP/N^HA、rPPRV/GFP/N^FLAG、rPPRV/GFP/N^5B19，其GFP的表达方 便进行后续试验的观察和研究。标记疫苗所采用的外源表位为8～16个氨 基酸的短肽，对外源靶蛋白的空间结构影响小并且具有良好的免疫原性 [11]，适合引入PPRV N蛋白羧基端以构建标记疫苗。RT-PCR、蛋白印迹 和IFA结果表明，在救获的重组病毒中，外源表位成功引入N蛋白的羧基 端，融合的外源表位随着N蛋白获得表达而获得表达。虽然生长动力学试 验结果显示重组病毒在细胞上的复制能力受到一定的影响，但其最高病毒 滴度可达到Nigeria75/1弱毒疫苗株在免疫时的使用滴度10³TCID₅₀，因此 rPPRV/GFP/N^HA能够符合将来作为标记疫苗的使用要求。

最后，小鼠免疫试验表明，本研究构建的标记疫苗rPPRV/GFP/N^HA、 rPPRV/GFP/N^FLAG、rPPRV/GFP/N^5B19都能够诱导特异性的针对外源表位的 抗体，具有显著的标记作用，同时诱导的PPRV病毒中和抗体能够100％ 转阳。这些结果初步表明其在山羊、绵羊等小反刍动物上的使用价值，不 但能够提供区服自然感染和疫苗免疫感染的外源标记基因的抗体，还能够 提供显著的PPRV病毒中和抗体以预防小反刍兽疫，是预防小反刍兽疫的 新一代的标记弱毒疫苗。

本文构建的将标记基因融合至N蛋白的重组小反刍兽疫病毒，为全 球首创。理论上标记基因插入可能会影响N蛋白的功能，可能会对重组疫 苗生长有影响，试验也表明融合的表位也确实轻微影响了病毒的复制能 力，但动物实验表明，本研究构建的重组标记疫苗能够成功诱导特异的标 记表位抗体和较高的小反刍兽疫中和抗体，标记基因的插入对于这些重组 标记疫苗的将来使用没有影响。此外，构建的重组疫苗克服了亲本疫苗株 和其它传统PPR疫苗株不能区分自然感染和疫苗免疫感染的缺陷，这些都 表明本研究具有一定的新颖性和创新性。

参考文献

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