4-(取代苄基)-1(2H)-2,3-二氮杂萘酮类衍生物及其制备方法、药物组合物和用途

摘要

本发明涉及4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物及其制备方法、药物组合物和用途。具体地说，本发明涉及式I化合物或其异构体以及在药学上可接受的盐、溶剂合物、化学保护形式和前药，其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6的定义如说明书和权利要求书中所述。该化合物是有效的多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)抑制剂。

说明书

技术领域

本发明属于医药化工领域，具体涉及一类新的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物及其制备方法、其药物组合物以及用途，该化合物具有多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)抑制活性。

背景技术

多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(也被称作聚ADP-核糖合酶和聚ADP-核糖基转移酶，通常称作PARP)家族现在包含约18种蛋白质，虽然这些蛋白质在催化结构域上有一定的同源性，但其细胞功能是不同的(Ame等，Bioessays.J.，342，249-268(1999))。目前，只发现PARP-1和PARP-2是通过发生DNA链断裂而催化其活性的酶。PARP-1是广泛存在于哺乳动物中的酶，是一种具有113-kDa的多结构与蛋白质，PARP可以识别DNA的单链或双链缺口并与其快速结合，从而参与DNA损伤的信号传导。(D’Amours等，1999，Biochem.J.342：249-268)

目前，可以得出的结论是，PARP可以协调DNA修复和细胞凋亡，维持DNA的完整和稳定，PARP参与DNA有关的基因扩增、细胞分裂和分化、细胞凋亡、DNA碱基切除修复等功能，并且影响端粒长度和染色体稳定性(d’Adda di Fagagna等，1999，Nature Gen.，23(1)：76-80)。也有报道发现肿瘤细胞内PARP含量和活性均高于正常细胞。(shiobaraM等，J Gastroentero Hepatol，2001，16：338-344)

也有报道称PARP抑制剂具有抗血管生成的作用(Rajesh等，Biochem.Biophys.Res.Comm..350：1056-1062)。

在某些血管疾病、脓毒性休克、缺血性损伤、脓毒性休克、神经毒性、失血性休克、黄斑变性(AMD)、色素性视网膜中视觉相关的氧化性损伤和器官移植排斥的发病过程中，PARP-1也起到了作用(Cantoni等，Biochim.Biophys.Acta，1989，1014：1-7；Liaudet等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97(3)，2000，97(3)：10203-10208)。已经证明PARP抑制剂可以治疗或减轻PARP发挥作用而导致的急性疾病，例如胰腺炎及相关的肝和肺损伤(Mota等，Br.J.Pharmacol.，2007，151(7)：998-1005)。

多个小分子PARP抑制剂已经用于阐明聚ADP-核糖基化作用在DNA修复中的功能作用，在经过烷化剂处理的细胞中，对PARP进行抑制引起DNA链断裂和细胞死亡显著增加(Durcacz等，Nature.，283：593-596(1980)；Berger，N.A.，Radiation Research，101，4-14(1985))。

总之，PARP抑制剂已经证明在很多疾病模型中有效，这些疾病包括过敏性脑炎、关节炎、癌症(包括乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、淋巴瘤、黑色素瘤等)、多发性硬化症、器官移植、帕金森病、中枢神经系统炎症、肺间质纤维化、(眼睛、肠、肾和骨骼肌等)缺血再灌注、病毒感染、感染性休克、中风及其它神经创伤和眼色素层炎。特别是在肿瘤模型中，PARP抑制剂均已被证明能够增加癌症细胞的凋亡、限制肿瘤的生长、减少肿瘤转移、增强放疗和化疗作用，进而在临床中延长癌症病人存活时间。因此，研制PARP抑制剂有着现实的需要。

发明内容

本发明的目的是寻找具有有效的PARP抑制作用的新化合物。本发明人令人意外的发现，具有式I结构的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物具有有效的PARP抑制作用和/或具有良好的体内药物动力学行为。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了式I所示的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物、异构体、其药学上可接受的盐、溶剂合物、化学保护形式或者前药，

其中，R₁选自取代或未取代的C_1-7烃基，取代或未取代的C_3-7环烃基；R₂、R₃、R₄、R₅分别独立地选自氢、取代或未取代的C_1-7烃基，取代或未取代的C_3-7环烃基；R₆为-C(O)R₇，R₇选自取代或未取代的C_1-7烃基、取代或未取代的C_5-20芳基或杂芳基，取代或未取代的C_3-7环烃基，

根据本发明第一方面所述的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物、异构体、其药学上可接受的盐、溶剂合物、化学保护形式或者前药，其中所述的C_1-7烃基可以是C_1-7烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基；所述的C_3-7环烃基可以是C_3-7环烷基、C_3-7环烯基、C_3-7环炔基。

根据本发明第一方面所述的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物、异构体、其药学上可接受的盐、溶剂合物、化学保护形式或者前药，其中所述的C_1-7烃基可以选自但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、C₅支链烷基、己基、C₆支链烷基、庚基、环庚基、C₇支链烷基、乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基；所述的C_3-7环烃基可以选自但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环丙烯基、环丁烯基；所述的C_5-20芳基或杂芳基可以选自但不限于吡啶基、吡咯基、苯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、喹啉基。

根据本发明第一方面所述的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物、异构体、其药学上可接受的盐、溶剂合物、化学保护形式或者前药，其中所述的C_1-7烃基、C_3-7环烃基、C_5-20芳基或杂芳基的取代基可以选自但不限于卤素、羟基、烷氧基、氨基、酰胺基、烷基氨基，所述的卤素选自氟、氯或溴。

