黄花苜蓿延伸因子2MfEF2及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种黄花苜蓿延伸因子2MfEF2及其编码基因和应用，属于植物基因工程领域。本发明通过获得MfEF2基因，并将获得的MfEF2基因构建植物表达载体，用构建的表达载体转化植物组织，然后培育成转基因植株。MfEF2基因受低温的诱导；本发明提供了利用MfEF2基因培育耐寒植物的方法，将该基因在植物过量表达后，提高了转基因植物的耐冻性和耐冷性。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种黄花苜蓿延伸因子2MfEF2及其编码基因和应用。 

背景技术

环境中的非生物胁迫，例如干旱、盐碱、冷害和热害等影响植物的生长和发育，造成农作物的减产，也影响林木、果树、花卉、园艺观赏植物的正常生长和品质，培育耐逆的植物品种是种植业的主要目标之一。然而，植物耐逆性是一个数量性状，涉及至少几百个基因的作用，因此从耐逆性强的植物中分离耐性基因是十分必要的。 

EF2基因所编码的延伸因子EF2是一个依赖GTP水解的易位酶，介导蛋白合成时核糖体的易位，每水解一个GTP，核糖体便在mRNA上前进3个碱基。它利用GTP水解释放的能量，将氨酰tRNA从核糖体上的A位点转移到P位点，从而介导肽链的延伸。EF2是生物细胞蛋白质合成所必需的，它的变化对蛋白的合成有重要影响。 

目前已从多种植物克隆了EF2基因，但还没有从非常耐寒、耐旱的黄花苜蓿中克隆。Guo等（2002）发现，EF2的突变会阻碍拟南芥低温信号的传导，并降低其抗冻性；EF2的突变只影响植物在低温（0℃）条件下合成蛋白质，而对植物在室温下合成蛋白质无影响。证明EF2在植物冷信号传导中起重要作用，从而调控植物抗冷性。黄花苜蓿（Medicago sativa subsp.falcata)是一种非常耐寒的豆科牧草种质，在寒冷的西伯利亚也有分布，从中克隆抗寒基因，能为转基因育种提供更为优良的目的基因，而且对于农林植物抗逆分子育种尤为重要和迫切。 

发明内容

为克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种黄花苜蓿延伸因子2MfEF2。 

本发明的另一目的在于提供编码所述的黄花苜蓿延伸因子2MfEF2的基因。 

本发明的再一目的在于提供所述的黄花苜蓿延伸因子2MfEF2的应用。 

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种黄花苜蓿延伸因子2MfEF2，其氨基酸序列如下所示： 

MVKFTADELRRIMDYKHNIRNMSVIAHVDHGKSTLTDSLVAAAGIIAQEVAGDVRMTDTRADEAERGITIKSTGISLYYEMTDESLKRFKGERNGNEYLINLIDSPGHVDFSSEVTAALRITDGALVVVDCVEGVCVQTETVLRQALGERIRPVLTVNKMDRCFLELQVDGEEAYQTFSRVIENANVIMATYEDPLLGDVMVYPEKGTVAFSAGLHGWAFTLTNFAKMYASKFGVDESKMMERLWGENFFDPATKKWTTKNTGSASCKRGFVQFCYEPIKQIINTCMNDQKDKLWPMLTKLGVTMKSDEKDLMGKPLMKRVMQTWLPASTALLEMMIFHLPSPHTAQRYRVENLYEGPLDDQYANAIRNCDPEGPLMLYVSKMIPASDKGRFFAFGRVFAGKVSTGLKVRIMGPNFVPGEKKDLYVKSVQRTVIWMGKRQETVEDVPCGNTVALVGLDQFITKNATLTNEKEVDAHPIRAMKFSVSPVVRVAVQCKVASDLPKLVEGLKRLAKSDPMVVCTIEESGEHIVAGAGELHLEICLKDLQDDFMGGAEIIKSDPVVSFRETVLDRSIRTVMSKSPNKHNRLYMEARPLEDGLAEAIDEGTIGPRDDPKNRSKILSEQYGWDKDLAKKIWCFGPETTGPNMVVDMCKGVQYLNEIKDSVVAGFQWASKEGVLSEENMRGICFEVCDVVLHTDAIHRGGGQIIPTARRVFYASQLTAKPRLLEPVYMVEIQAPEQALGGIYSVLNQKRGHVFEEMQRPGTPLYNIKAYLPVIESFGFSSQLRAATSGQAFPQCVFDHWDTMTSDPLEAGSQAAQLVMDIRKRKGLKEQMTPLSEFEDKL 

