甾体激素类物质重要中间体的11-α羟化反应制备方法

摘要

本发明涉及一种甾体激素类物质重要中间体的11-α羟化反应制备方法，该反应制备方法为将甾体底物Ⅰ投入含有霉菌种子的发酵培养基中发酵，在霉菌和催化剂作用下发生羟化反应，对甾体底物Ⅰ的11位、21位进行改造，得到具有11-α-羟基、21羟基的甾体激素类物质重要中间体Ⅱ。本发明利用硼酸盐催化剂提高反应速度，节省反应时间，降低发酵过程中空气的消耗量，同时能将转化率提高约5%；利用合成培养基代替天然培养基，降低成本减轻后续分离工段压力。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程转化技术领域，具体涉及一种甾体激素类物质重要中间体的11-α羟化反应制备方法。 

背景技术

甾体激素类物质是皮质激素药物的主要成分，皮质激素药物对机体起着非常重要的调节作用,具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。我国是皮质激素原料药的出口大国，其中乙酸强的松占总产量的60%，我国自20世纪50年代至今一直采用黑根霉转化工艺,2%的投料量转化率为40%～50%,与国外生产水平80%～90%差距较大,因此开发新的高产菌种将有望从整体水平提高原料的利用率,产生巨大的社会效益和经济效益。目前国内对于甾体激素类物质重要中间体的11-α羟化反应制备方法主要集中在化学法和生物法转化，化学法由于涉及到环境污染、反应过程危险、转化效率低等缺点，生物转化法由于其具有转化率较高、具有环境友好效果、反应过程易控制等优点而得到推广。目前新型霉菌对甾体羟化反应的转化率较高,但存在转化周期长、易产孢子、菌体细导致抽滤、离心困难等不足。 

刘玲玲、杜大庆等人研究金龟子绿僵菌对甾体底物11－α羟化反应的工艺，对甾体底物16α、17α-环氧黄体酮的羟化反应工艺进行了探索，研究工艺结果为：浓度为1～1.2×108个/ml的孢子液，接种量为0.8ml。培养基配比分别如下：一级葡萄糖3.0g/dL、玉米浆2.5g/dL、硫酸铵0.15g/dL、蚕蛹粉0.2g/dL，培养温度26～28℃，228r/min培养36h，15%接种量，接种二级，二级葡萄糖调整为3.5g/dL，其余同一级，继续培养至pH值降到最低点以前（20h左右）将发酵液稀释一倍之后投料，投料浓度2g/dL(吐温水溶液)，转化65h后结束发酵，转化率达70%以上。该工艺采用了天然培养基，生产成本较高，且工艺过程涉及到一级培养和二级培养，工艺复杂繁琐，转化率最高仅为73.2%。 

发明内容

本发明针对以上现有11-α羟化反应制备技术存在转化率低、制备方法复杂、反应时间长、成本高等，通过研究添加生物催化剂或前体物，刺激新型霉菌更多的产生羟化酶，抑制别的酶产生，从而实现提高转化率，缩短反应时间，减少杂质生成，且制备方法得到简化。本发明采用各成分清晰、成本低的合成培养基，相对于成分过于复杂、成本高的天然培养基，成本得到降低。 

本发明通过以下技术方案实现的：一种甾体激素类物质重要中间体的11-α羟化反应制备方法，其特征在于，将甾体底物Ⅰ投入含有霉菌种子的发酵培养基中发酵，在霉菌和催化剂作用下发生羟化反应，对甾体底物Ⅰ的11位、21位进行改造，得到具有11-α-羟基、21羟基的甾体激素类物质重要中间体Ⅱ， 

所述的发酵培养基中含有0.1～10g/L的硼酸盐催化剂；所述甾体底物Ⅰ和甾体激素类物质重要中间体Ⅱ中， 或

反应制备方法包括以下步骤：（1）第一步进行霉菌种子培养，本步骤为现有公知技术，首先配置斜面培养基和种子培养基，并进行灭菌，取霉菌菌株涂布于斜面培养基上，在25～32摄氏度下培养5～7d。菌种斜面加入无菌水,用棉签扫下,制成浓度约1.2×10⁸个/mL的孢子液。吸取0.5ml孢子液,接种到100mL灭过菌的种子培养基中,25～32度，150～200r/min条件下培养24h左右。其中种子培养基成分（g/L）:磷酸氢二钾0.05，硫酸镁0.05，柠檬酸铁铵0.005，柠檬酸2，硝酸铵2，碳酸钙10，甘油20，葡萄糖5。斜面培养基（g/L）：在种子培养基的基础上加入琼脂15g。 

