一种硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种的制备方法

摘要

本发明提供了一种硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种的制备方法。利用硬头鳟与溪红点鲑杂交得到受精卵，再通过6-DMAP溶液浸泡处理受精卵，再孵化培育，产生杂交三倍体苗种。本发明方法孵化期间受精卵发眼率为77%，苗种孵化率达到90%以上，得到的仔鱼经流式细胞仪检测，三倍体率达到90%以上。该方法可规模化生产硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种，从而提高鲑鳟鱼的生长速度及抗病能力，为养殖户提高经济效益，具有较好的市场价值。

说明书

技术领域

本发明涉及水产生物育种技术领域，具体地涉及一种硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种的制备方法。

背景技术

鲑鳟鱼是世界目前主要养殖的鱼类之一,由于其自身的品质和对生活环境的特殊要求,决定了它绿色、环保营养食品的性质,因此颇受消费者的青睐。鲑鳟鱼是我国目前主要的冷水性养殖鱼类,随着我国鲑鳟鱼养殖的迅速发展，基础理论研究相对滞后，鲑鳟鱼亲鱼种质退化导致苗种质量退化生产效益下降等问题逐渐突出，从而制约了鲑鳟鱼养殖业的可持续发展。利用现代生物技术，培育生长迅速、个体大、肉质好、抗病能力强的种苗，将成为我国鲑鳟鱼养殖业的持续、稳定、健康发展的必由之路。

杂交能够急剧的动摇遗传的保守性，使杂种的遗传性富于游动性，具有更大的可塑性，从而能迅速和显著地提高杂种的生活力，从而获得杂种优势；杂种能丰富遗传结构，通过杂交将两个以上遗传基础不同的品种或种以上个体的基因自由组合，出现新的遗传类型，继而人们可以选择优良的个体，培育成新品种。

与普通的二倍体鱼类相比，三倍体鱼类具有生长速度快、成活率高、抗病力强、肉质好、安全健康等优点：①三倍体鱼类生长速度比二倍体快30-40%，有利于生产大型个体，可有效的提高群体产量；②鲑科三倍体鱼类不育，避免了性腺发育阶段和产卵季节因能量转移和婚姻色出现而导致的鱼肉品质下降及表观特征变化，避免了其繁殖期生物学死亡，延长养殖周期；③三倍体鱼类对环境没有潜在的威胁，三倍体可减少鱼类的基因混杂，有效控制自然水域中鱼类的过度繁殖，避免养殖品种的退化，保护物种的多样性；④没有外来基因，属于人类可以安全食用的健康食品，比起转基因技术更为人们所接受；⑤三倍体鱼肉质鲜嫩、可食部分高、体形稳定美观、商品价值高。由于三倍体鱼类具有上述优势，因此通过三倍体制备技术获得生长快速、适应性和抗病力强的优质苗种具有巨大的潜力。

自上世纪80年代以来,三倍体鱼类的人工诱导工作取得了长足进展。目前对三倍体苗种制备的研究主要集中在纯种虹鳟鱼的三倍体制备，其方法为热休克法或静水压方法。现有热休克方法制备纯种三倍体虹鳟鱼的技术依赖于精确的温度，温度稍未变换，会导致苗种畸形率高，使培育效果不稳定，始终无法形成规模化生产，其原因为现有的纯种生产三倍体苗种制备技术或无法达到生产要求的三倍体率或无法达到可用于生产的苗种成活率，一直无法实现规模化生产。因此，迫切需要一种技术成熟、效果稳定且能规模化生产的三倍体鱼苗制备技术，提高受精卵的发眼率和苗种三倍体率。

6-二甲基氨基嘌呤（N6-Dimethyladenine,6-DMAP）在多种贝类多倍体诱导中取得了良好效果，但由于鲑鳟鱼对生长环境水质要求较高，特别对化学物质敏感，至今未有6-二甲基氨基嘌呤应用于鲑鳟鱼三倍体或杂交三倍体诱导的成功报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种的制备方法，以克服现有技术的不足。

本发明提供的硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种的制备方法，包括以下步骤：

1）使硬头鳟亲鱼卵子与溪红点鲑亲鱼精子杂交受精；

2）6-二甲基氨基嘌呤处理受精卵；

3）受精卵在养殖用水中孵化。

其中，步骤1）受精温度是6-11℃。

步骤1）硬头鳟亲鱼培养水温为10-13℃，流水池水交换量为2h/次，溪红点鲑亲鱼培育水温为8-10℃，流水池水交换量为4h/次。

所述步骤1）分别将溪红点鲑亲鱼鱼卵和精液取出，精液用孵化用水清洗，方法为精液与孵化用水的体积比为1-1.5：2500-3000，搅拌1-1.5min后倒掉水，同样方法反复冲洗3-5次；按照雄性亲鱼与雌性亲鱼1：2-4的尾数比例进行精子与卵子的受精。

