公开/公告号CN103172726A
专利类型发明专利
公开/公告日2013-06-26
原文格式PDF
申请/专利权人 杭州淳泰科技有限公司;
申请/专利号CN201110451011.8
发明设计人 李湘;
申请日2011-12-22
分类号
代理机构
代理人
地址 310018 浙江省杭州市经济技术开发区白杨街道6号大街452号1幢5B03号房
入库时间 2024-02-19 18:43:12
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-06-13
授权
授权
2015-01-07
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K14/62 申请日:20111222
实质审查的生效
2013-06-26
公开
公开
技术领域
本发明涉及胰泌素类似物及其制备方法和治疗用途。
背景技术
胰泌素(Secretin)是一种肠道激素,由小肠上端粘膜中形成,刺激胰腺分泌水及碳酸 氢盐。胰泌素是一种27个氨基酸链接的多肽。
人胰泌素是具有如下序列的多肽化合物:
H2N-His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg -Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-CONH2
胰泌素能够刺激,促进胰腺分泌弱碱性含酶的胰液,是常用的诊断胰腺功能的试剂,研 究表明,胰泌素还具有治疗消化道溃疡的作用。US2004241154公开了胰泌素治疗哮喘的用途。 WO2004081195公开了胰泌素治疗感染性疾病的用途。US2007154534公开了胰泌素治疗精神系 统疾病,如精神分裂的用途。
然而,胰泌素在体外表现出极不稳定性,大量研究显示,胰泌素在体外,尤其是在水溶 液中,会快速失活。即便是在低温状态,例如-20℃时,胰泌素也会逐渐降解,而丧失活性。
天然胰泌素在制剂制备过程中、贮存运输中,都会因其不稳定性而导致生物活性的降低, 不能满足诊断治疗中的安全有效性。而且,由于天然胰泌素的不稳定性,必然使运输和贮存 成本增加,间接导致了药品成本的增加。
目前都是通过制剂方式改善天然胰泌素的稳定性问题,例如US3940480提供了一种含有 丙氨酸的胰泌素的颗粒,提高胰泌素的稳定性。
因此,急需开发一种具有天然胰泌素活性,稳定性得以改善的多肽化合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种胰泌素的类似物,其化学结构式如下:
其中每个R1、R2独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基 或杂环基烷基;R1、R2优选烷基,更优选C1-C4的烷基,最优选甲基;
R3选自烷基、烯基、炔基、[R1’-K-R1’]n;
所述的R1’选自烷基、炔基(烯基)或炔基;
所述的K是O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR2’、
所述的R2’是H或烷基;
n是2-7的整数。
R3优选烯基。
本发明胰泌素的类似物优选具有下列结构的化合物:
其中每个R1、R2独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基 或杂环基烷基;优选烷基,更优选C1-C4的烷基,最优选甲基;
n选自2-7的整数,优选n是3。
本发明胰泌素类似物更优选具有下列结构的化合物:
本发明的胰泌素类似物具有天然的多肽二级结构,α螺旋程度增加,使其更接近于胰泌 素的四级结构特点,降低了胰泌素的降解。与天然胰泌素序列相比,本发明的多肽化合物的 化学稳定性得以提高。而且本发明的多肽化合物保留了天然胰泌素的药理活性。
本发明胰泌素类似物尤其优选以具有光学活性的(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸(即图 1中的S5)取代序列中的天然氨基酸,所述的取代基通过化学催化的方式彼此环合后获得的 多肽化合物。
所述的取代基以Fmoc进行保护,参与多肽的合成,所述的Fmoc-(S)-2-氨基-2-甲基 -6-庚烯酸具有如下结构:
本发明的另一方面提供了制备上述胰泌素类似物的方法。可以采用本领域技术人员熟知 的方法,选择顺序的或次序不同的合成步骤产生具有如下化学结构的物质:
所述的合成方法包括:例如液相合成或固相合成(SPPS)进行制备,优选SPPS。所述的 固相合成可以选择常规聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树 脂等,例如:王氏树脂(Wang Resin),Rink amide linker MBHA树脂等,优选Rink amide linker MBHA树脂。本发明化合物的环状结构是通过催化环合的方式制备的,所述的催化剂 可以是:钌催化剂,优选的催化剂是苯基亚甲基双(三环己基磷)二氯化钌(Grubbs 1st),或 Grubbs 2st。