（2）第二步进行摇瓶发酵培养基培养，将80ml培养好的种子液移种到已灭菌的1600ml发酵培养基溶液中，在25～32度，150～200r/min条件下培养，其中发酵培养基成分（g/L）：棉籽饼粉3～8，葡萄糖10～25kg，氯化钾0.02～0.15，硝酸钾0.5～3.0，磷酸二氢钾0.5～2.5，磷酸氢二钾1.0～4.0，硼酸盐0.1～10。 

（3）第三步羟化反应催化，霉菌发酵生物量干重达0.5～6g/L后,投入乙醇水溶好的甾体底物Ⅰ,继续转化50～70h，结束发酵获得发酵液。 

（4）第四步分离提取：发酵液经高速离心机离心分离后，将分离液用有机溶剂进行提取，通过蒸馏浓缩有机溶剂后得发酵转化产物湿品，再经65℃烘干得发酵转化产物干品,发酵转化产物经HPLC测定后计算转化率。 

本发明一种甾体激素类物质重要中间体的11-α羟化反应制备方法，实现的依据是：采用硼酸盐类物质作为生物转化的催化剂，在菌种进行培养时加入，该催化剂能使菌种在生长 的同时刺激菌体分泌特定的羟化酶，同时能够抑制别的不需要的生物酶的产生，这样就能提高羟化反应的速度及提高产率。生物转化催化的化学反应原理为：其化学反应原理如是由甾体底物Ⅰ：1，4孕甾二烯-16-甲基-17α-羟基-3，20-二酮进行生物转化，发生羟化反应，生成产物为Ⅱ：1，4孕甾二烯-16-甲基-11α，17α，21-三羟基-3，20-二酮。 

以上所述的一种甾体激素类物质重要中间体的11-α羟化反应制备方法，其特征在于，所述的硼酸盐为四硼酸钠、四硼酸钾、硼酸镁中的之一或它们的组合物。 

以上所述的一种甾体激素类物质重要中间体的11-α羟化反应制备方法，其特征在于，所述的霉菌为绿僵霉菌、木霉菌、赭曲霉菌、黄曲霉菌中的之一或它们的组合。 

以上所述的一种甾体激素类物质重要中间体的11-α羟化反应制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基成分（g/L）：棉籽饼粉3～8，葡萄糖10～25kg，氯化钾0.02～0.15，硝酸钾0.5～3.0，磷酸二氢钾0.5～2.5，磷酸氢二钾1.0～4.0，硼酸盐0.1～10。 

以上所述发酵培养基组成成分，其优选方案为（g/L）：棉籽饼粉5.4，葡萄糖14.4kg氯化钾0.072，硝酸钾1.44，磷酸二氢钾0.9，磷酸氢二钾1.8，硼酸盐0.1～10。 

以上所述的一种甾体激素类物质重要中间体的11-α羟化反应制备方法，其特征在于，所述甾体底物Ⅰ投入为发酵培养基中霉菌发酵生物量干重达0.5～6g/L时投入；所述甾体底物Ⅰ其投入量为在发酵培养基中初始浓度达1～8g/L。 

以上所述的一种甾体激素类物质重要中间体的11-α羟化反应制备方法，其特征在于，所述的甾体激素类物质重要中间体Ⅱ为地塞米松或倍他米松的中间体。 

本发明一种甾体激素类物质重要中间体的11-α羟化反应制备方法产生了以下良好效果： 

（1）本发明利用合成培养基作为发酵培养基，发酵液成分明了清晰，相对于传统天然培养基，大大降低了发酵成本以及减轻了后提取工段的压力。 

（2）通过添加生物催化剂或前体物，刺激新型霉菌更多的产生羟化酶，抑制别的酶产生，从而实现提高转化率，缩短反应时间，减少杂质生成，且制备方法得到简化。 

（3）本发明的转化率可达73～80%，相对于现有技术转化率提高了5%，且总反应时间缩短为50～70小时，避免了多级培养基的繁琐转化方法。 

附图说明

图1是甾体类化合物碳原子编号顺序图（公知技术）。 

图2是甾体底物进行羟化反应原理图。 

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明一种甾体激素类物质重要中间体的11-α羟化反应制备方法 进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。 