编码所述的黄花苜蓿延伸因子2MfEF2的核苷酸序列如下所示： 

ATGGTGAAGTTCACAGCTGATGAGTTACGTCGTATTATGGACTACAAGCACAACATTCGTAATATGTCTGTCATTGCTCATGTTGACCACGGAAAATCAACTCTAACCGACTCTCTAGTCGCTGCTGCGGGAATTATTGCCCAGGAAGTTGCAGGTGATGTCCGTATGACTGACACCCGTGCTGATGAAGCTGAGCGTGGTATTACAATCAAGTCTACCGGTATCTCACTCTACTATGAAATGACTGATGAATCTCTCAAGAGGTTCAAGGGGGAGCGTAATGGAAATGAGTATCTCATTAATCTCATTGATTCCCCTGGGCACGTCGACTTCTCATCTGAGGTTACTGCTGCACTCCGTATTACTGATGGAGCACTTGTGGTAGTTGACTGTGTGGAAGGTGTATGTGTCCAAACTGAAACTGTGCTGCGACAAGCTCTTGGAGAAAGGATTAGGCCTGTTCTTACAGTTAATAAGATGGACAGGTGCTTCCTTGAGCTCCAGGTTGATGGAGAGGAGGCATACCAGACCTTTTCAAGGGTGATTGAGAATGCTAATG TGATTATGGCTACATATGAAGATCCACTTCTTGGTGATGTTATGGTGTATCCAGAGAAAGGAACAGTTGCTTTTTCTGCTGGTTTGCATGGTTGGGCTTTTACTCTGACCAACTTTGCAAAAATGTATGCCTCAAAATTTGGCGTTGACGAGTCCAAGATGATGGAGAGGCTCTGGGGTGAAAATTTCTTTGATCCTGCCACAAAAAAATGGACCACCAAGAATACTGGTTCAGCTTCGTGCAAGCGTGGGTTTGTTCAGTTCTGTTATGAGCCTATCAAGCAGATCATCAACACTTGTATGAATGATCAGAAGGATAAGTTGTGGCCTATGCTCACAAAGCTAGGGGTCACCATGAAGTCTGATGAGAAGGACCTGATGGGTAAGCCATTGATGAAACGTGTTATGCAAACCTGGTTGCCAGCAAGTACTGCCCTACTAGAAATGATGATCTTTCATCTTCCCTCACCACATACTGCCCAGAGGTACCGTGTTGAGAATTTGTATGAGGGCCCCCTTGACGATCAATATGCAAATGCTATCAGAAACTGTGATCCTGAAGGACCTCTGATGCTTTATGTGTCAAAGATGATTCCAGCATCTGATAAAGGAAGGTTTTTTGCTTTTGGCCGTGTGTTTGCCGGTAAGGTTTCCACAGGTTTGAAGGTCAGAATTATGGGACCAAATTTTGTCCCTGGAGAGAAGAAAGATCTGTACGTGAAAAGTGTCCAGAGAACTGTTATTTGGATGGGAAAGAGACAGGAGACTGTTGAGGATGTGCCTTGTGGTAACACTGTTGCTTTGGTTGGTTTGGATCAATTTATTACAAAGAATGCTACATTGACAAATGAGAAGGAAGTTGATGCCCACCCTATCCGAGCTATGAAGTTTTCCGTCTCCCCTGTTGTGCGTGTTGCTGTTCAGTGCAAGGTTGCTTCAGATCTTCCCAAGCTTGTTGAAGGTCTCAAACGTTTGGCTAAGTCAGATCCTATGGTTGTTTGTACTATTGAGGAGTCTGGGGAACACATTGTTGCTGGTGCAGGAGAGCTTCATCTTGAGATCTGTTTGAAAGATTTGCAGGATGATTTCATGGGTGGTGCTGAGATTATTAAATCTGACCCTGTTGTGTCATTCAGGGAGACTGTTCTTGATAGATCAATCCGCACAGTGATGAGTAAATCACCCAACAAGCACAACCGGCTGTACATGGAAGCAAGACCATTGGAGGATGGACTTGCAGAGGCCATTGATGAGGGCACAATAGGACCAAGGGATGATCCCAAGAATCGTTCTAAGATCTTGTCCGAACAGTATGGTTGGGACAAGGATCTTGCCAAGAAAATTTGGTGTTTTGGCCCTGAGACCACCGGGCCCAACATGGTGGTTGATATGTGTAAGGGAGTTCAGTATTTGAATGAAATCAAGGATTCCGTGGTTGCTGGATTCCAGTGGGCATCAAAAGAAGGTGTTTTGTCGGAAGAAAACATGAGAGGCATCTGCTTTGAAGTATGTGATGTTGTCCTGCACACTGATGCTATCCACAGAGGAGGTGGTCAGATCATTCCTACTGCTAGGAGGGTCTTCTATGCCTCACAGCTCACAGCCAAACCCAGGCTTCTGGAGCCTGTTTA CATGGTGGAAATCCAAGCTCCTGAGCAAGCTCTTGGTGGTATCTACAGTGTTCTGAATCAGAAACGTGGGCACGTTTTTGAAGAAATGCAGAGGCCCGGTACCCCACTTTACAACATCAAAGCATACCTCCCTGTCATTGAGTCCTTTGGATTTTCTAGTCAGTTGAGAGCTGCAACATCTGGGCAGGCTTTCCCCCAGTGTGTCTTTGATCATTGGGACACCATGACCTCAGATCCTTTGGAGGCTGGATCACAAGCTGCACAGCTTGTTATGGACATCCGCAAGAGGAAGGGACTCAAGGAACAAATGACTCCCCTTTCTGAGTTTGAAGACAAGCTTTAA 

上述黄花苜蓿延伸因子2MfEF2在提高植物抗寒性中的应用：该应用包括用本发明的MfEF2基因构建植物表达载体；用构建的表达载体转化植物组织；将转化的植物组织培育成转基因植株。 

所述的用本发明的MfEF2基因构建植物表达载体，可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体； 

所述植物表达载体包括但不限于双元农杆菌载体以及用于单子叶基因枪转化的载体；所述的双元农杆菌载体包括pBI121，pCAMBIA系列载体；所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它效应mRNA加工或基因表达的DNA片段； 

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可使用任何一种强启动子或诱导型启动子；这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子和泛素（Ubiqutin）启动子，它可单独使用或与其他的植物启动子结合使用；此外使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，这些增强子区域包括但不限于ATG起始密码子和邻接区域。起始密码子必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以使多种不同的来源，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或来自结构基因。 

为了便于对转基因植株进行鉴定及筛选，可对所使用的植物表达载体进行加工，包括加入或替换植物可选择性标记。可使用的选择性标记包括编码抗除草剂的酶的基因或具有抗性的抗生素标记物；所述的除草剂包括草丁膦、草甘膦等，所述的抗生素包括卡那霉素、潮霉素、庆大霉素等。从转基因植物的安全性考虑，可以不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。 

含有MfEF2基因的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。 

本发明的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA 转化，显微注射、电穿孔等各种常规或特异的遗传转化方法导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主可以是双子叶植物或单子叶植物。 

所述的MfEF2基因片段的获得和植物表达载体的制备方法，包括以下步骤： 

（1）引物设计 

①MfEF2扩增上游引物RT77：CTAGTCAAGATGGTGAAGTTCACAG； 

②MfEF2扩增下游引物RT78：CAGTTTTCATAACAGCCAAGTACAT； 

（2）MfEF2基因片段的获得： 

以黄花苜蓿（Medicago falcata）的cDNA为模板，使用引物①和引物②扩增MfEF2基因片段，并连接进入pGEM-T easy载体中，构建获得pGEM-MfEF2载体； 