根据本发明第一方面所述的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物、异构体、其药学上可接受的盐、溶剂合物、化学保护形式或者前药，其中所述的药学上可接受的盐选自盐酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、富马酸盐、马来酸盐和苹果酸盐，或者这些盐的溶剂合物例如水合物。

根据本发明第一方面所述的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物、异构体、其药学上可接受的盐、溶剂合物、化学保护形式或者前药，在一个实施方案中，所述的R₁选自甲基、乙基；R₂、R₃、R₄、R₅分别独立地为氢；R₇选自甲基、三氟甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基。

根据本发明第一方面所述的式I所示的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物选自下列的化合物：

1-(环丙甲酰基)-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪；

1-(环丙甲酰基)-3(R)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪；

1-乙酰基-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪；

1-丙酰基-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪；

1-(异丙酰基)-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪；

1-(环丁甲酰基)-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪；

1-(环戊甲酰基)-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪；

1-(环己甲酰基)-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪；

1-(三氟乙酰基)-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪；

1-(环丙甲酰基)-3(S)-乙基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪。

本发明第二方面提供了本发明第一方面所述4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物的制备方法，其包括如下步骤：

a)由2-氟-5-(4-氧代-3，4-二氢-酞嗪-1-基甲基)苯甲酸合成中间体III；

b)中间体III在适宜酸存在下，脱除Boc保护基生成中间体IV；

c)中间体IV与适宜的酰氯、酸酐、活性酰胺或活性酯或者在适宜的偶联系统中与相应的羧酸类化合物反应得目标化合物式I；

其中，R选自-Cl或R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆各基团具有本发明第一方面任一实施方案中所定义的含义。

根据本发明第二方面所述的制备方法，其中步骤a)中2-氟-5-(4-氧代-3，4-二氢-酞嗪-1-基甲基)苯甲酸的羧基经活化剂活化后，再与单N-Boc保护的哌嗪反应得中间体III，其中所述的活化剂可选自草酰氯、氯化亚砜或N-羟基琥珀酰亚胺，在一个实施方案中，所述的活性剂为草酰氯。

根据本发明第二方面所述的制备方法，其中步骤b)中所述的适宜酸可选自三氟乙酸、盐酸、对甲基苯磺酸或硫酸，在一个实施方案中，所述的适宜酸为三氟乙酸。

根据本发明第二方面所述的制备方法，其中步骤c)中所述的适宜的酰氯、酸酐、活性酰胺或活性酯为R₆适宜的酰氯、酸酐、活性酰胺或活性酯。

根据本发明第二方面所述的制备方法，其中步骤c)中所述的适宜的偶联系统可选自偶联试剂与适宜碱，在有机溶剂中，0℃至所用有机溶剂沸点的温度范围内反应。

其中，所述的偶联试剂可选自2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐和羟基苯并三唑，或(二甲基氨基丙基)乙基碳二亚胺盐酸盐和羟基苯并三唑；所述的适宜碱可选自二异丙基乙基胺；所述的有机溶剂可选自N，N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷。

本发明第三方面涉及一种药物组合物，其包含本发明第一方面任一实施方案所述的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物、异构体、其药学上可接受的盐、溶剂合物、化学保护形式或者前药，以及任选的一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。任选地，该组合物还可以包含一种或多种活性物质。优选的活性物质为化疗剂。优选的化疗剂为替莫唑胺等。

本发明第四方面涉及本发明第一方面任一实施方案所述的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物、异构体、其药学上可接受的盐、溶剂合物、化学保护形式或者前药在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防哺乳动物(包括人)的与PARP(PARP-1和/或PARP-2)相关的疾病或病症。

本发明第四方面还涉及本发明第一方面任一实施方案所述的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物、异构体、其药学上可接受的盐、溶剂合物、化学保护形式或者前药在制备用于治疗和/或预防哺乳动物(包括人类)的与PARP相关的疾病或病症药物中的用途，其中，所述的与PARP相关的疾病或病症，包括血管疾病；脓毒性休克；缺血性损伤；再灌注损伤；神经毒性；出血性休克；炎性疾病；多发性硬化症；糖尿病的继发效应；心血管手术后的细胞毒性的急性治疗以及过敏性脑炎；关节炎；肿瘤或癌症(包括乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、淋巴瘤、黑色素瘤等)；器官移植；帕金森病；中枢神经系统炎症；肺间质纤维化；(眼睛、肠、肾和骨骼肌等)缺血再灌注；病毒感染、感染性休克；中风及其它神经创伤和眼色素层炎或者通过抑制PARP能够缓解的疾病。所述的肿瘤或癌症包括实体肿瘤如胆管、骨、膀胱、脑/中枢神经系统、乳房、结直肠、子宫内膜、胃、头和颈、肝、肺(尤其是非小细胞肺癌)、神经元、食道、卵巢、胰腺、前列腺、肾脏、皮肤、睾丸、甲状腺、子宫和外阴等的癌症，和非实体肿瘤如白血病、多发性骨髓瘤或淋巴瘤等。