本发明制备方法的步骤2）中，受精卵在受精12-14min后，将受精卵移入170-190mg/L的6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）溶液中浸泡处理。

优选地，受精卵在受精12min后，移入6-二甲基氨基嘌呤溶液中浸泡处理。6-二甲基氨基嘌呤溶液的温度为12-14℃。浸泡时间为14-16min。

将步骤2）浸泡处理的受精卵迅速移入6-11℃孵化水体中孵化48-55天，得到硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体仔鱼。

本发明还提供了6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP)在制备硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种中的应用。

进一步地，采用浓度为170-190mg/L、温度为12-14℃的6-二甲基氨基嘌呤溶液处理硬头鳟与溪红点鲑受精卵。

本发明提供一种硬头鳟与溪红点鲑三倍体苗种的制备方法，具体操作为：选取硬头鳟雌性亲鱼鱼卵和溪红点鲑雄鱼亲鱼精子进行体外受精，7℃条件下鱼卵受精12min后，将受精卵迅速移入浓度为180mg/L、温度为12℃的6-DMAP溶液中浸泡溪红点鲑受精卵15min；之后迅速移入7℃水体中正常孵化50天，得到硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体鱼苗。

本发明制备方法所用的水体均为符合国家渔业水质标准规定的孵化用水。

本发明提供了上述制备方法在溪红点鲑三倍体苗种育种工作中的应用。

本发明意外地发现通过一定浓度、温度的6-二甲基氨基嘌呤溶液处理硬头鳟与溪红点鲑受精卵，能够抑制受精卵第二极体的排出，在此基础上，本发明经过大量实验反复摸索实验条件，实现了规模化制备硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种，应用该方法的受精卵发眼率达到77%，苗种孵化率达到90%以上，苗种三倍体率达到90%以上，该发明方法受精卵发眼率与正常鲑鳟鱼生产相近，三倍体率达到了生产需求，实现了杂交三倍体苗种的规模化生产，得到的硬头鳟与溪红点鲑杂交苗种具有杂交和三倍体优势，在生长速度和抗病能力方面明显优于现有的二倍体虹鳟鱼，具有较好的经济效益和市场价值。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明的硬头鳟亲鱼和溪红点鲑亲鱼为北京市水产科学研究所由北欧玛生物科技有限公司购买的发眼卵培育而成。6-DMAP购自美国SIGMA公司。

实施例1硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种制备方法（1）

采用水流刺激，控制光照，投喂亲鱼强化配合饲料等手段，使硬头鳟亲鱼与溪红点鲑亲鱼同步发育成熟。硬头鳟亲鱼培育水温为10℃，流水池水交换量为2h/次，溪红点鲑亲鱼培育水温为10℃，流水池水交换量为4h/次。

鱼卵采用干法受精。先将发育成熟的硬头鳟雌鱼采用挤压法将鱼卵挤入干净的瓷盆内，每4尾雌鱼为1组，再将2尾雄性溪红点鲑的精液挤入水盆内，水温10℃，立即搅拌均匀，加入精液与孵化用水的体积比为1：2500的孵化用水，轻轻搅拌，1min后将水倒出，反复3次，将精液清洗干净，放置等待处理。

鱼卵受精12min后，将受精卵迅速移入浓度为180mg/L、温度为12℃的6-DMAP溶液中浸泡处理，浸泡15min后，迅速移入7℃孵化水体中正常孵化。

经过50天孵化出鱼苗，期间杂交三倍体受精卵发眼率为82%，苗种孵化率为93%，其苗种经流式细胞仪检测三倍体率为95%的硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种。发眼卵至4月龄阶段三倍体成活率为发眼阶段的76%。采用现有技术中已报道的微卫星分析方法，结果显示制得的杂交三倍体为硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体。

实施例2硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种制备方法（2）

采用水流刺激，控制光照，投喂亲鱼强化配合饲料等手段，使硬头鳟与溪红点鲑亲鱼同步发育成熟。硬头鳟亲鱼培育水温为13℃，流水池水交换量为2h/次，溪红点鲑亲鱼培育水温为8℃，流水池水交换量为4h/次。

鱼卵采用干法受精。先将发育成熟的硬头鳟雌鱼采用挤压法将鱼卵挤入干净的瓷盆内，每4尾雌鱼为1组，再将2尾雄性溪红点鲑的精液挤入水盆内，水温8℃，立即搅拌均匀，加入精液与孵化用水的体积比为1：3000的孵化用水，轻轻搅拌，1.5min后将水倒出，反复3次，将精液清洗干净，放置等待处理。