（3）植物表达载体pBI-MfEF2的构建 

对重组质粒pGEM-MfEF2和pBI-121表达质粒分别用XbaⅠ和BamHⅠ进行双酶切，回收MfEF2基因片段和线性化的pBI-121载体，进行连接构建获得植物表达载体pBI-MfEF2。 

所述的转基因植物为转基因烟草； 

所述的转基因烟草的获得，包括以下的步骤： 

（1）用电转的方法将pBI-MfEF2导入根瘤农杆菌EHA105中，获得含表达载体pBI-MfEF2农杆菌阳性菌落； 

（2）将活化的含有表达载体pBI-MfEF2的农杆菌EHA105浸染烟草无菌苗，经共培养和抗生素筛选，获得转基因烟草。 

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： 

发明人已从黄花苜蓿中克隆了EF2基因的cDNA序列MfEF2。MfEF2基因的表达受低温胁迫诱导，构建了适合于双子叶植物的表达载体，转化双子叶模式植物烟草，转基因植株明显提高了抗冻性和抗冷性。 

附图说明

图1是植物表达载体pBI-MfEF2的表达框示意图。 

图2本发明所述MfEF2基因开放阅读框序列的PCR扩增琼脂糖电泳图，其中，M是标准DNA分子；1是MfEF2基因的扩增片段。 

图3是MfEF2基因的植物表达载体的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是标准DNA分子；1-3是3组构建的植物表达质粒的MfEF2基因的扩增片段。 

图4是低温诱导MfEF2基因表达的实时定量PCR检测柱状图。柱上方的字母a和b表示不同材料之间的差异显著（P≤0.05），即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异，数据柱上方字母不同时表示存在显著差异。 

图5是导入MfEF2基因的转基因烟草的PCR鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图，其中，W表示野生型；P表示pBI-MfEF2载体，为阳性对照；编号1～11表示不同的转基因烟草。 

图6是3个导入MfEF2基因的转基因烟草的Southern杂交和Northern杂交鉴定，其中，W表示野生型；数字1-3表示不同的转基因烟草；图（a）是Southern杂交，图（b）是Northern杂交。 

图7是导入MfEF2杂交基因的转基因烟草抗冻性检测，其中图（a）是冻处理后的存活率，图（b）是冻处理前后各的植株照片。柱上方的字母a和b表示不同材料之间的差异显著（P≤0.05），即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异，数据柱上方字母不同时表示存在显著差异。 

图8是表达MfEF2基因的转基因烟草抗冷性的相对电导率检测。其中，W表示野生型；编号1～3表示不同的转基因烟草。柱上方的字母a和b表示不同材料之间的差异显著（P≤0.05），即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异，数据柱上方字母不同时表示存在显著差异。 

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 

黄花苜蓿种子：品种为海拉尔，中国农科院北京畜牧兽医研究所牧草种质资源库。 

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105：购自北京天恩泽基因科技有限公司。 

烟草或烟草（Nicotiana tabacum L.）种子：品种为中烟90，广东省农科院作物研究所。 

pBI121表达载体:购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。 

大肠杆菌DH10B：购自上海超研生物科技有限公司。 

实施例1MfEF2的克隆 

一、黄花苜蓿cDNA模板制备 

将苗龄8～10周的黄花苜蓿植株放入温度为5℃的人工气候箱（光照强度为200μmol m^-2s^-1）内，光/暗周期为12小时，进行低温处理，连续处理2天。 

提取总的RNA：剪取成熟叶片，加入液氮快速研磨成粉末，转移至2ml离心管中，加入1.5ml TRE-Trizol（广州博理生物科技公司）试剂，剧烈振荡15秒，冰浴5分钟。10000rpm离心5min，吸取上清至2ml离心管，加入0.3ml氯仿，剧烈振荡15秒，冰浴10分钟。12000rpm离心15分钟，吸取上层水相（≤0.7ml）至1.5ml离心管，依次加入0.4ml异丙醇和0.4ml Buffer A（1.2M NaCl，80mM柠檬酸钠，用DEPC处理水配制），立即混匀，室温下放置10分钟。12000rpm离心10分钟，弃上清，用75%乙醇（DEPC处理水配制）洗涤沉淀。7500rpm离心5分钟，弃上清，再短暂离心3秒，用枪头吸尽上清。室温下风干沉淀5分钟，加入30～35μl DEPC处理水，60℃温浴5分钟，溶解沉淀，获得黄花苜蓿总RNA。取1～3μl总RNA进行甲醛变性胶电泳，检查RNA的完整性，并用紫外分光光度计测260nm与280nm的光吸收值，确定总RNA的浓度与纯度。 

逆转录制得黄花苜蓿的cDNA模板：以上述得到的黄花苜蓿总RNA为模板，以Oligo（dT）₁₈为反转录引物，用M-MLV逆转录酶试剂盒（Promega公司），参照说明书的方法合成cDNA第一链。逆转录反应体系为：2μg总RNA，1μl1.0μM Oligo(dT)₁₈，加入无菌的无离子水，使反应液总体积达到10μl，混匀，70℃保温5min后，迅速放入碎冰浴5分钟；继续向反应液依次加入以下成分：5μl M-MLV5×Reaction Buffer，1.25μl2.5mM dNTPs，0.5μl RNase抑制剂（25U），1μl M-MLV逆转录酶(200U)，加无菌的无离子水至终体积为25μl。轻弹管壁，混匀，短暂离心。于42℃保温，反应60分钟，再在70℃下保温10分钟，使酶失活。反应结束后，制备获得黄花苜蓿的cDNA模板，于-20℃保存备用。 

二、设计扩增MfEF2基因引物 

根据本实验室构建的黄花苜蓿冷诱导基因cDNA消减文库中发现的MfEF2基因cDNA片段的序列，在NCBI上进行BLASTn比对EST序列，并下载相应核苷酸序列一致性最高的序列，利用DNAStar软件的Seqman工具进行序列拼接，如此反复直到拼接得到该基因的全长序列。通过DNAstar软件分析以上全长序列的开放阅读框，根据开放阅读框两端的序列设计引物： 

