酶法提取狗肾多肽的方法及所得到的狗肾多肽提取物

摘要

本发明提供了一种酶法提取狗肾多肽的方法及所得到的狗肾多肽提取物。所述的方法包括对动物药材狗肾进行酶提取和醇提取的步骤，其中，酶提取步骤：以添加蛋白酶制剂的水溶液作为酶提取液，对绞碎后的狗肾进行浸渍提取，提取条件：30℃～55℃酶解0.5小时～6小时；醇提取步骤：向酶解后的狗肾溶液中按照加入乙醇，配成30％～60％体积浓度的乙醇提取液，50℃～90℃加热回流1小时～5小时；残渣用30％～60％体积浓度的乙醇液再次回流提取1～4小时，合并提取液。利用本发明的方法得到的狗肾多肽提取物有效成分更齐全，相对单纯的乙醇加热回流，提取率提高40％以上，且本发明的提取条件温和，操作简单，成本较低。

说明书

技术领域

本发明方法涉及狗肾深加工技术领域，具体涉及一种利用生物酶酶解动物药材狗肾， 从而提取狗肾中多肽的方法，以及所提取得到的狗肾多肽提取物。

背景技术

狗肾(Penis et Testis Canis)，犬科动物狗Canis familiaris L.(雄性)的干燥阴茎和 睾丸，四季可收，将附着的肉及油脂去净，晾干或焙干即得。别名黄狗肾、广狗肾、狗 鞭、狗宝，为次常用中药，原名牡狗阴茎，“神农本草经”列为下品。狗肾性咸，大热， 主含雄性激素、蛋白质、脂肪等成分，有暖肾，壮阳，益精等的功效，主要用于肾虚阳 痿，遗精，腰膝痿弱无力等症。有研究显示，狗肾提取物能提高卵巢摘除大鼠雌激素活 性以及促进幼鼠子宫、卵巢的发育，这与黄狗肾具有暖肾壮阳等功效相一致。

对狗肾有效成分的提取有传统的水提法、醇提法，也有研究用超临界CO₂萃取，参 见CN102138936A，其中公开了一种黄狗肾提取物及其制备方法，采用醇提取+超临界 CO₂萃取工艺，所得提取液有更好的抗卵巢功能早衰的作用。但此种提取方法工艺繁琐， 且提取成本较高，不利于工业化生产制备。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酶法提取狗肾多肽的方法，以对狗肾多肽进行更充分提 取，提高氨基酸及多肽提取效率。

本发明的另一目的在于提供一种按照所述的方法制备得到的狗肾多肽提取物，该提 取物中含有多种狗肾多肽成分，且保持良好的生物活性。

一方面，本发明提供了一种酶法提取狗肾多肽的方法，其中，是采用了酶工程与传 统中药提取技术的结合，对狗肾进行处理，提取其中的狗肾多肽。

根据本发明的具体实施方案，本发明提供的酶法提取狗肾多肽的方法，包括对动物 药材狗肾进行酶提取和醇提取的步骤，其中：

酶提取步骤：以添加蛋白酶制剂的水溶液作为酶提取液，对绞碎后的狗肾进行浸渍 提取，提取条件：30℃～55℃酶解0.5小时～6小时；

醇提取步骤：向酶解后的狗肾溶液中加入乙醇，配成30％～60％体积浓度的乙醇提取 液，50℃～90℃加热回流1小时～5小时；残渣用30％～60％体积浓度的乙醇液再次50℃～90 ℃加热回流提取1～4小时，合并提取液。

本发明的酶法提取狗肾多肽的方法，在酶提取步骤中，加入了蛋白酶制剂，对动物 药材狗肾进行深加工，使狗肾药材中的蛋白可通过酶制剂的降解，得到分子量较小的多 肽类物质，为之后的制剂开发奠定基础。

根据本发明的具体实施方案，本发明的酶法提取狗肾多肽的方法中，所述蛋白酶制 剂的添加量为药材重量(除特别注明外，本发明中所述药材量均是以狗肾药材干重计) 的0.5％～3％。

