大豆花叶病毒的一步法环介导逆转录等温扩增检测方法

摘要

本发明公开了大豆花叶病毒的一步法环介导逆转录等温扩增检测方法。使用本发明所述的引物组进行RT-LAMP反应，将反应产物于1%TBE琼脂凝胶中电泳或用荧光染料SYBR GreenI对扩增产物的可视化；反应呈阳性，表明存在大豆花叶病毒；反应呈阴性的表示待测样品不含大豆花叶病毒。本发明通过将RNA快速粗提取方法与RT-LAMP检测相结合，以快速粗提取的待测样品总RNA核酸作RT-LAMP的反应模板，节省了一般RT-LAMP采用常规RNA抽提方法所花费的冗余时间，简化了操作过程，加快了检测速度，实现对大豆花叶病毒的一步检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物监测领域，涉及大豆花叶病毒的一步法环介导逆转录等温扩增检测方法。

背景技术

大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）是一种在世界很多国家广泛分布并极具破坏 性的一种的病毒，每年都会给很多国家带来巨大的农业经济损失。由于该病害在世界范围内广 泛分布并普遍发生，导致大豆严重减产和种质衰退，所以发展SMV病毒病害的快速检测方法 对于该病害的诊断及准确把握该病害的流行规律和提出有效防治措施非常重要。目前大豆花叶 病毒病的检测包括生物学鉴定、电镜鉴定、酶联免疫反应（ELISA）和逆转录聚合酶链式扩增 反应（RT-PCR）。

环介导逆转录等温扩增（Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal  Amplification,RT-LAMP）是近几年新发展出的一种新型的基因扩增技术，它的优点包括扩增 时间短、灵敏度高以及不需要昂贵的循环扩增仪器，它已被广泛应用于多种人类流行性病毒的 检测。这种技术也逐渐被应用于植物病毒的检测，但是RT-LAMP检测目前还没有被用于SMV 的快速检测上。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足之处，提供一种大豆花叶病毒的一步法环介导逆转录 等温扩增检测方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种用于大豆花叶病毒检测的一步法环介导逆转录等温扩增检测的引物组，正向外引物 F3的序列为SEQ ID NO.1，反向外引物B3的序列为：SEQ ID NO.2，正向内引物FIP的序列 为：SEQ ID NO.3，反向内引物BIP的序列为：SEQ ID NO.4。

所述的引物组在制备一步法环介导逆转录等温扩增检测大豆花叶病毒的试剂盒中的应用。

一种用于大豆花叶病毒检测的一步法环介导逆转录等温扩增检测的试剂盒，包含本发明所 述的引物组。

所述的试剂盒包含以下RT-LAMP反应液：

*括号中的浓度表示相应物质在反应体系中的终浓度

大豆花叶病毒的一步法环介导逆转录等温扩增检测方法，使用本发明所述的引物组进行 RT-LAMP反应，将反应产物于1%TBE琼脂凝胶中电泳或用荧光染料SYBR Green I对扩增产 物的可视化；反应呈阳性，表明存在大豆花叶病毒；反应呈阴性的表示待测样品不含大豆花叶 病毒。所述的反应呈阳性是指电泳结果出现典型的LAMP条带，或扩增产物在荧光染料SYBR Green I存在下由橙色变为绿色；所述的反应呈阴性是指电泳结果未出现典型的LAMP条带， 或扩增产物为橙色。

所述的大豆花叶病毒的一步法环介导逆转录等温扩增检测方法，具体包含如下步骤：

（1）对待检样品进行RNA粗提取得RNA粗提取液：取100mg叶片，用400μL的0.5M NaOH中快速研磨，低速离心后快速取10μL上清于490μL的100mM Tris–HCl(pH8)溶液中， 混匀待用；

（2）以提取的RNA为模板，以所述的特异性引物F3、B3、FIP及BIP为引物配制RT-LAMP 反应溶液，反应液组成如下：

*括号中的浓度表示相应物质在反应体系中的终浓度

（3）将配好的RT-LAMP反应溶液于65℃的反应温度中进行反应，反应时间为60min，然后 80℃，5min；

（4）对反应产物进行结果分析：将反应产物于1%TBE琼脂凝胶中电泳或用荧光染料SYBR Green I对扩增产物的可视化，反应呈阳性，表明存在大豆花叶病毒；反应呈阴性的表示待测 样品不含大豆花叶病毒。

有益效果：

本发明首次公开了大豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法。本发明选取SMV CP保守区序列 (GenBank:HM590055.1)作为靶序列，筛选出特异性引物组，保证了RT-LAMP检测中对SMV 的特异性，以及对不同株系SMV检测的通用性。

本发明通过将RNA快速粗提取方法与SMV RT-LAMP检测相结合，以快速粗提取的待测 样品总RNA作RT-LAMP的反应模板，节省了一般RT-LAMP采用常规RNA抽提方法所花费 的冗余时间，简化了操作过程，加快了SMV检查速度，实现对大豆花叶病毒的一步检测。