本发明第五方面还涉及本发明第一方面任一实施方案所述的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物、异构体、其药学上可接受的盐、溶剂合物、化学保护形式或者前药用于制备在治疗哺乳动物癌症中作为辅助剂或者用于制备使肿瘤细胞对电离辐射或化疗剂变得敏感的药物中的用途，其中所述癌症或癌细胞可以是缺乏同源重组(homologous recombinational，HR)依赖性DNA双链断裂(double-strand break，DSB)修复路径或其含有一种或多种通过HR修复DNA DSB的能力相对与正常细胞而言减低或丧失。另外其中所述癌症或癌细胞也可以是缺乏BRCA1或BRCA2。需要指出的是，上述所指个体就编码HR依赖性DNA DSB修复路径组分的基因的突变而言是杂合的或者是BRCA1和/或BRCA2突变的杂合子。

本发明任一方面或该方面的任一实施方案所具有的特征同样适用于其它方面或该其它方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。

下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

在本发明的式I化合物中：

术语“卤素”或“卤代”是指氟、氯、溴和碘。

本发明中所采用的术语“烃基”具有本领域公知的一般含义，它们是直链或支链的烃基基团，取代的或未取代的，也可以是饱和不饱和的，因此术语“烃基”包括如下所述的亚类：烷基、烯基、炔基。例如但不限于甲基、乙基、丙基、三氟甲基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、烯丙基、丙烯基、丙炔基等。

本发明中所采用的术语“环烃基”具有本领域公知的一般含义，它们是取代的或未取代的，也可以是饱和不饱和的，因此术语“环烃基”包括如下所述的亚类：环烷基、环烯基、环炔基。例如但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等。

本发明中所采用的术语“芳基”和“杂芳基”和具有本领域公知的一般含义，传统意义上是指环状的芳族结构，即具有离域π电子轨道的环状结构。芳基可以只含有碳原子，或者可以含有碳原子和一个或多个包括但不限于氮、氧和硫原子的杂原子，芳基优选具有5或6个环原子。芳环可以在环上任何适当的位置含有一个或多个取代基。这些取代基选自卤素、卤代烷基、硝基、羟基、巯基、醚、硫醚、氨基、C_1-7烷基、C_1-7杂烷基和芳基。

在提及“烃基”、“环烃基”、“芳基”和“杂芳基”时，前缀(例如C_1-7、C_3-7、C_5-20)表示碳原子数目或环原子数目的范围。例如本文使用的术语“C_1-7烃基”是指具有1-7个碳原子的烃基。注意前缀可能根据其他限制而变化，例如对于不饱和烷基，其前缀必须至少是2，另外对于五元或六元的杂芳基，其前缀也可以小于5。

与本发明特别相关的是下述互变异构体对：

注意：在术语“异构体”中特别包括具有一个或多个同位素取代的化合物。例如，H可以是任意同位素形式，包括¹H、²H(D)和³H(T)；C可以是任意同位素形式，包括¹²C、¹³C和¹⁴C；O可以是任意同位素形式，包括¹⁶O和¹⁸O；等等。在术语“异构体”中还特别包括R、S异构体的混合物。

除非另有指定，对特定化合物的称谓包括全部这样的异构体形式，包括其(完全或部分)外消旋混合物和其他混合物。制备(例如不对称合成)和分离(例如分步结晶和色谱法)这类异构体形式的方法是本领域已知的，或者以已知方式调整本文的方法或已知方法容易获得。

在本发明制备式I所示的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物的方法中，反应所用的各种原材料是本领域技术人员根据已有知识可以制备得到的，或者是可以通过文献公知的方法制得的，或者是可以通过商业购得的。以上反应方案中所用的中间体、原材料、试剂、反应条件等均可以根据本领域技术人员已有知识可以作适当改变的。或者，本领域技术人员也可以根据本发明第二方面方法合成本发明未具体列举的其它式I所示的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物。

本发明式I所示的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物可以与其它药物活性成分组合使用，只要它不产生其他不利作用，例如过敏反应。

本发明式I所示的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物活性化合物可以单独作为抗癌药物使用，或者可以与一种或多种其他抗肿瘤药物联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时、顺序或隔开给药来实现。

本文所用的术语“组合物”意指包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。

除非另有指定，对特定化合物的称谓也包括其离子、盐、溶剂合物和被保护的形式。

可能适宜或者需要制备、纯化和/或处理相应的活性化合物的盐，例如药学上可接受的盐。药学尚可接受的盐的实例Berge等人已有讨论，“药学上可接受的盐”，J.Pharm.Sci.，66，1-19(1977)。

本发明的化合物可以以衍生自无机酸或有机酸的药学上可接受的盐的形式使用。术语“药学上可接受的盐”指在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的效果/风险比相称的盐。药学上可接受的盐是本领域公知的。所述盐可通过使本发明化合物的游离碱官能度与合适的有机酸反应，在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备或者单独制备。代表性的酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。同样，碱性含氮基团可用以下物质季铵化：低级烷基卤化物如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯如硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯；长链卤化物如癸基、十二烷基、十四烷基和十八烷基的氯化物、溴化物和碘化物；芳基烷基卤化物如苄基溴和苯乙基溴及其他。因此得到可溶于或分散于水或油的产品。可用来形成药学上可接受的酸加成盐的酸实例包括无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及有机酸如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。

碱加成盐可通过使本发明化合物的含羧酸部分与合适的碱反应，在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，所述的碱例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐，或者氨或有机伯胺、仲胺或叔胺。

