使用乳液超临界流体萃取过程以生物可降解聚合物制备大豆异黄酮控释颗粒的方法

摘要

本文描述了以生物可降解聚合物制备大豆异黄酮(例如染料木黄酮)的控释颗粒的方法。该方法采用乳液超临界流体萃取(SFEE)过程用于将大豆异黄酮包封进入生物可降解聚合物基质(例如PLGA)中形成适宜以控释方式口服施用或者可吸入施用的且具有改善的大豆异黄酮生物利用度的颗粒。本文还公开了用于使用SFEE过程以生物可降解聚合物制备大豆异黄酮的控释颗粒的系统。

说明书

相关申请的交叉引用 

本申请要求于2012年1月20日提交的、申请号为61/632,216的美国临时申请的优先权，该美国临时申请的公开内容通过引用并入本文。 

技术领域

本发明涉及以生物可降解聚合物制备大豆异黄酮(大豆或大豆产品特征性的的一个类黄酮亚组)的控释颗粒的方法。具体而言，本发明涉及通过使用乳液超临界流体萃取(supercritical fluid extraction of emulsion，SFEE)过程制备固体形式的大豆异黄酮，例如染料木黄酮，及其衍生物的方法，用于将大豆异黄酮包封进入生物可降解聚合物基质内以形成适宜口服施用或者可吸入施用并具有改善的生物利用度的控释颗粒。 

背景技术

口服途径是最常用的药物施用途径。通过口服施用递送的药物常常是散剂、片剂或胶囊剂的形式，并且首先溶解于沿胃肠道的胃肠液内，然后溶解的药物穿过胃肠粘膜。然而，口服途径不适用于许多药物分子，因为由于它们的低水可溶性、差的胃肠粘膜通透性、首过代谢和胃肠环境中的不稳定性导致难以接受的低生物利用度。 

大豆异黄酮是具有与雌性激素-(雌激素-)相似的化学结构和生理功能的植物雌激素。因此，它们可以缓解雌激素缺乏疾病，尤其是更年期症状，包括热潮红、骨质疏松症和心血管问题。目前，在大豆和大豆产品中已经表征了12种主要的异黄酮，包括染料木黄酮、大豆黄素和黄豆黄素(糖苷配基)，以及它们各自的丙二酰基、乙酰基和葡糖基形式(葡糖苷)(Apers等，2004；Rostagno等，2004)。染料木黄酮已经广泛地用作保健品以缓解雌激素缺乏疾病，尤其是更年期症状，但是由于它们的生物利用度差妨碍了其治疗效果。它们生物利用度低的两个可能的原因是：它们的水溶解性低和首过代谢强。研究发现在脂质的或者基于聚 合物的纳米颗粒中结合似乎明显有助于口服递送类黄酮，因为这些颗粒可以保护药物不在胃肠道内降解并且也保护药物不在肝脏内首过代谢(Leonarduzzi等，2010)。其他研究者已经尝试了多种纳米方法，包括通过自发乳化将染料木黄酮掺入到由蛋黄卵磷脂、中链甘油三酯(MCT)或辛基十二醇(ODD)和水组成的局部纳米乳制剂中(Silva等，2009)。与制备聚合物颗粒的常规方法相比，称作乳液超临界流体萃取过程(SFEE)的一种有前途的技术，显示具有特别的优势，其组合了使用不同乳液系统的颗粒制剂的灵活性与使用超临界流体大规模连续萃取的效率。该方法在过去5年中快速发展并且吸引了大量的注意力(Chattopadhyay等，2006；Shekunov等，2006；Della Porta等，2008；Kluge等，2009；Kluge等，2009)。 

发明内容

本发明的第一个目的是使用生物可降解聚合物制备大豆异黄酮的控释颗粒的方法。本发明的方法包括使用乳液超临界流体萃取(SFEE)过程将大豆异黄酮包封进入生物可降解聚合物基质中形成控释颗粒。本发明方法能够包封进入生物可降解聚合物基质中形成控释颗粒的大豆异黄酮包括染料木黄酮、大豆黄素或黄豆黄素(糖苷配基)，或者它们各自的丙二酰基、乙酰基或葡糖基形式(葡糖苷)。本发明方法还包括在SFEE过程之前制备包含大豆异黄酮(例如染料木黄酮)的水溶液和生物可降解聚合物的有机溶液的复乳液。示例性的本发明的生物可降解聚合物是聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。 

本发明的第二个目的是通过使用如本文所述的乳液超临界流体萃取(SFEE)过程将染料木黄酮包封入PLGA基质中制备的包含大豆异黄酮的PLGA颗粒(例如包含染料木黄酮的PLGA颗粒)。所得到的颗粒具有受控的药物释放特性并因此改善所包封大豆异黄酮的生物利用度。 