实施例1 

（1）第一步进行绿僵霉菌种子培养，首先配置斜面培养基和种子培养基，并进行灭菌，取霉菌菌株涂布于斜面培养基上，在27摄氏度下培养5～7d。菌种斜面加入无菌水,用棉签扫下,制成浓度约1.2×10⁸个/mL的孢子液。吸取0.5ml孢子液,接种到100mL灭过菌的种子培养基中,28摄氏度，150-200r/min条件下培养24h左右。其中种子培养基成分（g/L）:磷酸氢二钾0.05，硫酸镁0.05，柠檬酸铁铵0.005，柠檬酸2，硝酸铵2，碳酸钙10，甘油20，葡萄糖5。斜面培养基（g/L）：在种子培养基的基础上加入琼脂15g。 

（2）第二步进行摇瓶发酵培养基培养，将80ml培养好的种子液移种到已灭菌的1600ml发酵培养基溶液中，在25～32度，150～200r/min条件下培养，其中发酵培养基成分（g/L）：棉籽饼粉4.5，葡萄糖16.5kg，氯化钾0.085，硝酸钾0.75，磷酸二氢钾2.35，磷酸氢二钾1.0，四硼酸钠6.0，四硼酸钾4.0。 

（3）第三步羟化反应催化，霉菌发酵生物量干重达0.5g/L后,投入乙醇水溶好的甾体底物,甾体底物投入量为在发酵培养基中初始浓度达4.5g/L，继续转化64h，羟化反应原理如图2，结束发酵获得发酵液。 

（4）第四步分离提取：发酵液经高速离心机离心分离后，将分离液用有机溶剂进行提取，通过蒸馏浓缩有机溶剂后得发酵转化产物湿品，再经65℃烘干得发酵转化产物干品,发酵转化产物经HPLC测定后计算转化率。 

本实施例产物经HPLC测定后计算转化率为80%。 

实施例2 

（1）第一步进行赭曲霉菌种子培养，首先配置斜面培养基和种子培养基，并进行灭菌，取霉菌菌株涂布于斜面培养基上，在25摄氏度下培养5～7d。菌种斜面加入无菌水,用棉签扫下,制成浓度约1.2×10⁸个/mL的孢子液。吸取0.5ml孢子液,接种到100mL灭过菌的种子培养基中,27度，150-200r/min条件下培养24h左右。其中种子培养基成分（g/L）:磷酸氢二钾0.05，硫酸镁0.05，柠檬酸铁铵0.005，柠檬酸2，硝酸铵2，碳酸钙10，甘油20，葡萄糖5。斜面培养基（g/L）：在种子培养基的基础上加入琼脂15g。 

（2）第二步进行摇瓶发酵培养基培养，将80ml培养好的种子液移种到已灭菌的1600ml发酵培养基溶液中，在25～32度，150～200r/min条件下培养，其中发酵培养基成分（g/L）：棉籽饼粉5.4，葡萄糖14.4kg，氯化钾0.072，硝酸钾1.44，磷酸二氢钾0.9，磷酸氢二钾1.8，四硼酸钠0.5。 

（3）第三步羟化反应催化，霉菌发酵生物量干重达6g/L后,投入乙醇水溶好的甾体底物,甾体底物投入量为在发酵培养基中初始浓度达1.8g/L，继续转化65h,羟化反应原理如图2，结束发酵获得发酵液。 

（4）第四步分离提取：发酵液经高速离心机离心分离后，将分离液用有机溶剂进行提取，通过蒸馏浓缩有机溶剂后得发酵转化产物湿品，再经65℃烘干得发酵转化产物干品,发酵转化产物经HPLC测定后计算转化率。 