MfEF2扩增上游引物RT77：CTAGTCAAGATGGTGAAGTTCACAG 

MfEF2扩增下游引物RT78：CAGTTTTCATAACAGCCAAGTACAT 

三、扩增获得MfEF2基因并构建载体 

PCR扩增：以步骤一得到的cDNA第一链为模板和步骤二设计的引物RT77和RT78进行PCR扩增。PCR反应体系为：KOD-Plus DNA聚合酶（TOYOBO公司，1U/μl）1μl、10×buffer5μl，2.5mM dNTPs5μl、MgSO₄（25mmol·L^-1）2μl、10μM上游引物RT771.5μl、10μM下游引物RT781.5μl、第一链cDNA2μl、无菌的无离子水32μl。混匀后按下列程序进行PCR反应：94℃3分钟，94℃变性0.5分钟，55℃退火1分钟，68℃延伸1.5分钟，35个循环后，68℃延伸1.5-2分钟。以0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 

PCR产物回收与末端加A：用PCR产物回收试剂盒回收上述获得的PCR产物，进一步通过Taq酶催化的反应进行末端加A，反应体系如下：2μl10×buffer，1μl4mM dATP，11μg PCR回收片段，0.1μl Taq DNA聚合酶，加入无菌的去离子水至总体积为20μl，70℃反应20分钟，即对MfEF2基因片段进行了末端加A。 

末端加A的MfEF2基因片段与T载体的连接：用PCR产物回收试剂盒回收上述获得末端加了A的MfEF2基因片段。用T4DNA连接酶（TaKaRa公司）将PCR回收片段与pMD20T-vector（TaKaRa公司）进行连接，反应体系如下：1μl10×T4连接酶缓冲液，回收的目的片段60ng，1μl T4连接酶(350U/μl)，2μlpMD20T-vector载体（10ng），加无菌水至总体积为10μl，16℃连接过夜。 

大肠杆菌感受态细胞的制备：用接种环取保存于-80℃超低温冰箱的大肠杆菌DH10B菌液，在SOB固体培养基上划板，于37℃培养箱内培养过夜；挑取大肠杆菌DH10B单菌落接种于1ml的SOB液体培养基中，在37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养约6h，接种于200ml SOB液体培养基中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养至OD₅₅₀＝0.6～0.8。以2500rpm离心10分钟收集菌体，加入预冷的10％甘油洗涤，离心收集细菌。重复用10％甘油洗涤，离心收集细菌。最后将细菌分装，于－70℃保存备用。 

连接产物电激转化大肠杆菌：将上述MfEF2基因片段与T载体的连接产物在1/3的TE（1M NaCl，10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA）中透析30分钟。取20μl大肠杆菌感受态细胞至电极杯（孔径1mm），加入1μl经过透析的连接产物，用电激仪（MicroPulser，Bio-RAD公司）电激转化。电激参数为：电阻200Ω，1800V，25μF。电激后的菌体转入1ml SOC液体中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养1小时。取100μl菌液涂布于含IPTG和X-gal的LB固体（含100μg/mL Amp）培养基上，于37℃培养箱内倒置培养过夜。 

重组质粒的筛选、纯化及测序：呈蓝斑的菌落不含插入片段，仅挑取呈白斑的菌落，做菌落PCR检测。挑取PCR阳性菌落，接种于2ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养过夜。吸取2ml菌液，用质粒DNA纯化试剂盒（Qiagen公司）提质粒，4℃保存备用。对获得的质粒用XbaⅠ/BamHⅠ双酶切，电泳检测插入片段的大小，进一步确定阳性克隆。将纯化的重组质粒（命名为pGM-MfEF2），测序。用Omiga2.0软件对测序结果进行分析，除去两端的T载体序列，从而得到PCR扩增产物的序列如下： 

CAGGGATGGGTACGAACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCGATTCTAGTCAAGATGGTGAAGTTCACAGCTGATGAGTTACGTCGTATTATGGACTACAAGCACAACATTCGTAATATGTCTGTCATTGCTCATGTTGACCACGGAAAATCAACTCTAACCGACTCTCTAGTCGCTGCTGCGGGAATTATTGCCCAGGAAGTTGCAGGTGATGTCCGTATGACTGACACCCGTGCTGATGAAGCTGAGCGTGGTATTACAATCAAGTCTACCGGTATCTCACTCTACTATGAAATGACTGATGAATCTCTCAAGAGGTTCAAGGGGGAGCGTAATGGAAATGAGTATCTCATTAATCTCATTGATTCCCCTGGGCACGTCGACTTCTCATCTGAGGTTACTGCTGCACTCCGTATTACTGATGGAGCACTTGTGGTAGTTGACTGTGTGGAAGGTGTATGTGTCCAAACTGAAACTGTGCTGCGACAAGCTCTTGGAGAAAGGATTAGGCCTGTTCTTACAGTTAATAAGATGGACAGGTGCTTCCTTGAGCTCCAGGTTGATGGAGAGGAGGCATACCAGACCTTTTCAAGGGTGATTGAGAATGCTAATGTGATTATGGCTACATATGAAGATCCACTTCTTGGTGATGTTATGGTGTATCCAGAGAAAGGAACAGTTGCTTTTTCTGCTGGTTTGCATGGTTGGGCTTTTACTCTGACCAACTTTGCAAAAATGTATGCCTCAAAATTTGGCGTTGACGAGTCCAAGATGATGGAGAGGCTCTGGGGTGAAAATTTCTTTGATCCTGCCACAAAAAAATGGACCACCAAGAATACTGGTTCAGCTTCGTGCAAGCGTGGGTTTGTTCAGTTCTGTTATGAGCCTATCAAGCAGATCATCAACACTTGTATGAATGATCAGAAGGATAAGTTGTGGCCTATGCTCACAAAGCTAGGGGTCACCATGAAGTCTGATGAGAAGGACCTGATGGGTAAGCCATTGATGAAACGTGTTATGCAAACCTGGTTGCCAGCAAGTACTGCCCTACTAGAAATGATGATCTTTCATCTTCCCTCACCACATACTGCCCAGAGGTACCGTGTTGAGAATTTGTATGAGGGCCCCCTTGACGATCAATATGCAAATGCTATCAGAAACTGTGATCCTGAAGGACCTCTGATGCTTTATGTGTCAAAGATGATTCCAGCATCTGATAAAGGAAGGTTTTTTGCTTTTGGCCGTGTGTTTGCCGGTAAGGTTTCCACAGGTTTGAAGGTCAGAATTATGGGACCAAATTTTGTCCCTGGAGAGAAGAAAGATCTGTACGTGAAAAGTGTCCAGAGAACTGTTATTTGGATGGGAAAGAGACAGGAGACTGTTGAGGATGTGCCTTGTGGTAACACTGTTGCTTTGGTTGGTTTGGATCAATTTATTACAAAGAATGCTACATTGACAAATGAGAAGGAAGTTGATGCCCACCCTATCCGAGCTATGAAGTTTTCCGTCTCCCCTGTTGTGCGTGTTGCTGTTCAGTGCAAGGTTGCTTCAGATCTTCCCAAGCTTGTTGAAGGTCTCAAACGTTTGGCTAAGTCAGATCCTATGGTTGTTTGTACTATTGAGGAGTCTGGGGAACACATTGTTGCTGGTGCAGGAGAGCTTCATCTTGAGATCTGTTTGAAAGATTTGCAGGATGATTTCATGGGTGGTGCTGAGATTATTAAATCTGACCCTGTTGTGTCATTCAGGGAGACTGTTCTTGATAGATCAATCCGCACAGTGATGAGTAAATCACCCAACAAGCACAACCGGCTGTACATGGAAGCAAGACCATTGGAGGATGGACTTGCAGAGGCCATTGATGAGGGCACAATAGGACCAAGGGATGATCCCAAGAATCGTTCTAAGATCTTGTCCGAACAGTATGGTTGGGACAAGGATCTTGCCAAGAAAATTTGGTGTTTTGGCCCTGAGACCACCGGGCCCAACATGGTGGTTGATATGTGTAAGGGAGTTCAGTATTTGAATGAAATCAAGGATTCCGTGGTTGCTGGATTCCAGTGGGCATCAAAAGAAGGTGTTTTGTCGGAAGAAAACATGAGAGGCATCTGCTTTGAAGTATGTGATGTTGTCCTGCACACTGATGCTATCCACAGAGGAGGTGGTCAGATCATTCCTACTGCTAGGAGGGTCTTCTATGCCTCACAGCTCACAGCCAAACCCAGGCTTCTGGAGCCTGTTTACATGGTGGAAATCCAAGCTCCTGAGCAAGCTCTTGGTGGTATCTACAGTGTTCTGAATCAGAAACGTGGGCACGTTTTTGAAGAAATGCAGAGGCCCGGTACCCCACTTTACAACATCAAAGCATACCTCCCTGTCATTGAGTCCTTTGGATTTTCTAGTCAGTTGAGAGCTGCAACATCTGGGCAGGCTTTCCCCCAGTGTGTCTTTGATCATTGGGACACCATGACCTCAGATCCTTTGGAGGCTGGATCACAAGCTGCACAGCTTGTTATGGACATCCGCAAGAGGAAGGGACTCAAGGAACAAATGACTCCCCTTTCTGAGTTTGAAGACAAGCTTTAAGTTATTTCTGCAATTTATATTTATGTACTTGGCTGTTATGAAAACTGAAATCCATATGACTAGTAGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTTCCCCTATAGGTCACCCCTATATTTGCTGCATGCC 

测序结果在NCBI中进行序列比对，证明所扩增出的PCR产物为MfEF2；用 Omiga2.0分析软件分析所扩增的PCR产物序列，获得了MfEF2基因的开放阅读框架（ORF）序列，如上述测序序列中下划线标注部分。编码所述的黄花苜蓿延伸因子2的基因由2731个碱基组成，其中MfEF2的蛋白质编码区（Sequence coding for amino acids in protein，CDs）由65位～2596位的2532个碱基组成，编码843个氨基酸。 

实验结果：经过菌落PCR分析，从白色菌落扩增出与预期片段长度一致的PCR片段（图2），测序后在NCBI进行序列比对，证明所扩增出的PCR产物为MfEF2基因。 

实施例2MfEF2植物表达载体pBI-MfEF2的构建 

质粒pGM-MfEF2与载体pBI121双酶切：对重组质粒pGM-MfEF2和pBI-121表达质粒分别用XbaⅠ和BamHⅠ进行双酶切。酶切体系及方法参考TaKaRa公司商品酶的说明书。反应体系（50μl）：20μl pGM-MfEF2（40ng/l），2μl10×缓冲液，2μl限制性内切酶XbaⅠ（10U/μl）和24μl无菌的去离子水，混匀后，于37℃酶切2h；再加入2μl限制性内切酶BamHⅠ（15U/μL），30℃酶切过夜。反应结束后，于65℃保温15分钟，使限制性内切酶失活，冰浴冷却。用同样的方法对双元表达质粒pBI-121进行双酶切。采用DNA凝胶回收试剂盒纯化、回收经过双酶切的MfEF2片段和pBI121片段。 

构建植物表达载体pBI-MfEF2：用T4DNA连接酶（TaKaRa公司）连接双酶切的MfEF2片段和pBI121片段，连接反应液包括：4.5μl MfEF2回收产物（30ng/μl），4μl pBI-121酶切回收产物（30ng/μl），1μl10×T4DNA连接酶缓冲液，0.5μl T4DNA连接酶（350U/μl），反应液总体积为10μl。在16℃连接过夜。采用实施例1中的方法和过程，将连接液转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，在含50mg/l卡那霉素的LB培养基平板上筛选重组子。 

PCR检测：从生长出来的菌落提取质粒，用实施例1中所用的PCR的条件进行PCR反应，检测重组质粒上是否含有MfEF2插入片段。PCR采用下述引物进行检测： 

pBI-MfEF2检测上游引物ZG13：CTCGGATTCCATTGCC CAGCT 

pBI-MfEF2检测下游引物RT78：CAGTTTTCATAACAGCCAAGTACAT 

ZG13是根据插入片段上游CaMV35S序列设计的，这样使得PCR产物含有部分启动子序列和EF2的开放阅读框，其长度将大于EF2。将PCR产物点样于1%的琼脂糖凝胶进行观察，从而鉴定是否成功构建了植物表达载体pBI-MfEF2。 