本发明另一方面提供了包括上述胰泌素类似物的药物组合物。所述的药物组合物包含有 效量的具有上述结构的多肽化合物和药学可接受的载体,所述的组合物可以根据本领域的公 知技术进行制备,例如与常规的药用辅料进行混合,制备成注射剂、注射液,或局部给药的 制剂类型例如乳剂、膏剂、霜剂或经鼻给药的剂型等,或具有缓释效果的制剂,例如微球、 脂质体等。
本发明所述的“药学可接受的载体”包括任何一种药用辅料,例如填充剂、稀释剂、赋 形剂等。例如包括但不限于:乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、纤维素类(如羧甲基纤维素、羟 丙甲基纤维素等)、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、无菌生理盐水、无菌水、乙醇等。通常, 药学上可接受的载体是水溶性的pH缓冲液,例如柠檬酸盐、磷酸盐等;还可以含有抗氧化剂, 稳定剂(如氨基酸)、抑菌剂等。
发明人发现,本发明的胰泌素类似物具有与天然胰泌素相似的生物活性,能够促进受试 者分泌胰液,预防和治疗与胰泌素相关的疾病和病症,例如诊断胰腺功能和/或治疗消化道溃 疡。且发明的胰泌素类似物具有比天然胰泌素更好的稳定性。
附图说明
图1是本发明优选的胰泌素类似物的制备流程,图1分子式中的S5是(S)-2-氨基-2-甲基-6- 庚烯基
图2是本发明优选胰泌素类似物稳定性实验结果
图3是本发明优选的胰泌素类似物对离体大鼠胰腺外分泌的影响
具体实施例
以下的实施例用于进一步的阐明本发明的技术方案。本发明说明书及实施例中所带保护 基的氨基酸单体以及其他化学试剂等,均可从相关公司购买获得,未注明具体条件的试验方 法,可按常规条件进行,或按商品供货商所建议的条件进行。
实施例1胰泌素类似物的制备
按照图1所示的步骤,将氨基酸逐一接在树脂上,然后用催化剂催化环合,接着脱去保 护基并将多肽从树脂上切下。
1、固相合成
选择0.402g Rink amide linker MBHA树脂(取代度:0.373mmol/g)制备,在室温条件下 用DMF浸泡树脂60min,将带有Fmoc保护的氨基酸按照序列的顺序排列在合成仪中进行活化 连接,获得如图所示的化合物。
2、催化环合
将上述步骤所得的化合物2依次用DCM(20ml)和DCE(20ml)各冲洗两次,然后用DCE(8ml) 浸泡30min,接着将Grubbs 1st(25mgx2,20mg/0.1mmol)加入反应混合物中,室温振摇3 小时。用MS检测环化情况,如果环化不完全,重复该步骤,通常重复2次,获得如图所示的 化合物(0.817g)。
3、切除树脂
将含有上述化合物3的反应混合物放在裂解液中,氮气保护下室温搅拌2.5小时。过滤, 去除滤液,滤饼用TFA(2ml)冲洗,接着放置在冷的乙醚(50ml)中沉淀,离心;得到的滤饼 用冷的乙醚(50ml)冲洗两次,真空干燥,获得本发明SECRETIN多肽类似物389mg,产率83%, MW=3104.7,理论值MW=3104.7
4、纯化
将上述部分粗品191mg用HPLC进行纯化,获得纯度95%以上的纯品26mg。
实施例2胰泌素类似物的体外稳定性试验
分别将天然胰泌素本发明胰泌素类似物(实施例1制备)置于0.1M的磷酸缓冲液中 (PH7.0),于60℃下放置36小时,每三小时用RP-HPLC检测其中胰泌素或类似物的残留量。
取胰泌素和类似物的样品,用CH3CN和1%的HClO4(2∶3,v/v)稀释,C18柱为固定相,乙 腈/0.005M磷酸缓冲液/0.2MNaClO4为流动相,210nm处检测。
结果如图2所示,在实验条件下,天然胰泌素迅速降解,24小时降解约30%;而本发明 类似物几乎未发生降解。
实施例3胰泌素类似物的体外生物学实验
选Wistar大鼠,体重200±20g,10只,随机分为两组(天然胰泌素组、类似物组)。 乌拉坦(45mg/kg)麻醉大鼠,切开腹腔,剥离胰腺,将离体胰腺迅速放入37℃含Krebs-Ringer 缓冲液(KR液)的恒温孵育箱中。用恒流泵将PH7.2充有95%O2和5%CO2的KR液恒速 (1.0ml/min)灌入腹主动脉,孵育皿中的缓冲液则以0.35ml/min的速度持续供给。两组分 别单独灌流0.25CU/kg.h的天然胰泌素和本发明类似物(实施例1)。将微量毛细管插入胰 管,胰液沿毛细管流出,每30min收集一次胰液,给药前灌流KR液1.5h,收集离体胰液作 为对照。
结果如图3所示,天然胰泌素可以有效刺激胰液分泌,胰液量由空白对照10.52±1.05 增加到24.66±4.02ul/30min;类似物也可以有效刺激胰液分泌,胰液量由空白对照 10.06±2.25增加到22.74±1.02ul/30min。本发明类似物仍然保留了天然胰泌素的生物活 性。
机译: 硫酸酯的制备方法-胰胰泌素八肽ida胺胆囊收缩素
机译: 胰抑制素和胰抑制素类似物的制备方法
机译: 胰岛素类似物,其制备方法,胰岛素类似物的前体,编码载体的DNA序列,细菌和酵母宿主细胞中的功能性表达细胞药物组合物,注射胰岛素活性的溶液,胰岛素类似物的用途