药学上可接受的盐还包括但不限于基于碱金属或碱土金属的阳离子如锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等，以及无毒的季铵和胺阳离子，包括铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、三乙基铵、二乙基铵和乙基铵等。可用于形成碱加成盐的其他代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。

本发明式I所示的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物还包括其异构体、消旋体、对映体、非对映体、对映体富集物、溶剂合物和酯，本发明式I所示的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物以及它的异构体、消旋体、对映体、非对映体、对映体富集物、溶剂合物和酯还可以形成溶剂合物，例如水合物、醇合物等。上述化合物还可以是前药或可在体内代谢变化后释放出所述活性成分的形式。选择和制备适当的前药衍生物是本领域技术人员公知技术。一般来说，对于本发明的目的，与药学上可接受的溶剂如水、乙醇等的溶剂合物形式与非溶剂合物形式相当。

可改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平，以便所得的活性化合物量能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体化合物的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

当用于上述治疗和/或预防或其他治疗和/或预防时，治疗和/或预防有效量的一种本发明化合物可以以纯形式应用，或者以药学上可接受的酯或前药形式(在存在这些形式的情况下)应用。或者，所述化合物可以以含有该目的化合物与一种或多种药物可接受赋形剂的药物组合物给药。词语“治疗和/或预防有效量”的本发明化合物指以适用于任何医学治疗和/或预防的合理效果/风险比治疗障碍的足够量的化合物。但应认识到，本发明化合物和组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明式I化合物用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001～1000mg/kg体重/天，例如介于0.01～100mg/kg体重/天，例如介于0.01～10mg/kg体重/天。

运用本领域技术人员熟悉的药物载体可以制备成含有效剂量的本发明化合物的药物组合物。因此本发明还提供包含与一种或多种无毒药物可接受载体配制在一起的本发明化合物的药物组合物。所述药物组合物可特别专门配制成以固体或液体形式供口服给药、供胃肠外注射或供直肠给药。

所述的药物组合物可配制成许多剂型，便于给药，例如，口服制剂(如片剂、胶囊剂、溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射水可立即使用)。所述的药物组合物中载体包括：口服制剂使用的粘合剂(如淀粉，通常是玉米、小麦或米淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮)，稀释剂(如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素，和/或甘油)，润滑剂(如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其盐，通常是硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇)，以及如果需要，还含有崩解剂，如淀粉、琼脂、海藻酸或其盐，通常是海藻酸钠，和/或泡腾混合物，助溶剂、稳定剂、悬浮剂、色素、矫味剂等，可注射的制剂使用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可以将其配制成肠衣片剂。

更具体地说，本发明的药物组合物可通过口服、直肠、胃肠外、池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过散剂、软膏剂或滴剂)、口颊给予人类和其他哺乳动物，或者作为口腔喷雾剂或鼻腔喷雾剂给予。本文所用术语“胃肠外”指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输液的给药方式。

适合于胃肠外注射的组合物可包括生理上可接受的无菌含水或非水溶液剂、分散剂、混悬剂或乳剂，及供重构成无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌散剂。合适的含水或非水载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、植物油(如橄榄油)、可注射有机酯如油酸乙酯及它们的合适混合物。

这些组合物也可含有辅料，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，可确保防止微生物的作用。还期望包括等渗剂，例如糖类、氯化钠等。通过使用能延迟吸收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶，可达到可注射药物形式的延长吸收。

混悬剂中除活性化合物外还可含有悬浮剂，例如乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨醇、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶或者这些物质的混合物等。

在一些情况下，为延长药物的作用，期望减慢皮下或肌内注射药物的吸收。这可通过使用水溶性差的晶体或无定形物质的液体混悬剂来实现。这样，药物的吸收速度取决于其溶解速度，而溶解速度又可取决于晶体大小和晶型。或者，胃肠外给药的药物形式的延迟吸收通过将该药物溶解于或悬浮于油媒介物中来实现。

可注射贮库制剂形式可通过在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微胶囊基质来制备。可根据药物与聚合物之比和所采用的具体聚合物的性质，对药物释放速度加以控制。其他生物可降解聚合物的实例包括聚原酸酯类和聚酐类。可注射贮库制剂也可通过将药物包埋于能与身体组织相容的脂质体或微乳中来制备。

可注射制剂可例如通过用滤菌器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述固体组合物可在临用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质。

本发明化合物或其组合物可用口服方法或非胃肠道给药方式。口服给药可以是片剂、胶囊剂、包衣剂，肠道外用药制剂有注射剂和栓剂等。这些制剂是按照本领域的技术人员所熟悉的方法制备的。为了制造片剂、胶囊剂、包衣剂所用的辅料是常规用的辅料，例如淀粉、明胶、阿拉伯胶，硅石，聚乙二醇，液体剂型所用的溶剂如水、乙醇、丙二醇、植物油(如玉米油、花生油、橄榄油等)。含有本发明化合物的制剂中还有其它辅料，例如表面活性剂，润滑剂，崩解剂，防腐剂，矫味剂和色素等。在片剂、胶囊剂、包衣剂、注射剂和栓剂中含有本发明式I所示的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物的剂量是以单元剂型中存在的化合物量计算的。在单元剂型中本发明式I所示的4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物一般含量为1～5000mg，优选的单元剂型含有10～500mg，更优选的单元剂型含有20～300mg。具体地说，本发明可以提供的供口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性的药物可接受赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；c)保湿剂如甘油；d)崩解剂如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液阻滞剂如石蜡；f)吸收加速剂如季铵化合物；g)湿润剂如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；h)吸附剂如高岭土和膨润土以及i)润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和它们的混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型中也可包含缓冲剂。