实验结果：对本实施例获得的重组质粒进行了PCR鉴定，电泳后显示，能扩增出预期的2.8kb的MfEF2片段(图3)。结果表明，MfEF2基因已成功插入到表达质粒pBI121的多克隆位点，获得了MfEF2基因的植物表达载体，命名为pBI-MfEF2，pBI-MfEF2表达载体的表达框示意图如图1。 

实施例3MfEF2基因受低温诱导的表达情况 

一、获得逆境条件下的黄花苜蓿模板 

材料和处理：将苗龄8-10周的黄花苜蓿植株放入温度为5℃的人工气候箱（光照强度为200μmol m^-2s^-1）内,光照和黑暗时间均设为12小时光照。连续处理4天，进行低温处理。 

总RNA的提取：采用实施例1中提取总RNA的方法，在低温逆境处理一定时间后，取成熟叶片，加入液氮磨碎样品，用TRE-Trizol试剂提取叶片的总RNA，用分光光度计测定总RNA的浓度。 

cDNA第一链的合成：以上述制备的黄花苜蓿RNA为模板，采用PrimeScript^TMRT reagent Kit（TaKaRa公司）反转录合成cDNA第一链。10μl的反转录体系含：2μl的5×PrimeScript buffer，0.5μl的PrimeScriptRT Enzyme MixⅠ，0.5μl Oligo dT primer（50mμM），0.5μl总RNA（50ng）作为模板，用不含RNase的蒸馏水补至总体积10μl。在37℃条件下反应45分钟，然后于85℃终止反应10分钟，获得cDNA模板。 

二、设计特异检测引物 

根据黄花苜蓿MfEF2和β-actin基因的cDNA序列，用Beacon Designer7.0软件设计引物： 

MfEF2基因检测上游引物ZG1753：GCACTCCGTATTACTGATGG 

MfEF2基因检测下游引物ZG1754：TCTGGTATGCCTCCTCTC 

β-actin基因检测上游引物ZG1613：ATTCACGAGACCACCTAC 

β-actin基因检测下游引物ZG1614：GAGCCACAACCTTAATCTTC 

三、定量PCR检测表达差异 

将实施例3中步骤一获得的cDNA模板稀释50倍，用于定量PCR的模板。反应体系为10μL：SYBR Premix Ex Taq（2×）5μL，上游和下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，无菌水3μL。使用仪器为Bio-Rad公司生产的MiniOption Real-Time PCR System，PCR反应条件设置为：95℃10秒钟；94℃5秒钟，57℃25秒钟，40个循环。以不加cDNA模板作为阴性对照，每个样品设置 3个重复，以持家基因β-actin作为定内参基因。反应结束后，进行溶解曲线分析，PCR扩增效率在95%以上。利用Bio-Rad CFX Manager(version1.6)软件自动计算基因的相对表达量。 

实时定量PCR的结果显示，MfEF2表达在低温处理24小时至96小时，表达量最高（图4）。结果表明，MfEF2的表达受低温胁迫的诱导。 

实施例4转基因烟草的产生及分子检测 

一、转基因烟草的产生 

1.根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备 

参考J.萨姆布鲁克（2002）的方法并加以改进，取EHA105菌种于MYB平板上划线，28℃培养48小时，挑取单菌落接种于50mL液体SOC中，28℃培养过夜，吸取0.5mL菌液，接种于500mL液体SOC中，28℃培养6～8h，至OD₆₀₀约为0.6，冰浴冷却10min，倒入经灭菌的200mL离心管中，平衡后4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体，倒去SOC，倒置于纸巾上，控干水分，加入50mL10%甘油，于冰上摇动，悬浮菌体，4℃，4000rpm，离心15min，收集菌体，弃10%甘油，重复洗涤一次，加入2mL10%甘油，悬浮菌体，分装，20～25μL/管，制备获得根癌农杆菌EHA105感受态细胞，加液氮速冻后于-80℃冰箱保存。 

2.将pBI-MfEF2导入根癌农杆菌EHA105 

将根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105感受态细胞置于冰上解冻，将0.2cm内径的电击杯置于冰上预冷。在超净工作台内，分别将1.5μlpBI-MfEF2质粒（20ng/μl）加至20μl解冻的感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴1分钟后，转移至电击杯中，置于电击仪（MicroPulser，Bio-RAD公司）的电极间，选定程序Agr，进行电击。电击结束后，在超净工作台内，迅速将1ml YEB液体培养基倒入电击杯，再用移液枪转移至摇菌管中，28℃轻柔振荡培养2小时。吸取0.3ml菌液，涂布在YEB平板（含35mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素）上。28℃培养箱内倒置培养48小时。 

3.含表达载体pBI-MfEF2农杆菌阳性菌落的鉴定 

挑取平板上的单菌落，采用实施例1中的方法，进行菌落PCR检测，并做好标记。进一步挑取PCR阳性菌落至3ml YEB液体培养基（含35mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素）中，28℃振荡培养40小时。取2ml菌液用碱裂解法抽提质粒，采用实施例2中的方法，进行酶切检测，确定阳性克隆中含有植物表达载体 pBI-MfEF2。取0.8ml农杆菌液，加0.2ml80%甘油，混匀后保存于-80超低温冰箱备用。 

4.转基因烟草植株的获得 

（1）烟草无菌苗的获得 

烟草（Nicotiana tabacum L.）种子经70％的酒精和0.1％升汞消毒后，接种于培养基MS上，28℃光照培养约1个月。待展开5-7片真叶时，即可用于农杆菌转化。 

（2）农杆菌的活化与悬浮 

取含有表达载体pBI-MfEF2的农杆菌EHA105贮存液，在YEB平板（含35mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素）上划线，28℃培养。挑分离良好的单菌落，接种于2ml液体YEB（含35mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素）中，28℃振荡暗培养24-48小时。吸取菌液20-50μl，涂布于含同样抗生素的YEB平板上，28℃倒置暗培养24-36小时。将新长出的农杆菌刮下来，用MS液体培养基悬浮稀释，使OD₆₀₀为0.8-1.0。 