根据本发明的具体实施方案，本发明的酶法提取狗肾多肽的方法中，所述蛋白酶为 木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或其混合物。更优选地，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶与胰蛋白酶的 混合物，且所述木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1∶1～2∶1。本发明要求各酶制剂的 规格：蛋白酶活力不低于20万u/g。

根据本发明的具体实施方案，本发明的酶法提取狗肾多肽的方法中，所述酶提取步 骤中，添加酶制剂的水溶液的量为药材量的3～4倍重量。

根据本发明的具体实施方案，本发明的酶法提取狗肾多肽的方法中，所述酶提取步 骤中，优选的酶解条件为：以添加木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或两者混合物的的水溶液作为 酶提取液，对绞碎后的狗肾进行浸渍提取，充分搅拌均匀，30℃～55℃酶解0.5～6小时。

本发明的酶法提取狗肾多肽的方法中，考虑到成份的极性和温度的影响，对酶提取 液进一步采用了两次乙醇加热回流的方法进行循环处理，之后过滤，得提取液。具体地， 本发明在酶解后，不需进行额外的灭酶处理，即可向狗肾酶提取液中加入乙醇配制 30％～60％的乙醇提取液，在醇提加热回流时即会对酶产生灭活。

根据本发明的具体实施方案，本发明的酶法提取狗肾多肽的方法中，所述醇提取步 骤中，两次乙醇提取液的量均可分别为药材量的5～10倍。两次醇提的提取液量可以相同 或不同。两次醇提的提取液的浓度可以相同或不同。两次醇提的温度优选为基本相同。

根据本发明的具体实施方案，本发明的酶法提取狗肾多肽的方法还包括：

对醇提取后得到的醇提取液进行浓缩干燥，得到狗肾多肽浓缩提取液或狗肾多肽提 取浸膏。浓缩过程中回收乙醇，重复利用，以进一步降低成本。

根据本发明的具体实施方案，本发明的酶法提取狗肾多肽的方法中，所述对醇提取 液进行浓缩干燥的操作条件是：50℃～90℃旋蒸法减压浓缩，90℃以下真空干燥。

在本发明的一具体实施方案中，本发明提出的酶法提取狗肾多肽的方法包括有狗肾 药材的酶处理、醇提和浓缩干燥的步骤，具体操作如下：

(1)称取动物药材狗肾，洗涤、泡软，绞碎(通常要求可过80目筛)，向其中加 3～4倍量的蒸馏水，添加蛋白酶制剂，充分搅拌均匀，在30～80℃温度下酶解0.5～6小时；

其中，所述的蛋白酶为所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或其混合物，优选为木 瓜蛋白酶与胰蛋白酶按照1∶1～2∶1的混合物，按狗肾干药材重量的0.5％～3％加至提取 液中，在特定温度下进行恒温酶解，以充分溶解狗肾药材中的蛋白等成分；

(2)将酶解后的狗肾溶液再加入乙醇，配成30％～60％体积浓度的乙醇液，同时优 选控制该乙醇液的量为原狗肾药材干重的5～10倍，50～90℃加热回流1～5小时，残渣再 5～10倍量的30～60％体积浓度的乙醇液再次50～90℃加热回流提取1～4小时，合并两次 醇提取液；

(3)将所得的醇提取液旋蒸法减压浓缩成浓缩提取液，浓缩过程中回收乙醇，浓缩 后可进一步干燥，为避免破坏氨基酸成分，采用90℃以下真空干燥，得黑棕色干膏状物， 即为本发明的狗肾多肽提取物稠膏。

采用比色法测定本发明的方法提取狗肾多肽的得率，与单纯的热醇回流提取法相比 较，本发明的提取率提高40％以上，甚至可提高达60％左右。

另一方面，本发明还提供了按照本发明的酶法提取狗肾多肽的方法制备得到的狗肾 多肽提取物。

根据本发明的具体实施方案，本发明的狗肾多肽提取物，其可以是浓缩提取液的形 式，也可以是进一步干燥后的稠膏(或干膏)的形式。

综上所述，本发明的酶法提取狗肾多肽的方法具有以下优点：

本发明采用生物酶技术与传统的中药提取技术相结合，由于生物酶的高效性和专一 性，溶解狗肾药材中的蛋白，使有效成分更加充分的提取出，再结合采用乙醇加热回流 的方法进行提取，提取出的有效成分更充分全面，提取率高；并且，本发明的方法中， 酶解条件温和，操作简单，主要溶剂为水和乙醇，乙醇提取后可回收利用，从而减少溶 剂消耗，使生产成本降低。