附图说明

图1是描述乳液超临界流体萃取(SFEE)过程实验设置的示意图。 

图2是未处理染料木黄酮(左图)和在SFEE过程之后用PLGA基质包封的染料木黄酮(右图)的SEM图像。 

图3是未处理染料木黄酮相对于包封的染料木黄酮的释放曲线。 

定义 

如本文所使用，术语“超临界流体”指超临界的或者接近超临界的CO₂。 

如本文所使用，术语“大豆异黄酮”指大豆糖苷配基异黄酮，例如染料木黄酮、大豆黄素和黄豆黄素等，或者它们各自的丙二酰基、乙酰基和葡糖基形式/大豆葡糖苷异黄酮，例如大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、乙酰基大豆苷、乙酰基黄豆黄苷、乙酰基染料木苷、丙二酰基大豆苷、丙二酰基黄豆黄苷和丙二酰基染料木苷等。 

如本文所使用，术语“乳滴”指水/油/水乳滴。 

如本文所使用，术语“有机溶剂”指二氯甲烷。 

具体实施方式

在下列实施例中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)用作生物可降解聚合物以包封大豆异黄酮，以致于当经口施用或者通过吸入施用于受试者时提供大豆异黄酮的控释系统。在下列实施例中，染料木黄酮用作被包封入生物可降解聚合物内的大豆异黄酮。因此通过如本文所述的SFEE过程制备包含染料木黄酮的PLGA颗粒。在SFEE过程之前首先制备具有所需配方的复乳液。如何制备复乳液的实施例描述于实施例1中。在SFEE过程期间，形成的每一乳滴可以看作“微型气体抗溶剂沉淀器”，其中在去除有机溶剂之后发生过饱和、颗粒成核和颗粒生长。结果，可以得到小尺寸的球形颗粒。接着进行体外药物释放实验以证实聚合物基质保护染料木黄酮的可行性。应当注意，尽管PLGA和染料木黄酮在下列实施例中分别用作生物可降解聚合物和大豆异黄酮，但是它们并不旨在限制本发明范围，而仅仅是例证的目的。还应当理解，任何适宜等效物可以用于替代如下列实施例中所述的成分/化合物/分子，只要是根据本发明的方法被适宜的等效物替代后的技术效果与下列实施例中所述的技术效果基本上相同即可，和/或不会因为替代而脱离权利要求书的精神和范围即可。 

本发明方法主要采用乳液超临界流体萃取(SFEE)过程，该过程旨在使用超临界流体从复乳液中萃取有机溶剂，以便将大豆异黄酮(例如染料木黄酮)包封进入生物可降解聚合物基质(例如PLGA基质)中，在萃取之后形成控释颗粒。在SFEE过程中使用的超临界流体是超临界的CO₂。随后的体外药物释放研究表明，与未处理的染料木黄酮相比，染料木黄酮从包含染料木黄酮的PLGA颗粒的释 放缓慢地多，这表明包含染料木黄酮的PLGA颗粒是用于长期药物递送的有前途的系统。该研究还显示基于PLGA特性，所包封的染料木黄酮的控释特性将导致生物利用度改善。除了染料木黄酮之外，本发明方法可以用于将许多其他活性药物成分与任意的生物可降解聚合物结合以产生适宜口服施用和吸入的具有改善的预期活性成分生物利用度的控释系统。 

实施例 

现在通过参考下列实施例更加具体地解释本发明。给出这些实施例仅为了更好地理解本发明，并且无论如何不旨在限制本发明的范围。 

实施例1 

在如本文所述SFEE过程之前首先制备水/油/水(w/o/w)复乳液。10mg染料木黄酮溶解于1mL0.1M NaOH中，然后使用超声发生器在90W下与包含200mg PLGA的10mL二氯甲烷混合1分钟。然后以1：4的固定有机相与PVA水相比率将所得到的w/o乳液加入到1wt％的PVA溶液中。接着在90W下再进行超声处理1分钟以形成w/o/w复乳液。在每一次超声处理过程中使用冰浴将乳液冷却。 