鱼卵受精13min后，将受精卵迅速移入浓度为170mg/L、温度为13℃的6-DMAP溶液中浸泡处理，浸泡16min后，迅速移入10℃孵化水体中正常孵化。

经过52天孵化出鱼苗，期间杂交三倍体受精卵发眼率为78%，苗种孵化率为89%，其苗种经流式细胞仪检测三倍体率为93%的硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种。发眼卵至4月龄阶段三倍体成活率为发眼阶段的81%。采用现有技术中已报道的微卫星分析方法，结果显示制得的杂交三倍体为硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体。

实施例3硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种制备方法（3）

采用水流刺激，控制光照，投喂亲鱼强化配合饲料等手段，使硬头鳟与溪红点鲑亲鱼同步发育成熟。硬头鳟亲鱼培育水温为11℃，流水池水交换量为2h/次，溪红点鲑亲鱼培育水温为9℃，流水池水交换量为4h/次。

鱼卵采用干法受精。先将发育成熟的硬头鳟雌鱼采用挤压法将鱼卵挤入干净的瓷盆内，每4尾雌鱼为1组，再将2尾雄性溪红点鲑的精液挤入水盆内，水温9℃，立即搅拌均匀，加入精液与孵化用水的体积比为1.5：3000的孵化用水，轻轻搅拌，1min后将水倒出，反复3次，将精液清洗干净，放置等待处理。

鱼卵受精14min后，将受精卵迅速移入浓度为190mg/L、温度为12℃的6-DMAP溶液中浸泡处理，浸泡15min后，迅速移入8℃孵化水体中正常孵化。

经过48天孵化出鱼苗，期间杂交三倍体受精卵发眼率为75%，苗种孵化率为90%，其苗种经流式细胞仪检测三倍体率为94%的硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种。发眼卵至4月龄阶段三倍体成活率为发眼阶段的77%。采用现有技术中已报道的微卫星分析方法，结果显示制得的杂交三倍体为硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体。

实施例4硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种制备方法（4）

采用水流刺激，控制光照，投喂亲鱼强化配合饲料等手段，使硬头鳟与溪红点鲑亲鱼同步发育成熟。硬头鳟亲鱼培育水温为12℃，流水池水交换量为2h/次，溪红点鲑亲鱼培育水温为8℃，流水池水交换量为4h/次。

鱼卵采用干法受精。先将发育成熟的硬头鳟雌鱼采用挤压法将鱼卵挤入干净的瓷盆内，每4尾雌鱼为1组，再将2尾雄性溪红点鲑的精液挤入水盆内，水温8℃，立即搅拌均匀，加入精液与孵化用水的体积比为1.5：2500的孵化用水，轻轻搅拌，1min后将水倒出，反复5次，将精液清洗干净，放置等待处理。

鱼卵受精12.5min后，将受精卵迅速移入浓度为180mg/L、温度为14℃的6-DMAP溶液中浸泡处理，浸泡14min后，迅速移入7.5℃孵化水体中正常孵化。

经过55天孵化出鱼苗，期间杂交三倍体受精卵发眼率为75%，苗种孵化率为92%，其苗种经流式细胞仪检测三倍体率为94%的硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体苗种。发眼卵至4月龄阶段三倍体成活率为发眼阶段的77%。采用现有技术中已报道的微卫星分析方法，结果显示制得的杂交三倍体为硬头鳟与溪红点鲑杂交三倍体。

实施例5不同浓度6-DMAP溶液对杂交三倍体苗种孵化率和杂交三倍体率的影响

配制好浓度为90、120、150、180、210mg/l温度为12℃的6-DMAP溶液待用。硬头鳟♀×溪红点♂受精后受精卵放置在温度为12.8℃的水体中14min，14min后立即分别放入上述配好的6-DMAP溶液中浸泡，时间为15min，期间不时的搅动受精卵，以使受精卵得以均匀浸泡，15min后移入7℃孵化水体中正常孵化52天。

表1不同浓度6-DMAP溶液处理受精卵对三倍体苗种的影响

实施例66-DMAP溶液（180mg/L、12℃）处理受精卵不同时间对杂交三倍体苗种孵化率和杂交三倍体率的影响

参照实施例1的方法培养硬头鳟与溪红点鲑鱼杂交三倍体苗种，浓度为180mg/L、温度为12℃的6-DMAP溶液处理硬头鳟与溪红点鲑鱼受精卵的处理时间不同，见表2，其他培育条件同实施例1。孵化50天，观察并记录6-DMAP溶液处理受精卵不同时间，对硬头鳟与溪红点鲑鱼杂交三倍体苗种的影响，结果见表2。结果说明，在5-15min范围内，不同处理时间对受精卵发眼率、苗种孵化率没有明显影响，但随着处理时间的增长其三倍体率明显增加；当处理时间到20min时，其受精卵发眼率和孵化率明显降低，但对苗种的三倍体率没有明显的增加，因此选择15min作为180mg/L、温度为12℃的6-DMAP溶液处理硬头鳟与溪红点鲑鱼受精卵的最佳处理时间。