附图说明

图1为本发明的酶法提取狗肾多肽的工艺流程示意图。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现结合附图并参照下列实施例进一步描述本发明。实施例 权用于解释而不以任何方式限制本发明。

实施例1

请参见图1所示的提取工艺流程，本实施例的酶法提取狗肾多肽的工艺主要按照如 下操作进行：

称取动物药材狗肾100g，洗涤、泡软、用绞肉机绞成碎末，过80目不锈钢筛网，加 水400mL，加木瓜蛋白酶(规格20万U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司生产)2g， 胰蛋白酶(规格25万U/g，上海生工生物工程有限公司生产)1g，充分搅拌均匀后，55 ℃温度下酶解2小时，再加200mL95％体积浓度的乙醇，配成乙醇提取液，常压加热90 ℃回流3小时，用100目滤布过滤得提取液，去液面油脂；残渣加800mL60％体积浓度 的乙醇，常压加热沸腾回流2小时，用100目滤布过滤得提取液，将两次醇提液合并后 用旋转蒸发仪(70℃的温度)浓缩成浸膏状，在浓缩过程中回收乙醇，最后将浸膏在60 ℃以下真空干燥，所得黑棕色干膏即为本实施例的狗肾多肽提取物。

用比色法测定本实施例的酶法提取的狗肾多肽，与单纯的热醇回流法相比较，提取 的狗肾多肽得率提高58.5％。

实施例2

称取动物药材狗肾100g，洗涤、泡软、用绞肉机绞成碎末，过80目不锈钢筛网，加 水400mL，加胰蛋白酶(规格25万U/g，上海生工生物工程有限公司生产)3g，充分 搅拌均匀后，55℃温度下酶解2小时，再加200mL95％体积浓度的乙醇配成乙醇提取液， 常压加热90℃回流3小时，用100目滤布过滤得提取液，去液面油脂；残渣加800mL60％ 体积浓度的乙醇，常压加热沸腾回流2小时，用100目滤布过滤得提取液，将两次醇提 液合并后用旋转蒸发仪(70℃的温度)浓缩成浸膏状，在浓缩过程中回收乙醇，最后将 浸膏在60℃以下真空干燥，所得黑棕色干膏即为本实施例的狗肾多肽提取物。

用比色法测定本实施例的酶法提取的狗肾多肽，与单纯的热醇回流法相比较，提取 的狗肾多肽得率提高44.0％。

实施例3

称取动物药材狗肾100g，洗涤、泡软、用绞肉机绞成碎末，过80目不锈钢筛网，加 水400mL，加木瓜蛋白酶(规格20万U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司生产)3g， 充分搅拌均匀后，55℃温度下酶解2小时，再加200mL95％体积浓度的乙醇配成乙醇提 取液，常压加热90℃回流3小时，用100目滤布过滤得提取液，去液面油脂；残渣加 800mL60％体积浓度的乙醇，常压加热沸腾回流2小时，用100目滤布过滤得提取液，将 两次醇提液合并后用旋转蒸发仪(70℃的温度)浓缩成浸膏状，在浓缩过程中回收乙醇， 最后将浸膏在60℃以下真空干燥，所得黑棕色干膏即为本实施例的狗肾多肽提取物。