相似类型的固体组合物使用赋形剂例如乳糖及高分子量聚乙二醇等，也可用作软胶囊和硬胶囊中的填充物。

片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可与包衣和壳料如肠溶衣材和医药制剂领域公知的其他衣材一起制备。这些固体剂型可任选含有遮光剂，且其组成还可使其只是或优先地在肠道的某个部位任选以延迟方式释放活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包括高分子物质和蜡类。如果适合，活性化合物也可与一种或多种上述赋形剂配成微囊形式。

供口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。液体剂型除含有活性化合物外还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。口服组合物除包含惰性稀释剂外还可包含辅料，例如湿润剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香味剂。

供直肠或阴道给药的组合物优选是栓剂。栓剂可通过将本发明化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备，它们在室温下为固体，但在体温下则为液体，因此可在直肠腔或阴道腔内熔化而释放出活性化合物。

本发明的化合物及其组合物还考虑用于局部给药。供局部给予本发明化合物的剂量形式包括散剂、喷雾剂、软膏剂和吸入剂。在无菌条件下将活性化合物与药学上可接受的载体和任何所需的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。眼用制剂、眼软膏剂、散剂和溶液剂也被考虑在本发明范围内。

本发明化合物也可以脂质体形式给药。如本领域所公知，脂质体通常用磷脂或其他脂类物质制得。脂质体由分散于含水介质中的单层或多层水化液晶所形成。任何能够形成脂质体的无毒、生理上可接受和可代谢的脂质均可使用。脂质体形式的本发明组合物除含有本发明化合物外，还可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂类是天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，它们可单独或者一起使用。形成脂质体的方法是本领域公知的。

具体实施方式

下面通过具体的制备实施例和生物学实验进一步说明本发明，但是，应当理解，这些实施例和生物学实验仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应将其理解为用于以任何形式限制本发明。

虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，所用的材料和操作方法是本领域公知的。

在本中，除非另外说明，其中：(i)温度以摄氏度(℃)表示，操作在室温或温度环境下进行；(ii)有机溶剂用无水硫酸钠干燥，溶剂的蒸发用旋转蒸发仪减压蒸发，浴温不高于60℃；(iii)反应过程用薄层色谱(TLC)跟踪；(iv)终产物具有满意的质子核磁共振光谱(¹H-NMR)和质谱(MS)数据；(v)其中部分化合物所测旋光数据所用的溶液为甲醇，温度为20℃。

4-(取代苄基)-1(2H)-2，3-二氮杂萘酮类衍生物中间体的制备

1、3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪三氟乙酸盐(中间体IV)的制备

a)1-(叔丁氧甲酰基)-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪(中间体III)的制备

室温下，取2-氟-5-(4-氧代-3，4-二氢-酞嗪-1-基甲基)苯甲酸3.0g(10mmol)混悬于100ml二氯甲烷中，在向其中缓慢加入草酰氯5ml(55mmol)、N，N-二甲基甲酰胺2滴，保持室温反应5h，真空蒸干除去溶剂，以(20ml×3)甲苯共蒸除去残留的草酰氯后，再向反应瓶中加入50ml二氯甲烷密封备用；另取2.0g(10mmol)4-Boc-2(S)-甲基哌嗪加入到50ml二氯甲烷和2.8ml(20mmol)三乙胺，保持反应瓶外温度0～5℃下，向其中滴加2-氟-5-(4-氧代-3，4-二氢-酞嗪-1-基甲基)苯甲酰氯的二氯甲烷溶液，滴加完毕后，升至室温反应5h，TLC(展开剂：二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)检测反应完全。以20ml蒸馏水、20ml饱和食盐水洗涤，将有机层以无水硫酸钠干燥，过夜后蒸干得到淡黄色固体(中间体III)4.1g(产率85％)。

ES-API(m/z)：[M+Na]⁺503.4。

b)3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪三氟乙酸盐(中间体IV)的制备

将1g(2mmol)1-(叔丁氧甲酰基)-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪(中间体III)溶于20ml二氯甲烷和10ml三氟乙酸的混合溶液中，室温反应1h，TLC(展开剂：二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)检测反应完全。蒸干除去溶剂，得到淡黄色固体(中间体IV)0.97g(产率93％)。

ES-API(m/z)：[M+H]⁺381.2。

2、3(R)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪三氟乙酸盐(中间体IV)的制备

a)1-(叔丁氧甲酰基)-3(R)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪的(中间体III)制备

室温下，取2-氟-5-(4-氧代-3，4-二氢-酞嗪-1-基甲基)苯甲酸3.0g(10mmol)混悬于100ml二氯甲烷中，在向其中缓慢加入草酰氯5ml(55mmol)、N，N-二甲基甲酰胺2滴，保持室温反应5h，真空蒸干除去溶剂，以(20ml×3)甲苯共蒸除去残留的草酰氯后，再向反应瓶中加入50ml二氯甲烷密封备用；另取2.0g(10mmol)4-Boc-2(R)-甲基哌嗪加入到50ml二氯甲烷和2.8ml(20mmol)三乙胺，保持反应瓶外温度0～5℃下，向其中滴加2-氟-5-(4-氧代-3，4-二氢-酞嗪-1-基甲基)苯甲酰氯的二氯甲烷溶液，滴加完毕后，升至室温反应5h，TLC(展开剂DCM∶MeOH＝20∶1)检测反应完全。以20ml蒸馏水、20ml饱和食盐水洗涤，将有机层以无水硫酸钠干燥，过夜后蒸干得到淡黄色固体(中间体III)4.1g(产率85％)。