本实施例产物经HPLC测定后计算转化率为78.5%。 

实施例3 

（1）第一步进行木霉菌和绿僵霉菌种子培养，首先配置斜面培养基和种子培养基，并进行灭菌，取霉菌菌株涂布于斜面培养基上，在32摄氏度下培养5～7d。菌种斜面加入无菌水,用棉签扫下,制成浓度约1.2×10⁸个/mL的孢子液。吸取0.5ml孢子液,接种到100mL灭过菌的种子培养基中,32度，150-200r/min条件下培养24h左右。其中种子培养基成分（g/L）:磷酸氢二钾0.05，硫酸镁0.05，柠檬酸铁铵0.005，柠檬酸2，硝酸铵2，碳酸钙10，甘油20，葡萄糖5。斜面培养基（g/L）：在种子培养基的基础上加入琼脂15g。 

（2）第二步进行摇瓶发酵培养基培养，将80ml培养好的种子液移种到已灭菌的1600ml发酵培养基溶液中，在25～32度，150～200r/min条件下培养，其中发酵培养基成分（g/L）：棉籽饼粉3.5，葡萄糖18.8kg，氯化钾0.037，硝酸钾2.55，磷酸二氢钾0.65，磷酸氢二钾1.6，四硼酸钾1.0。 

（3）第三步羟化反应催化，霉菌发酵生物量干重达4.5g/L后,投入乙醇水溶好的甾体底物,甾体底物投入量为在发酵培养基中初始浓度达1.0g/L，继续转化55h,羟化反应原理如图2，结束发酵获得发酵液。 

（4）第四步分离提取：发酵液经高速离心机离心分离后，将分离液用有机溶剂进行提取，通过蒸馏浓缩有机溶剂后得发酵转化产物湿品，再经65℃烘干得发酵转化产物干品,发酵转化产物经HPLC测定后计算转化率。 

本实施例产物经HPLC测定后计算转化率为76.3%。 

实施例4 

（1）第一步进行黄曲霉种子培养，首先配置斜面培养基和种子培养基，并进行灭菌，取霉菌菌株涂布于斜面培养基上，在30摄氏度下培养5～7d。菌种斜面加入无菌水,用棉签扫下,制成浓度约1.2×10⁸个/mL的孢子液。吸取0.5ml孢子液,接种到100mL灭过菌的种子培养基中,30度，150-200r/min条件下培养24h左右。其中种子培养基成分（g/L）:磷 酸氢二钾0.05，硫酸镁0.05，柠檬酸铁铵0.005，柠檬酸2，硝酸铵2，碳酸钙10，甘油20，葡萄糖5。斜面培养基（g/L）：在种子培养基的基础上加入琼脂15g。 

（2）第二步进行摇瓶发酵培养基培养，将80ml培养好的种子液移种到已灭菌的1600ml发酵培养基溶液中，在25～32度，150～200r/min条件下培养，其中发酵培养基成分（g/L）：棉籽饼粉3.0，葡萄糖20kg，氯化钾0.02，硝酸钾0.5，磷酸二氢钾1.15，磷酸氢二钾1.3，硼酸镁2.0。 

（3）第三步羟化反应催化，霉菌发酵生物量干重达5g/L后,投入乙醇水溶好的甾体底物,甾体底物投入量为在发酵培养基中初始浓度达2.5g/L，继续转化50h,羟化反应原理如图2，结束发酵获得发酵液。 

（4）第四步分离提取：发酵液经高速离心机离心分离后，将分离液用有机溶剂进行提取，通过蒸馏浓缩有机溶剂后得发酵转化产物湿品，再经65℃烘干得发酵转化产物干品,发酵转化产物经HPLC测定后计算转化率。 

实施例5 

（1）第一步进行木霉菌种子培养，首先配置斜面培养基和种子培养基，并进行灭菌，取霉菌菌株涂布于斜面培养基上，在31摄氏度下培养5～7d。菌种斜面加入无菌水,用棉签扫下,制成浓度约1.2×10⁸个/mL的孢子液。吸取0.5ml孢子液,接种到100mL灭过菌的种子培养基中,31度，150-200r/min条件下培养24h左右。其中种子培养基成分（g/L）:磷酸氢二钾0.05，硫酸镁0.05，柠檬酸铁铵0.005，柠檬酸2，硝酸铵2，碳酸钙10，甘油20，葡萄糖5。斜面培养基（g/L）：在种子培养基的基础上加入琼脂15。 