附图说明

图1引物组筛选结果电泳图。1～3：引物组I；3～6：引物组II；7～9：引物组III；10～12：引物 组IV；其中:M为Marker，1、4、7、10空白（ddH₂O）对照，2、5、8、11质粒阳性对照，3、 6、9、12阳性RNA对照；

图2RT-LAMP反应体系优化的电泳图。

（A）Mg离子浓度优化。1：阴性对照，8：阳性对照，2～7Mg²⁺终浓度依次为：2、3、4、5、 6、7mM

（B）甜菜碱浓度优化。1：阴性对照，8：阳性对照，2～7甜菜碱的终浓度依次为：0.4、0.6、 0.8、1.0、1.2、1.4M

（C）dNTP浓度优化。1：阴性对照，8：阳性对照，2～7dNTP的终浓度依次为：0.4、0.6、 0.8、1.0、1.2、1.4mM

（D）内外引物浓度比优化。1：阴性对照，8：阳性对照，2～7内引物终浓度依次为：0.4、0.6、 0.8、1.0、1.2、1.4μM，外引物浓度用0.2μM，内外引物浓度比依次为：2:1、3:1、4:1、5:1、 6:1、7:1。

图3RT-LAMP与RT-PCR灵敏性比较试验的电泳图。

(A)2-7为从100-0.001ng呈10^-1倍递减的阳性RNA模板，1：空白对照，8：阳性质粒对照；

(B)100-0.001ng呈10^-1倍递减的RNA为模板的RT-PCR结果；

图4一步法RT-LAMP检测田间样品电泳图及利用荧光染料方法检测RT-LAMP扩增产物

(A)大豆叶片样品RT-LAMP检测电泳图。1：空白（ddH2O）对照，2：已知阳性的粗提RNA 样品，3：已知阳性质粒样品；

（B）大豆田间样品RT-LAMP检测电泳图。1：空白（ddH2O）对照，2：健康大豆叶片粗提 RNA样品，3：已知阳性质粒样品，4：已知带病植株粗提RNA样品，5～8：田间疑似带SMV 植株粗体RNA样品。

（C）紫外灯照射下，加入SYBR Green I的PCR扩增产物显色现象

具体实施方式

实施例1大豆花叶病毒RT-LAMP引物组设计及筛选：

通过对GenBank中不同株系的SMV外壳蛋白（CP）序列进行比对，找出如SEQ ID NO.5 所示的SMV CP保守区序列(GenBank:HM590055.1)作为模板参考序列，使用在线LAMP引物设 计软件primerExplorer V4(http://primerexplorerjp/elamp4.0.0/index.html)设计出4组引物组，引 物组如下：

引物组I：

F3-I：GCCATTAGCATCTGGAGAT（SEQ ID NO.6）

B3-I：CTTGCTTGAGTACAAACCTAA（SEQ ID NO.7）

FIP-I：ACGATGAGCAGATGGGTGTGTACCATTGTCAATGCACCATA（SEQ ID NO.8）

BIP-I：TCTTTAACTGCATTGTACCACGCGGTTGATTTATTCAACACTCGA（SEQ ID NO.9）

引物组II：

F3：AGATGTAAATGTTGGATC（SEQ ID NO.1）

B3：TCATCATCAAGCTCATATT（SEQ ID NO.2）

FIP:ATCTTCCCTTCAACCATTGGAAGAAGGTGGTTCCGCGTTTGCAGAAG（SEQ ID NO.3）

BIP：CCTAATCAGGTTGATTTATTCAAATCTTTAACTGCATTGTACCACGC（SEQ ID NO.4）

引物组III：

F3-III：TTGGATCAAAAGGAAAGGTG（SEQ ID NO.10）

B3-III：TCATCATCAAGCTCATATTCATC（SEQ ID NO.11）

FIP-III：ATRATCTTCCCTTCAACCATTGGAAGGCGTTTGCAGAAGATTACAAG（SEQ ID NO.12）

BIP-III：TTGCTTGAGTATAAGCCTAATCAGGAACTGCATTGTACCAYGC（SEQ ID NO.13）

引物组IV：

F3-IV：GCAGCAGAAGCTTACATTGA（SEQ ID NO.14）

B3-IV：TTCCCATCAAGTCCAAACA（SEQ ID NO.15）

FIP-IV：GCTCTCTATCTCTCAAATTCCTCAG-GATGAGAAATTCTGAAAGTCCG（SEQ ID NO.16）

BIP-IV：ATGAGGTTACTTCCAAAACACCAA-TTGTTGTTAACTCCCGAAAG（SEQ ID NO.17）

1）配制RT-LAMP反应溶液：以总反应体积10μL为例，依次按以下的原始反应体系加入 相应剂量的试剂于反应管中；其中不同的引物组为不同的处理。

原始反应体系

2）进行反应：将配好的RT-LAMP反应溶液于65℃的反应温度中进行反应，反应时间为 60min，80℃进行5min结束反应。

3）对反应产物进行结果分析：取2ul扩增产物于1%TBE琼脂凝胶中电泳，结果显示，引 物组II可以扩增出LAMP的特异性条带（如附图1），所以选定引物组II为后续试验所用引物 组。