ES-API(m/z)：[M+Na]⁺503.4。

b)3(R)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪三氟乙酸盐(中间体IV)的制备

将1g(2mmol)1-(叔丁氧甲酰基)-3(R)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪(中间体III)溶于20ml二氯甲烷和10ml三氟乙酸的混合溶液中，室温反应1h，TLC(展开剂：二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)检测反应完全。蒸干除去溶剂，得到淡黄色固体(中间体IV)0.98g(产率95％)。

ES-API(m/z)：[M+H]⁺381.2。

3、3(S)-乙基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪三氟乙酸盐(中间体IV)的制备

a)1-(叔丁氧甲酰基)-3(S)-乙基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪(中间体III)的制备

室温下，取2-氟-5-(4-氧代-3，4-二氢-酞嗪-1-基甲基)苯甲酸3.0g(10mmol)混悬于100ml二氯甲烷中，在向其中缓慢加入草酰氯5ml(55mmol)、N，N-二甲基甲酰胺2滴，保持室温反应5h，真空蒸干除去溶剂，以(20ml×3)甲苯共蒸除去残留的草酰氯后，再向反应瓶中加入50ml二氯甲烷密封备用；另取2.0g(10mmol)4-Boc-2(S)-乙基哌嗪加入到50ml二氯甲烷和2.8ml(20mmol)三乙胺，保持反应瓶外温度0～5℃下，向其中滴加2-氟-5-(4-氧代-3，4-二氢-酞嗪-1-基甲基)苯甲酰氯的二氯甲烷溶液，滴加完毕后，升至室温反应5h，TLC(展开剂：二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)检测反应完全。以20ml蒸馏水、20ml饱和食盐水洗涤，将有机层以无水硫酸钠干燥，过夜后蒸干得到淡黄色固体(中间体III)4.1g(产率85％)。

E S-API(m/z)：[M+H]⁺495.3。

b)3(S)-乙基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪三氟乙酸盐(中间体IV)的制备

将1g(2mmol)1-(叔丁氧甲酰基)-3(S)-乙基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪(中间体III)溶于20ml二氯甲烷和10ml三氟乙酸的混合溶液中，室温反应1h，TLC(展开剂：二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)检测反应完全。蒸干除去溶剂，得到淡黄色固体(中间体IV)0.92g(产率90％)。

ES-API(m/z)：[M+H]⁺395.2。

实施例1：1-(环丙甲酰基)-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪(化合物1)的制备

化合物1

将0.5g(0.9mmol)3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪三氟乙酸盐和0.6ml(3.9mmol)三乙胺溶于20ml二氯甲烷中，保持瓶外温度0～5℃下滴加0.12ml(1.3mmol)环丙基甲酰氯，升至室温反应5h，TLC(展开剂：二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)检测反应完全，以15ml蒸馏水、15ml饱和食盐水洗涤，将有机层以无水硫酸钠干燥，过夜后蒸干得到淡黄色固体，柱层析得纯品(化合物1)0.36g(产率80％)。纯度：98.68％。

¹H-NMR(600MHz，DMSO-d₆，δ_ppm)：12.59(s，1H)，8.27～8.25(m，1H)，8.00～7.94(m，1H)，7.92～7.86(m，1H)，7.46～7.40(br，1H)，7.40～7.32(br，1H)，7.28～7.20(m，1H)，4.41(s，2H)，4.70～4.00(m，3H)，3.60～2.60(m，4H)，2.10～1.82(m，1H)，1.40～0.70(m，4H)，0.50～0.30(br，3H)。

ES-API(m/z)：[M+H]⁺449.2，[α]_D^20℃＝27.4°。

实施例2：1-(环丙甲酰基)-3(R)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪(化合物2)的制备

化合物2

所述标题化合物根据实施例(1)的方法，以4-Boc-2(R)-甲基哌嗪和环丙基甲酰氯为原料制备，得产物化合物2，纯度：98.68％。

ES-API(m/z)：[M+H]⁺449.3，[α]_D^20℃＝-27.5°。

实施例3：1-乙酰基-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪(化合物3)的制备

化合物3

所述标题化合物根据实施例(1)的方法，以乙酸酐为原料制备，得产物化合物3，纯度：99.17％。

¹H-NMR(600MHz，DMSO-d₆，δ_ppm)：12.61(s，1H)，8.29～8.26(m，1H)，8.00～7.95(m，1H)，7.92～7.86(m，1H)，7.86～7.82(m，1H)，7.46-7.41(m，1H)，7.40～7.33(m，1H)，7.28～7.21(m，1H)，4.34(s，2H)，4.70～3.50(m，3H)，3.50～2.58(m，4H)，2.10～1.92(m，3H)，1.20～0.90(m，3H)。