（3）侵染、共培养及抗生素筛选 

取烟草无菌苗的叶片，用剪刀剪成1cm²大小的叶盘，并用尖嘴镊子在表面戳小孔，制造伤口，转入农杆菌菌液中浸泡，其间不时摇匀。浸泡15min后，用无菌吸水纸吸去叶盘表面多余菌液，稍吹干，置于垫了滤纸的共培养基（MS基本培养基添加0.1mg/l的萘乙酸和1mg/l的苄基腺嘌呤，pH5.8）上，28℃黑暗共培养2-3天。将经过共培养的材料转移至选择培养基（MS基本培养基添加0.1mg/l萘乙酸，1mg/l苄基腺嘌呤，250mg/l头孢霉素和100mg/l卡那霉素，pH5.8），28℃光照培养。20d继代一次。将成功分化的苗转至生根培养基（MS基本培养基添加250mg/l头孢霉素和100mg/l卡那霉素，pH5.8）上生根，待长出5-7片真叶时，开瓶炼苗，移栽到土中。 

（4）转基因烟草的生长 

将移栽的转基因烟草幼苗培养在温室内，初期给予一定的遮阴，存活后的幼苗逐渐转移到自然光照下生长。在生长过程中，定期浇水、施肥。采用自交收种，即在花瓣张开前，对花序套袋；在果实形成后，再除去套袋。果实成熟后收种。 

二转基因植物的PCR检测 

1.微量法快速提取DNA 

用1.5ml离心管盖取转基因烟草及其野生型植株的叶圆片，加入400μl预热到80℃的提取液（200mM Tris-HCl pH8.0，250mM/l NaCl，25mM EDTA，0.5 ％SDS），用小研锤在1.5ml离心管中充分研磨，70℃干热浴10分钟后，移到冰浴放置2分钟。13000rpm离心1分钟，取300μl上清液至新的离心管中，加等量异丙醇，混匀，室温静置5分钟。13000rpm离心2分钟，弃净上清液，将DNA沉淀风干后溶于50μl TE溶液（1M NaCl，10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA），保存于-20℃，备用。 

2.PCR检测 

设计引物： 

MfEF2基因快速检测上游引物ZG13：CTCGGATTCCATTGCC CAGCT 

MfEF2基因快速检测下游引物ZG402：TGCCTCCTCTCCATCAACC 

ZG13是根据插入片段上游CaMV35S序列设计的，ZG402是根据EF2的开放阅读框序列设计的，这样使得PCR产物含有部分启动子序列和部分EF2的开放阅读框，长度700bp，以上述提取的DNA为模板，进行PCR扩增，并以表达载体pBI-MfEF2为阳性对照。反应体系（20μl）为：DNA模板1μL，2.5mM dNTPs1.6μl，10μM ZG13引物0.4μl，10μM ZG402引物0.4μl，无菌去离子水14μl，10×PCR缓冲液(含15mM MgSO₄)2μl，TaqDNA聚合酶0.1μl。PCR反应程序：94℃2分钟；94℃0.5分钟，53℃0.5分钟，72℃1.5分钟，35个循环；72℃5分钟。以1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。 

三转基因烟草的Southern杂交 

1.基因组DNA的提取 

采用CTAB法提取DNA。具体方法如下：取1g烟草叶片，用液氮快速研磨成粉末，转移至50ml离心管，立即加入6ml预热到70℃的1.5×CTAB提取液（1.5％CTAB，75mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl，15mM EDTA），涡漩振荡10秒钟，混匀。70℃水浴1小时，间断混匀。水浴结束后，加入5ml氯仿，旋紧管盖，上下颠倒混匀10分钟，5000rpm离心15分钟。小心吸取上清至新的50ml离心管，并记录体积，加入1/10体积的10％CTAB溶液，摇匀。加入4/5体积的氯仿，上下颠倒混匀10分钟。5000rpm离心15分钟。小心吸取上清至50ml离心管，并记录体积，加入等量的沉淀液（1％CTAB，50mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTA），轻柔上下颠倒混匀，室温放置15分钟，沉淀DNA。5000rpm离心10分钟，小心倒掉上清，用移液枪吸尽上清。向沉淀加入2ml高盐TE（1MNaCl，10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA）和5μl10mg/ml的RNAase（用10mM Tris-HCl pH7.5和15mM NaCl溶液配制，经过100℃水浴15分钟灭活DNA酶），在55℃摇床中轻摇至沉淀完全溶解（30-40分钟）。加入2倍体积的无水乙醇， 轻柔地上下颠倒混匀。用枪头钩出絮状DNA，在70％乙醇中漂洗，然后移至1.5ml离心管。短暂离心，吸尽上清，适当风干沉淀，用0.1-0.2mL TE（10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA）溶解沉淀。取2μl稀释10倍的DNA溶液，用0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的质量，测OD_260nm和OD_280nm，确定DNA的纯度和浓度。 

2.DNA的酶切、转膜 

取15μg DNA，加入用无菌的去离子水至总体积33μl，3μl EcoRI，4μl10×酶切缓冲液，37℃酶切过夜。加入点样缓冲液，点样到0.8％琼脂糖凝胶，以3-4V/cm电泳1-1.5h，直至指示染料溴酚蓝泳至凝胶长度2/3距离处。 

用毛细管法将DNA转移至Hybond XL尼龙膜（美国Amersham公司）上。具体方法如下：将胶平放在用NaOH浸透的滤纸上，滤纸两端浸入转移池的0.4mol/LNaOH溶液中，赶气泡。 

转膜：电泳结束后，用无菌去离子水洗凝胶两次，每次10min，再用10×SSC溶液洗10min。将凝胶平放在转移桥的滤纸上，赶走气泡。将一张大小与凝胶相近的Hybond N⁺（Amersham公司）尼龙膜铺在胶上，赶气泡。在尼龙膜上铺2张与尼龙膜大小一样的、用0.4mol/L NaOH充分润湿的滤纸，用保鲜膜封起尼龙膜的四周，以防转移系统短路。在滤纸上铺上约7cm厚的吸水纸，并压上约200g的重物，持续转膜10h以上。转移结束后，用2×SSC（含0.5％SDS；20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，pH7.0）简单漂洗后，再用煮沸的0.5×SSC（含0.5％SDS）溶液浸泡几分钟。自然风干约5分钟，用保鲜膜包好，做好标记，保存于4℃备用。 

