一种柳枝稷组织培养快速育苗方法

摘要

本发明涉及一种柳枝稷组织培养快速育苗方法，特别是涉及生物能源植物柳枝稷的组织培养技术。本发明按以下工艺步骤进行：种子处理、愈伤组织及芽的诱导、生根培养。本发明采用柳枝稷种子组织培育方法，既可繁殖优良品种，又可从种子实生苗中选取优异的株苗用作遗传转化实验，避免花费大量金钱和精力。本发明方法可行，操作简单，可以为人们进行杂交育种及遗传转化实验，提供了一种有效的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养技术领域，特别是涉及生物能源植物柳枝稷的组织培养技术。

背景技术

柳枝稷（英文名Switchgrass，拉丁名Panicum virgatumlinn），又称“能源草”，因其栽培技术简单，适应性广，防风固沙能力强，耐贫瘠，生物学产量高，被国际上确定为生产染料乙醇的首选生物能源植物，并投入了大量的人力、物力进行研究开发。

利用转基因技术对能源植物进行遗传改良是现代基因工程技术在农业领域运用的新突破。柳枝稷作为一种重要的新型生物能源植物，已经成为基因转化的主要目标之一。其中，采用转基因技术增强柳枝稷的抗逆性，提高光和效率，增加生物学产量，降低木质素含量和提高乙醇产率等方面已成为目前的研究热点并展示出良好的应用前景。

然而，与大多数禾本科植物的组织培养相似，柳枝稷在人工诱导愈伤组织方面也存在着很多困难。因此，加强柳枝稷的通过愈伤组织再生植株的体外繁殖方法的研究就很有必要，对柳枝稷的生物技术研究将起到很大的促进作用。

发明内容

针对上述现有柳枝稷体外繁殖技术存在的缺陷和不足，本发明的目的在于，提供一种柳枝稷的体外繁殖方法，以拓宽柳枝稷组织培养和遗传转化的基因型范围，以实现利用转基因技术对能源植物进行遗传改良，进而实现现代基因工程技术在农业领域应用的新突破。

本发明的目的是这样实现的：一种采用柳枝稷种子组织培养育苗方法，其特种在于它包括以下工艺步骤：

选取100颗饱满的种子(鲜重为0.225 g，选取的种子长度在0.2~0.5 cm，宽度为 0.1~0.2 cm)做为实验使用材料，

   （1）、种子处理

 a 将柳枝稷种子6%(v/v) NaClO中浸泡2 h，按每鲜重为0.225 g柳枝稷种子放入5~10 ml 6%(v/v) NaClO 中，期间不停搅拌；

 b 用蒸馏水清洗3遍后，于暗处静置过夜；

 c 按每鲜重0.225 g柳枝稷种子用5~10 ml 6%(v/v)NaClO浸泡20 min；

 d 将种子清洗后，在无菌条件下，将其接种在愈伤组织诱导培养基上进行愈伤诱导培养。

（2）、愈伤组织及芽的诱导

将接种的培养基转移至培养箱，每天光照14 h，光照强度1400-1500 lux，温度 23 ℃ ±1 ℃ ，无菌条件下培养3~5 d后，种子开始萌动，1周后开始有愈伤形成，并伴随有新芽或者新叶的形成，诱导愈伤选用培养基为 MS基础培养基，补充2,4-D 5 mg/L，6-BA 1.2 mg/L，NAA 1.0 mg/L ，pH为5.8。

（3）、生根培养

4周后，在无菌条件下将新长成的愈伤组织转移至生根培养基上。生根培养基选用MS基础培养基，补充2,4-D 5 mg/L，6-BA 1.2 mg/L，NAA 1.5 mg/L ，pH为5.8。温度 23 ℃±1 ℃，光照 14 h，光强1500~2000 lux，7~10 d 后开始生根，且速度较快，2周后，可将生根的柳枝稷苗进行过渡栽培。

其中，步骤（1）d中愈伤组织诱导培养基为MS基础培养基上添加2,4-D 5~6 mg/L，6-BA 1.2~1.5 mg/L，NAA 1.0~1.2 mg/L，pH为5.8。