（2）第二步进行摇瓶发酵培养基培养，将80ml培养好的种子液移种到已灭菌的1600ml发酵培养基溶液中，在25～32度，150～200r/min条件下培养，其中发酵培养基成分（g/L）：棉籽饼粉5.0，葡萄糖13.5kg，氯化钾0.054，硝酸钾1.67，磷酸二氢钾1.65，磷酸氢二钾2.4，四硼酸钾0.1。 

（3）第三步羟化反应催化，霉菌发酵生物量干重达2.8g/L后,投入乙醇水溶好的甾体底物,甾体底物投入量为在发酵培养基中初始浓度达3.5g/L，继续转化63h,羟化反应原理如图2，结束发酵获得发酵液。 

（4）第四步分离提取：发酵液经高速离心机离心分离后，将分离液用有机溶剂进行提取，通过蒸馏浓缩有机溶剂后得发酵转化产物湿品，再经65℃烘干得发酵转化产物干品,发酵转化产物经HPLC测定后计算转化率。 

本实施例产物经HPLC测定后计算转化率为78.2%。 

实施例6 

（1）第一步进行黄曲霉和绿僵霉菌种子培养，首先配置斜面培养基和种子培养基，并进行灭菌，取霉菌菌株涂布于斜面培养基上，在29摄氏度下培养5～7d。菌种斜面加入无菌水,用棉签扫下,制成浓度约1.2×10⁸个/mL的孢子液。吸取0.5ml孢子液,接种到100mL灭过菌的种子培养基中,29度，150-200r/min条件下培养24h左右。其中种子培养基成分（g/L）:磷酸氢二钾0.05，硫酸镁0.05，柠檬酸铁铵0.005，柠檬酸2，硝酸铵2，碳酸钙10，甘油20，葡萄糖5。斜面培养基（g/L）：在种子培养基的基础上加入琼脂15g。 

（2）第二步进行摇瓶发酵培养基培养，将80ml培养好的种子液移种到已灭菌的1600ml发酵培养基溶液中，在25～32度，150～200r/min条件下培养，其中发酵培养基成分（g/L）：棉籽饼粉6.0，葡萄糖12.0kg，氯化钾0.045，硝酸钾2.16，磷酸二氢钾1.90，磷酸氢二钾2.80，四硼酸钠3.0，四硼酸钾4.0。 

（3）第三步羟化反应催化，霉菌发酵生物量干重达5.5g/L后,投入乙醇水溶好的甾体底物,甾体底物投入量为在发酵培养基中初始浓度达5.0g/L，继续转化68h,羟化反应原理如图2，结束发酵获得发酵液。 

（4）第四步分离提取：发酵液经高速离心机离心分离后，将分离液用有机溶剂进行提取，通过蒸馏浓缩有机溶剂后得发酵转化产物湿品，再经65℃烘干得发酵转化产物干品,发酵转化产物经HPLC测定后计算转化率。 

本实施例产物经HPLC测定后计算转化率为75.8%。 

实施例7 

（1）第一步进行绿僵霉菌和赭曲霉菌种子培养，首先配置斜面培养基和种子培养基，并进行灭菌，取霉菌菌株涂布于斜面培养基上，在28摄氏度下培养5～7d。菌种斜面加入无菌水,用棉签扫下,制成浓度约1.2×10⁸个/mL的孢子液。吸取0.5ml孢子液,接种到100mL灭过菌的种子培养基中,28度，150-200r/min条件下培养24h左右。其中种子培养基成分（g/L）:磷酸氢二钾0.05，硫酸镁0.05，柠檬酸铁铵0.005，柠檬酸2，硝酸铵2，碳酸钙10，甘油20，葡萄糖5。斜面培养基（g/L）：在种子培养基的基础上加入琼脂15g。 

（2）第二步进行摇瓶发酵培养基培养，将80ml培养好的种子液移种到已灭菌的1600ml发酵培养基溶液中，在25～32度，150～200r/min条件下培养，其中发酵培养基成分（g/L）：棉籽饼粉7.5，葡萄糖10.0kg，氯化钾0.12，硝酸钾2.58，磷酸二氢钾2.20，磷酸氢二钾3.0，四硼酸钠3，四硼酸钾3，硼酸镁3。 

（3）第三步羟化反应催化，霉菌发酵生物量干重达3.0g/L后,投入乙醇水溶好的甾体 底物,甾体底物投入量为在发酵培养基中初始浓度达6.0g/L，继续转化70h,羟化反应原理如图2，结束发酵获得发酵液。 