3.标记探针 

用PCR扩增完整的MfEF2开放阅读框序列，用PCR产物纯化试剂盒（Qiagen公司）回收，用电泳法对回收的PCR产物浓度进行定量。采用随机引物标记试剂盒（TaKaRa）来标记探针。参照产品说明书的方法，向1.5ml离心管加入纯化的PCR产物50ng，随机引物2μl，加水体积至14μL。95℃变性3分钟，冰浴5分钟后，再向离心管中加入10×反应缓冲液和dNTP混合物各2.5μl，最后加入1μl的DNA聚合酶Klenow片段，混匀。在同位素操作室工作台内加入5μl［α-³²P］dCTP，37℃反应20分钟，标记探针。反应结束后，加入等体积的0.8M NaOH溶液，是探针分子变性，用于杂交分析。 

4.杂交 

将尼龙膜放入杂交管中，加入适量预杂交液（每1cm²膜面积加入0.1ml杂 交液），42℃预杂交过夜。更换杂交液，把标记好的探针加入杂交管中，42℃杂交16-24h。杂交完毕，倒出杂交液，用2×SSPE（含0.5%SDS）在42℃和65℃各洗一次，每次15分钟，第三次用0.2×SSPE（含0.2%SDS）在65℃洗15分钟。洗膜结束后，用计数器检测放射性强度，用保鲜膜包膜，用分子磷屏压膜1天，用FX自动成像系统（BIO-RAD公司）扫描，分析杂交结果。 

四转基因烟草的Northern杂交 

1.RNA变性电泳与转膜 

取20μg的总RNA，用常规的甲醛变性电泳法将不同大小的RNA分子分离开，用毛细管法将RNA分子转到Hybond N⁺尼龙膜（生产商：美国Amersham公司）上，进行Northern杂交，分析MfEF2基因的表达。杂交用的探针是以MfEF2基因为模板，加入[α-³²P]dCTP，用随机引物DNA标记试剂盒（TaKaRa）进行标记。 

（1）制备甲醛变性凝胶：称取1.2g琼脂糖，加热溶于85ml DEPC处理过的水中，冷却后加入10ml10×MOP溶液、5ml37%甲醛，充分混匀后，制备成1.2%的变性凝胶。 

（2）RNA样品制备：取30μg RNA样品，依次加入2μl10×MOPS溶液，2.5μl37%甲醛，7.5μl甲酰胺，加DEPC处理水，使得总体积至20μl，混匀后于65℃保温10分钟，使RNA变性。然后置于冰上冷却5分钟，加入电泳载样缓冲液。 

（3）电泳：将各个变性的RNA样品上样至变性凝胶上，以3-4V/cm电泳1-1.5h，直至指示染料溴酚蓝泳至凝胶长度2/3距离处。 

（4）转膜：电泳结束后，用无菌去离子水洗凝胶两次，每次10min，再用10×SSC溶液洗10min。将凝胶平放在转移桥的滤纸上，赶走气泡。将一张大小与凝胶相近的Hybond N⁺（Amersham公司）尼龙膜铺在胶上，赶气泡。在尼龙膜上铺2张与尼龙膜大小一样的、用10×SSC充分润湿的滤纸，用保鲜膜封起尼龙膜的四周，以防转移系统短路。在滤纸上铺上约7cm厚的吸水纸，并压上约200g的重物，持续转膜10h以上。 

（5）固定：完成RNA转移后，将尼龙膜放在DEPC处理水和2×SSC溶液中先后各漂洗15分钟，将尼龙膜放置干净的滤纸上，置于紫外交联仪内将有RNA的面朝上进行紫外交联，采用的紫外光总能量为800KJ。 

2.探针制备与标记 

完全参照实施例4中步骤三中描述的方法进行。 

3.杂交 

完全参照实施例4中步骤三中描述的方法进行。用FX自动成像系统 （BIO-RAD公司）扫描，分析杂交结果。 

实验结果：以引物ZG13和ZG402来检测转基因烟草，阳性植株能扩出700bp的特异带，与以植物表达载体pBI-MfEF2为模板扩出的特异带大小一致，而野生型对照植物不能扩出该特异带（图5），证明MfEF2基因已导入到转基因烟草中。 

Southern杂交结果显示，在野生型烟草中没有MfEF2基因的特异杂交信号，转基因烟草株系中有MfEF2基因的特异杂交信号，表明有MfEF2基因已整合到转基因烟草的基因组中（图6a）。 

Northern结果显示，在野生型烟草中没有MfEF2基因的特异杂交信号，转基因烟草株系中有MfEF2基因的特异杂交信号，表明MfEF2基因能在转基因烟草中表达（图6b）。 

实施例5转基因烟草的抗冻性和抗冷性鉴定 

一抗冻性测定 

纯合的转基因烟草T2代植株及其野生型植株幼苗在温室内生长8周后，移到人工气候箱（光照强度为500μmol m^-2s^-1）内，人工气候箱在5小时内逐步从30℃降低到-3℃，此后，人工气候箱内温度维持在-3℃，当野生型植株表现出明显萎焉时，将植物材料从人工气候箱移到常温下，2天后统计植株存活率，评价抗冻性。 

试验结果显示，冻处理后，野生型烟草植株存活率只有14%，而3个转基因株系有90%以上的存活率（图7a,b），表明转基因烟草提高了抗冻性。 

二抗冷性测定 

低温处理：取温室内生长12周的转基因烟草及其野生型植株，移到温度为3℃的人工气候箱（光照强度500μmol m^-2s^-1）内，人工气候箱每天光照和黑暗时间各为12小时。低温处理4天。 

相对电导率测定：每份材料取5个直径为1cm的叶圆片，放入含20ml去离子水的三角瓶内，在摇床上低速振荡1小时后，用电导仪测定溶液电导值（C1）；将三角瓶移到沸水浴中保温20分钟，冷却至室温，再次用电导仪测定溶液电导值（C2）。通过公式（C1/C2)×100计算相对电导率。每个株系植株共测定5个单株，计算平均值。 

在冷处理后，转基因株系叶片的相对电导率明显低于野生型烟草（图8），说明其受低温伤害较轻。结果表明转基因烟草的抗冷性高于野生型烟草。 

上述结果证明，MfEF2基因的过量表达能提高转基因植物的抗寒性。 

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。