ESI-MS(m/z)：[M+H]⁺423.5。

实施例4：1-丙酰基-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪(化合物4)的制备

化合物4

所述标题化合物根据实施例(1)的方法，以丙酸酐为原料制备，得产物化合物4，纯度：99.39％。

¹H-NMR(600MHz，DMSO-d₆，δ_ppm)：12.65(s，1H)，8.31～8.29(m，1H)，8.10～7.97(m，1H)，7.95～7.89(m，1H)，7.89～7.84(m，1H)，7.49-7.43(m，1H)，7.43～7.34(m，1H)，7.31～7.23(m，1H)，4.36(s，2H)，4.76～3.60(m，3H)，3.50～2.58(m，4H)，2.51～2.21(m，2H)，1.21～0.98(m，6H)。

E S-API(m/z)：[M+H]⁺437.3。

实施例5：1-异丙酰基-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪(化合物5)的制备

化合物5

所述标题化合物根据实施例(1)的方法，以异丁酸酐为原料制备，得产物化合物5，纯度：98.03％。

¹H-NMR(600MHz，DMSO-d₆，δ_ppm)：12.60(s，1H)，8.28～8.25(m，1H)，7.99～7.94(m，1H)，7.92～7.86(m，1H)，7.86～7.82(m，1H)，7.46-7.41(m，1H)，7.40～7.33(m，1H)，7.28～7.21(m，1H)，4.30(s，2H)，4.74～3.50(m，3H)，3.30～2.57(m，4H)，1.25～1.14(m，1H)，1.10～0.85(m，9H)。

ES-API(m/z)：[M+H]⁺451.3。

实施例6：1-(环丁甲酰基)-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪(化合物6)的制备

化合物6

所述标题化合物根据实施例(1)的方法，以环丁基甲酰酰氯为原料制备，得产物化合物6，纯度：93.40％。

¹H-NMR(600MHz，DMSO-d₆，δ_ppm)：12.63(s，1H)，8.30～8.26(m，1H)，8.00～7.95(m，1H)，7.92～7.86(m，1H)，7.86～7.82(m，1H)，7.47-7.41(m，1H)，7.41～7.31(m，1H)，7.29～7.21(m，1H)，4.34(s，2H)，4.78～3.50(m，3H)，3.50～2.56(m，4H)，2.24～1.68(m，7H)，1.18～0.90(m，3H)。

ES-API(m/z)：[M+H]⁺463.3。

实施例7：1-(环戊甲酰基)-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪(化合物7)的制备

化合物7

所述标题化合物根据实施例(1)的方法，以环戊基甲酰氯为原料制备，得产物化合物7，纯度：98.40％。

¹H-NMR(600MHz，DMSO-d₆，δ_ppm)：12.61(s，1H)，8.29～8.25(m，1H)，8.00～7.94(m，1H)，7.93～7.86(m，1H)，7.86～7.81(m，1H)，7.47-7.41(m，1H)，7.41～7.31(m，1H)，7.29～7.20(m，1H)，4.34(s，2H)，4.76～3.50(m，3H)，3.30～2.58(m，4H)，1.88～1.46(m，9H)，1.20～0.90(m，3H)。

E S-API(m/z)：[M+H]⁺477.3。

实施例8：1-(环己甲酰基)-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪(化合物8)的制备

化合物8

所述标题化合物根据实施例(1)的方法，以环己基甲酰氯为原料制备，得产物化合物8，纯度：96.74％。

¹H-NMR(600MHz，DMSO-d₆，δ_ppm)：12.60(s，1H)，8.29～8.25(m，1H)，8.00～7.93(m，1H)，7.93～7.86(m，1H)，7.86～7.81(m，1H)，7.47-7.39(m，1H)，7.39～7.30(m，1H)，7.28～7.20(m，1H)，4.33(s，2H)，4.75～3.50(m，3H)，3.50～2.50(m，4H)，1.74～1.54(m，6H)，1.48～1.20(m，5H)，1.20～1.00(m，3H)。

ES-API(m/z)：[M+H]⁺491.3。

实施例9：1-三氟乙酰基-3(S)-甲基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪(化合物9)的制备

化合物9

所述标题化合物根据实施例(1)的方法，以三氟乙酸酐为原料制备，得产物化合物9，纯度：97.85％。

¹H-NMR(600MHz，DMSO-d₆，δ_ppm)：12.61(s，1H)，8.30～8.25(m，1H)，8.00～7.94(m，1H)，7.93～7.87(m，1H)，7.86～7.82(m，1H)，7.48-7.42(m，1H)，7.41～7.35(m，1H)，7.30～7.22(m，1H)，4.34(s，2H)，4.86～3.85(m，3H)，3.80～2.90(m，4H)，2.10～1.90(m，3H)，1.21～0.92(m，3H)。

E S-API(m/z)：[M+H]⁺477.2。

实施例10：1-(环丙甲酰基)-3(S)-乙基-4-[5-[(3，4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪(化合物10)的制备

化合物10

所述标题化合物根据实施例(1)的方法，以4-Boc-2(S)-乙基哌嗪为原料制备，得产物化合物10，纯度：98.85％。

¹H-NMR(600MHz，DMSO-d₆，δ_ppm)：12.61(s，1H)，8.30～8.24(m，1H)，8.01～7.93(m，1H)，7.93～7.85(m，1H)，7.85～7.81(m，1H)，7.51-7.20(m，3H)，4.34(s，2H)，4.64～3.56(m，3H)，3.50～2.50(m，4H)，2.05～1.15(m，5H)，0.95～0.60(m，5H)。

ES-API(m/z)：[M+H]⁺463.3。

生物学实验

可以使用以下试验来测定本发明所述化合物对多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)的抑制作用以及在体内对人结肠癌细胞SW620裸鼠移植瘤的生长抑制作用。