（4）第四步分离提取：发酵液经高速离心机离心分离后，将分离液用有机溶剂进行提取，通过蒸馏浓缩有机溶剂后得发酵转化产物湿品，再经65℃烘干得发酵转化产物干品,发酵转化产物经HPLC测定后计算转化率。 

本实施例产物经HPLC测定后计算转化率为80%。 

实施例8 

（1）第一步进行赭曲霉菌和黄曲霉菌种子培养，首先配置斜面培养基和种子培养基，并进行灭菌，取霉菌菌株涂布于斜面培养基上，在26摄氏度下培养5～7d。菌种斜面加入无菌水,用棉签扫下,制成浓度约1.2×10⁸个/mL的孢子液。吸取0.5ml孢子液,接种到100mL灭过菌的种子培养基中,26度，150-200r/min条件下培养24h左右。其中种子培养基成分（g/L）:磷酸氢二钾0.05，硫酸镁0.05，柠檬酸铁铵0.005，柠檬酸2，硝酸铵2，碳酸钙10，甘油20，葡萄糖5。斜面培养基（g/L）：在种子培养基的基础上加入琼脂15g。 

（2）第二步进行摇瓶发酵培养基培养，将80ml培养好的种子液移种到已灭菌的1600ml发酵培养基溶液中，在25～32度，150～200r/min条件下培养，其中发酵培养基成分（g/L）：棉籽饼粉6.5，葡萄糖21.5kg，氯化钾0.125，硝酸钾2.79，磷酸二氢钾2.5，磷酸氢二钾3.5，四硼酸钠2.5，四硼酸钾2.5。 

（3）第三步羟化反应催化，霉菌发酵生物量干重达2.0g/L后,投入乙醇水溶好的甾体底物,甾体底物投入量为在发酵培养基中初始浓度达8.0g/L，继续转化52h,羟化反应原理如图2，结束发酵获得发酵液。 

（4）第四步分离提取：发酵液经高速离心机离心分离后，将分离液用有机溶剂进行提取，通过蒸馏浓缩有机溶剂后得发酵转化产物湿品，再经65℃烘干得发酵转化产物干品,发酵转化产物经HPLC测定后计算转化率。 

本实施例产物经HPLC测定后计算转化率为73.8%。 

实施例9 

（1）第一步进行绿僵霉菌和黄曲霉菌种子培养，首先配置斜面培养基和种子培养基，并进行灭菌，取霉菌菌株涂布于斜面培养基上，在30摄氏度下培养5～7d。菌种斜面加入无菌水,用棉签扫下,制成浓度约1.2×10⁸个/mL的孢子液。吸取0.5ml孢子液,接种到100mL灭过菌的种子培养基中,30度，150-200r/min条件下培养24h左右。其中种子培养基成分（g/L）:磷酸氢二钾0.05，硫酸镁0.05，柠檬酸铁铵0.005，柠檬酸2，硝酸铵2，碳酸 钙10，甘油20，葡萄糖5。斜面培养基（g/L）：在种子培养基的基础上加入琼脂15g。 

（2）第二步进行摇瓶发酵培养基培养，将80ml培养好的种子液移种到已灭菌的1600ml发酵培养基溶液中，在25～32度，150～200r/min条件下培养，其中发酵培养基成分（g/L）：棉籽饼粉8.0，葡萄糖25.0kg，氯化钾0.15，硝酸钾3.0，磷酸二氢钾1.37，磷酸氢二钾4.0，四硼酸钠3.5。 

（3）第三步羟化反应催化，霉菌发酵生物量干重达1.5g/L后,投入乙醇水溶好的甾体底物,甾体底物投入量为在发酵培养基中初始浓度达7.25g/L，继续转化62h，羟化反应原理如图2，结束发酵获得发酵液。 

（4）第四步分离提取：发酵液经高速离心机离心分离后，将分离液用有机溶剂进行提取，通过蒸馏浓缩有机溶剂后得发酵转化产物湿品，再经65℃烘干得发酵转化产物干品,发酵转化产物经HPLC测定后计算转化率。 

本实施例产物经HPLC测定后计算转化率为77.5%。