实施例2大豆花叶病毒RT-LAMP反应体系优化实验

（1）对Mg离子浓度优化，按反应体系依次添加25mM MgSO₄：0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8ul。

（2）对甜菜碱浓度优化，按反应体系依次添加5M甜菜碱：0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8ul。

（3）对dNTP浓度优化，按反应体系依次添加10mM dNTP：0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ul。

（4）对内引物（FIP、BIP）浓度优化，按反应体系依次各添加（FIP、BIP）：0.2、0.3、0.4、 0.5、0.6、0.7。此时外引物均用0.2ul。

对照组用原始反应体系（见实施例1），空白对照为不加任何RNA的对照，阳性对照用质 粒，优化的反应管中加提取的带SMV大豆样品的总RNA。

从实验电泳图可以看出：a、镁离子在达到一定浓度时，才出现电泳条带，且Mg离子终 浓度在5mM时，条带最清晰。b、随着甜菜碱浓度的增加，电泳条带先是逐渐清晰，后再次 变模糊，说明甜菜碱是在某一浓度下做适合反应体系，这个浓度为0.8M。c、随着dNTP的浓 度增加，电泳条带先渐渐出现，后消失，首先出现的条带不是很清晰，在终浓度为0.8mM时， 电泳条带最清晰，所以反应体系使用0.8mM这个浓度。d、在外引物浓度一定时，内引物浓度 逐渐增加时，电泳条带逐渐变亮，且扩增出的小片段量逐渐增加，导致典型的LAMP条带变 得不清晰，所以内引物浓度选定为0.8μM。

对反应各种试剂浓度的筛选后，得出优化后各试剂浓度：25mM MgSO₄(终浓度为5mM) (TAKARA)，10mM dNTP’s(终浓度为0.8mM)(TAKARA)，5M甜菜碱(终浓度为0.8M) (Sigma），20μM FIP/BIP(终浓度为0.8μM)(Invitrogen)（如附图2）。

优化后反应体系如下：

实施例3RT-LAMP与RT-PCR灵敏性比较

为了确定RT-LAMP与RT-PCR两种检测方法的灵敏度，将提取的总RNA用分光光度计 测定浓度后，用RNAse-Free ddH₂O稀释，-70℃保存作为模板。对100ng的RNA模板依次进 行10^-1倍稀释至0.001ng，1ul RNA作为模板，采用引物组II按实施例2中体系进行反应。取 2ul扩增产物上样，在1%的琼脂糖凝胶上电泳。同时采用RT-LAMP相同模板，B3为反转录 引物，参照AMV反转录酶说明进行反转录合成cDNA第一链。以RT合成的cDNA为模板， 以F3与B3为引物进行PCR扩增，使用常规反应体系。取2ul扩增产物上样，在1%的琼脂糖 凝胶上电泳。结果显示RT-PCR检测到1ng的模板样，而RT-LAMP检测到0.1ng的模板样。 RT-LAMP灵敏度是一步法RT-PCR的10-100倍（如附图3）。

RT-PCR常规反应体系

RT-PCR反应程序：94℃反应2min，进入35个循环94℃反应20s，55℃反应30s，72℃反应 15s，循环结束后72℃反应10min。

实施例4

应用一步法RT-LAMP检测田间样品并利用荧光染料使RT-LAMP扩增产物可视化

1）对待检样品进行RNA粗提取：取100mg叶片，用400μL的0.5M NaOH中快速研磨， 低速离心后快速取10μL上清于490μL的100mM Tris–Cl(pH8)溶液中，混匀待用。

2）配制RT-LAMP反应溶液：以总反应体积10μL为例，依次按反应体系加入相应剂量的 试剂于反应管中；其中核酸模板即为步骤1）中最后的RNA粗提匀液。

3）进行反应：将配好的RT-LAMP反应溶液于65℃的反应温度中进行反应，反应时间为 60min，80℃进行5min结束反应。

4）对反应产物进行结果分析：取2ul扩增产物于2%TBE琼脂凝胶中电泳，同时向PCR 管中加入SYBR Green I（1:1000），1～5min后观察结果，结果显示阳性扩增产物迅速变为绿色， 阴性及无扩增产物保持染料的橙色（如附图4）

以上的试验结果说明，本发明的大豆花叶病毒一步法RT-LAMP检测技术能够准确、特异、 灵敏、快速地检测出SMV。同时，简便的操作方式、反应的快速性和结果的可视性使本发明 为SMV的分子检测提供了一个高效的技术平台；对于及早、方便准确地发现SMV，进而采取 针对性的防治策略，减少病毒带来的直接以及次生损失提供了技术保证。