实验中使用的激酶反应缓冲液、PARP酶和底物DNA、NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)、荧光标记物Resazurin及Cycling enzyme、终止液均来源于TREVIGENINC.公司PARP分析试剂盒(#4690-096-K)。

A)PARP酶活性分析

体外PARP酶分析用TREVIGEN INC.公司PARP分析试剂盒(#4690-096-K)检测，操作步骤参照试剂盒说明书。该方法可以在体外检测PARP酶对底物DNA的多聚ADP核糖修饰作用，当在反应体系中加入待测化合物，即可检测化合物对PARP酶的抑制作用。室温下激酶反应缓冲液中温育PARP酶和底物DNA、NAD以及加入实施例1-10中制备的化合物1-10，室温避光孵育30分钟后，加入荧光标记物Resazurin及Cycling enzyme，继续室温孵育45分钟，加入终止液终止反应。在Molecular Device公司的酶标仪上检测荧光，激光波长544nm，发射波长590nm，计算IC₅₀值(nM)，结果如表1所示。

表1.本发明化合物对PARP酶活性的抑制作用

  测试物  IC₅₀(nM)  化合物1  5  化合物2  55  化合物3  53  化合物4  1  化合物5  10  化合物6  1  化合物7  4  化合物8  1  化合物9  15  化合物10  50

从上述实验结果中可以看到，本发明化合物对于PARP酶活性具有较强的抑制活性。

B)本发明化合物细胞水平与替莫唑胺(TMZ)合用的增敏试验

当与作用于DNA的细胞毒类药物合用时，PARP抑制剂可以明显增加细胞毒药物的作用，该方法检测本发明化合物与替莫唑胺(TMZ)合用的增敏作用。

人非小细胞肺癌细胞A549(购自美国模式培养物集存库Americantype culture collection)在含10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和非必需氨基酸的F12培养基中，在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养细胞，应用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)从细胞培养瓶中收获细胞。细胞以2000/孔(1ml培养基)加入96孔细胞培养板在37℃、5％CO₂细胞培养箱中贴壁培养过夜，换含不同浓度待测化合物(化合物1-10)及替莫唑胺(替莫唑胺用量为50mg/kg)的新鲜培养基，DMSO(二甲基亚砜，Dimethyl sulfoxide，DMSO)的最终浓度为0.25％，将细胞培养板在37℃，5％的CO₂条件下培养72小时，然后三氯乙酸固定细胞，用SRB进行染色，测定565nm处的吸光度；整理数据，计算抑制活性及相应的IC₅₀及增效倍数，结果如表2所示。其中，增效倍数(chemosensitizationratio，CR)＝IC₅₀(TMZ)/IC50(TMZ+0.1μM TMZ)。

表2.在A549细胞上，本发明化合物0.1μM对替莫唑胺(TMZ，50mg/kg )的增敏作用

  测试物  IC₅₀(μM)  增效倍数  TMZ  ＞500  -  TMZ+0.1μM化合物1  207.9  ＜2.4  TMZ+0.1μM化合物2  411  ＜1.2  TMZ+0.1μM化合物3  302  ＜1.6  TMZ+0.1μM化合物4  155.3  ＜3.2  TMZ+0.1μM化合物5  135.2  ＜3.7  TMZ+0.1μM化合物6  96.9  ＜5.2  TMZ+0.1μM化合物7  79.8  ＜6.3  TMZ+0.1μM化合物9  168.9  ＜3  TMZ+0.1μM化合物10  329  ＜1.5

从上述实验结果中可以看到，本发明化合物具有较强的生物学活性，许多化合物均可显著增加TMZ的细胞毒作用。

C)体内药效评价

BALB/cA裸小鼠，雌性，4-6周龄，体重22±2g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，SPF级环境饲养。

将体外培养的人结肠癌细胞SW620细胞(购自美国模式培养物集存库American type culture collection)接种于裸鼠右侧腋窝皮下，每只约接种5×10⁶个细胞，接种于裸小鼠右侧腋窝下。用游标卡尺测量瘤径，待肿瘤生长至100～200mm3后将动物随机分组。化合物1-10(均为10mg/kg)、替莫唑胺(50mg/kg)、化合物1-10(均为10mg/kg)分别与替莫唑胺(50mg/kg)合用灌胃给药，每天一次，连续5天，对照组给等量溶剂(与替莫唑胺等量的溶剂)。五天给药期及45天恢复观察期，每周测量小鼠体重和瘤径2～3次。根据测量数据计算肿瘤体积和相对肿瘤体积，肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示肿瘤长径和短径。据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为试验开始时的肿瘤体积，Vt为每一次测量的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％，TRTV为治疗组RTV；CRTV为阴性对照组(即溶剂对照组)RTV，相对肿瘤生长抑制率(即抑瘤率)＝(1-T/C)×100％。结果如表3所示。

表3.本发明化合物对SW620裸小鼠移植瘤的治疗作用

注：D₁₄：指开始给药后第14天；D₅₀：指开始给药后第50天。

结果显示：化合物1、化合物5、化合物6、化合物7单用时，对于SW620的生长并无明显影响，当其与细胞毒类药物替莫唑胺合用时，可以明显增强替莫唑胺的药效，减缓的肿瘤恢复生长的时间。以上体内实验结果显示，本发明化合物对细胞毒类化疗药具有较好的增敏效果。