本发明的研究方法通过具体的实验进行了描述，相对于现有技术具有如下的优点及结果：

本发明采用柳枝稷种子组织培育方法，既可繁殖优良品种，又可从种子实生苗中选取优异的株苗用作遗传转化实验，避免花费大量金钱和精力。本发明方法可行，操作简单，可以为人们进行杂交育种及遗传转化实验，提供了一种有效的途径。

缩短了柳枝稷的培养周期，利用正交实验，摸索出能诱导柳枝稷愈伤组织形成的最适激素配比，能在较大程度上促进愈伤及生芽、生根的形成，缩短柳枝稷的培养周期。

附图说明

图1为接种到愈伤诱导培养基上3 d后萌动的种子照片；

图2为接种10 d后种子形成愈伤及胚芽的照片；

图3为接种14 d后在培养基上形成大量分化组织的照片；

图4为在生根培养基上形成的生根的柳枝稷的照片；

图5为炼苗的照片。

以上附图为实施例一中的实验效果图。

具体实施方式：

下面结合实例和附图详细说明

6-BA   6-b苄氨基嘌吟(6-BenzylaminoPurine) 

NAA   a-萘乙酸 (1-NaPhthylaceticacid)

2,4-D   2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)

实施例一：

本发明选择柳枝稷种子为外植体，在MS培养基上添加不同的激素配比，诱导愈伤组织，分化及生根诱导。具体生产过程为：

选取外植体

选取成熟饱满的柳枝稷种子100颗（0.225 g）。

愈伤诱导及芽分化

将种子置于培养皿中，采用10 ml 6% (v/v) NaClO进行表面消毒2 h，期间置于摇床上不停搅拌；

弃去次氯酸钠，清洗干净，用蒸馏水浸泡过夜；

用10 ml 6%(v/v)的NaClO消毒20 min，无菌条件下放入培养基中。培养基配方为

MS基础培养基上添加2,4-D 5 mg/L，6-BA 1.2 mg/L，NAA 1.0 mg/L，pH为5.8。

    24℃，在光照培养箱中培养10~15 d诱导获得愈伤组织，继续培养30~40 d时，可从愈伤组织中再生出大量的丛生芽，具体实验效果见图1，图2和图3。

经过统计，100颗柳枝稷成熟种子（0.225 g）诱导芽分化率可达到90%以上。

丛生芽生根培养

转移分化成芽的愈伤组织至生根培养基上进行生根诱导培养，24℃，光照条件下培养20~30 d，诱导生根，得到再生植株（图4）。其中，生根培养基配方为MS基础培养基上添加2,4-D 5 mg/L，6-BA 1.2 mg/L，NAA 1.5 mg/L ，pH为5.8。

移栽至温室

打开培养瓶封口，将再生植株炼苗4~6 d，移栽至温室即可（图5）。

 

实施例二：

本发明选择柳枝稷种子为外植体，在MS培养基上添加不同的激素配比，诱导愈伤组织，分化及生根诱导。具体生产过程为：

 (1) 选取外植体

选取成熟饱满的柳枝稷种子100颗（0.225 g）。

 (2) 愈伤诱导及芽分化

将种子置于培养皿中，采用5 ml 6%(v/v)的NaClO表面消毒2 h，期间置于摇床上不停搅拌；

弃去次氯酸钠，清洗干净，用蒸馏水浸泡过夜；

用5 ml 6%(v/v)的NaClO钠消毒20 min，无菌条件下放入培养基中。培养基配方为

MS基础培养基上添加2,4-D 6 mg/L，6-BA 1.5 mg/L，NAA 1.2 mg/L，pH为5.8。

24℃，在光照培养箱中培养15~20 d诱导获得愈伤组织，分化培养，30~40 d时，可从愈伤组织中再生出大量的丛生芽。

经过统计，100颗柳枝稷成熟种子（0.225 g）诱导芽分化率只能达到40% 左右。

(3) 丛生芽生根培养

转移分化成芽的愈伤组织至生根培养基上进行生根诱导培养，24℃，光照条件下培养20~30 d，诱导生根，得到再生植株。其中，生根培养基配方为MS基础培养基上添加2,4-D 5 mg/L，6-BA 1.2 mg/L，NAA 1.5 mg/L ，pH为5.8。

(4) 移栽至温室

打开培养瓶封口，将再生植株炼苗4~6 d，移栽至温室即可。