用比色法测定本实施例的酶法提取的狗肾多肽，与单纯的热醇回流法相比较，提取 的狗肾多肽得率提高47.8％。

实施例4

称取动物药材狗肾100g，洗涤、泡软、用绞肉机绞成碎末，过80目不锈钢筛网，加 水400mL，加木瓜蛋白酶(规格20万U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司生产)1.5g， 胰蛋白酶(规格25万U/g，上海生工生物工程有限公司生产)1.5g，充分搅拌均匀后， 55℃温度下酶解2小时，再加200mL95％体积浓度的乙醇，配成乙醇提取液，常压加热 90℃回流3小时，用100目滤布过滤得提取液，去液面油脂；残渣加800mL60％体积浓 度的乙醇，常压加热沸腾回流2小时，用100目滤布过滤得提取液，将两次醇提液合并 后用旋转蒸发仪(70℃的温度)浓缩成浸膏状，在浓缩过程中回收乙醇，最后将浸膏在 60℃以下真空干燥，所得黑棕色干膏即为本实施例的狗肾多肽提取物。

用比色法测定本实施例的酶法提取的狗肾多肽，与单纯的热醇回流法相比较，提取 的狗肾多肽得率提高60.1％。

比色法比较各实施例提取狗肾效果

一、提取方法

称取动物药材狗肾100g各四份，洗涤、泡软、用绞肉机绞成碎末，分别加水400mL， 分别加入(1)木瓜蛋白酶(规格20万U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司生产)2g， 胰蛋白酶(规格25万U/g，上海生工生物工程有限公司生产)1g；(2)胰蛋白酶(规 格25万U/g，上海生工生物工程有限公司生产)3g；(3)木瓜蛋白酶(规格20万U/ g，广西南宁庞博生物工程有限公司生产)3g；(4)木瓜蛋白酶(规格20万U/g，广 西南宁庞博生物工程有限公司生产)1.5g，胰蛋白酶(规格25万U/g，上海生工生物工 程有限公司生产)1.5g；(5)不加酶制剂；充分搅拌均匀后，55℃温度下酶解2小时， 再加95％乙醇配成6倍量30％乙醇液，加热回流3小时，用100目滤布过滤得提取液， 去液面油脂；残渣加8倍量60％乙醇，加热回流2小时，用100目滤布过滤得提取液， 将两次醇提液合并统一浓缩至100ml，即得待测狗肾提取液。

二、提取液含量测定：

利用考马斯亮兰法测定氨基酸含量的方法，测定上述提取液中氨基酸的含量。

(1)试液配制：

0.1mg/ml的标准牛血清白蛋白溶液：精密称取10mg左右的牛血清白蛋白，另取 87.5mgNaCL，溶于少量蒸馏水中，再稀释定容至100ml，配成100μg/ml的牛血清白蛋白 原液。

考马斯亮兰G-250溶液：精密称取10mg考马斯亮兰，溶于5ml95％乙醇中，并加入 12ml85％浓磷酸，再用水稀释定容至100ml。

供试品溶液配制：分别将狗肾酶法提取液和狗肾空白提取液(100ml)稀释定容至 200ml，再各取1ml于10ml量瓶中，用70％乙醇稀释至刻度，得到狗肾酶法提取样品溶 液和狗肾空白提取样品溶液。

(2)测定：

取2支具塞刻度试管，其中一支加水1ml，考马斯亮兰G-250溶液5ml，摇匀，于 595nm处校零；另外一支加0.1mg/ml的标准牛血清白蛋白溶液0.5ml，考马斯亮兰G-250 溶液5ml，摇匀，于595nm处测光吸收值，作为对照。

另取2支试管分别加0.5ml狗肾酶法提取样品溶液和狗肾空白提取样品溶液，再加 水0.5ml，考马斯亮兰G-250溶液5ml，摇匀，于595nm处测光吸收值。

由比尔-朗伯定律数学表达式：A＝lg(1/T)＝Kbc，

进行计算狗肾中氨基酸含量，其中A为吸光度，T为透射比(是透射光强度比上入射光 强度)，c为吸光物质的浓度，b为吸收层厚度。

三、试验结果

根据比色法测得的狗肾酶法提取液和狗肾空白提取液的比色法结果，及考马斯亮兰 法测得的狗肾酶法提取氨基酸含量和狗肾空白提取氨基酸含量结果作比较，验证酶法提 取狗肾方案的可行性。氨基酸含量结果见表一。

表一、氨基酸含量结果