实施例2 

SFEE过程的实验设置图解于图1中。设置包括体积为至少400mL的沉淀室101。沉淀室101在该实施例中是圆柱形的并且由不锈钢制成。室101还装备有加热套110用于在超临界流体与复乳液之间反应过程中保持沉淀室于某一温度。从实施例1制备的复乳液首先加载到沉淀室101中。超临界的CO₂从包括CO₂槽105的CO₂组件产生，CO₂槽105与冷却器106的一端相连。冷却器106包括-4℃的水/乙二醇循环浴以在使CO₂升温至所需温度之前将其维持为液相。CO₂组件还包括流量计107，其与冷却器106的另一端相连，以便监测从CO₂槽105经由冷却器106的CO₂流速。高性能泵108用于将冷却后的CO₂超临界流体递送至加热器109以便将流体在进入到沉淀室101内之前加热至所需温度。然后，超临界的CO₂以固定流速经过具有5μm孔径大小的金属过滤器102，从所述沉淀室101的底部泵入所述沉淀室。过滤器102可以改善有机溶剂即二氯甲烷萃取过程中的传质速率。复乳液与超临界的CO₂在沉淀室101中在高于或者接近超临界点的压力下反应。用于产生超临界CO₂的CO₂的初始质量(以g计) 设置成用于制备复乳液的二氯甲烷体积(以ml计)的40倍。在沉淀室101中由超临界的CO₂萃取二氯甲烷，并且二氯甲烷在低压旋风分离器104中作为液体被回收。在室101的顶部有另一个金属过滤器103，其可以防止任何所得到的产物与超临界CO₂流一起从室101溢出。在二氯甲烷和超临界CO₂的气体流出物进入到旋风分离器104之前，先经过一端与沉淀室101相连且另一端与旋风分离器104相连的背压调节器111。背压调节器111用于监测和维持101的压力。液体状态的二氯甲烷在周围包有加热套110的低压旋风分离器104处形成并从其底部112去除。过量的CO₂将从与低压旋风分离器104相连的排气口113去除。从整合有金属过滤器102的室101的底部收集所得到的包含颗粒的悬液，并用蒸馏水通过20,000rpm离心15分钟洗涤两次。然后将从室101收集到的颗粒重悬于纯水中，随后冷冻干燥用于进一步分析。 

在使用如图1中所阐明的设置用PLGA制备染料木黄酮的控释颗粒的工作实施例中，使用下列条件：CO₂流速为8g/min；沉淀室中使用的压力为大约80巴；沉淀温度为大约35℃；并且超临界的CO₂与二氯甲烷比率为大约40g/mL。图2显示通过本发明方法用PLGA制备的染料木黄酮颗粒在扫描电子显微镜(SEM)下的形态学(右图)并与从未处理的染料木黄酮制备的颗粒(左图)相比较。根据SEM图像显然具有PLGA的染料木黄酮颗粒具有近似球形的形状并且平均尺寸小于1μm。相比之下，未处理的染料木黄酮是矩形棒状的并且宽度(即矩形棒状的未处理染料木黄酮的最短侧边)为大约10μm。PLGA基质可以保护染料木黄酮不在胃肠道内降解并且也保护其不在肝脏内首过代谢。同时，尺寸小于1μm的近似球形的染料木黄酮颗粒具有更大的表面积以有利于颗粒与靶细胞之间的相互作用，以便增加定位在靶细胞上和以控释方式递送在颗粒中包封的染料木黄酮的机会。 

实施例3 

将来自实施例2的已知重量的所制备颗粒在1mL乙腈中重构，接着适度超声处理得到完全澄清的溶液。使用0.22μm尼龙注射器式过滤器将不同的样品过滤用于HPLC分析。包封效率计算为(Koushik等，2004)： 

   (1) 

   (2) 

在本发明中，理论载药量是在包封实验最初开始时染料木黄酮的量相对于PLGA的量。每一实验一式两份进行。染料木黄酮包封效率经计算为87±0.9％。如此高的包封效率可能源于这样一个事实，即20∶1的PLGA与染料木黄酮的数量比是相对高的并且染料木黄酮在超临界CO₂中溶解度相对低。 

实施例4 

在药物释放研究中，包含1％Tween80的水性媒介物用于将包含染料木黄酮的PLGA颗粒或者未处理的染料木黄酮重悬。24小时期间，来自PLGA包被颗粒的包封染料木黄酮的累积释放百分数和无PLGA的未处理染料木黄酮的累积释放百分数示于图3中。在先前发表的报道中，一些载药颗粒制剂表现出高的初始药物释放(Birnbaum，2000；Otsuka，2002)。这可能是因为颗粒载体表面上存在游离的和弱结合的药物。与之相比，本发明的包含染料木黄酮的PLGA颗粒表现出具有缓慢得多的并稳定增加的释放率的染料木黄酮释放曲线，这表明通过本发明的SFEE过程染料木黄酮被PLGA聚合物均一包封。在图3中，在前24小时内所包封的染料木黄酮从PLGA包被颗粒的累积释放百分数低于20％，而未处理染料木黄酮在24小时期间释放超过40％。根据该体外研究可以说包含染料木黄酮的PLGA颗粒的延长释放曲线可以增加染料木黄酮在人体中被利用的机会，这进一步改善生物利用度。释放率越慢，则更多的可用活性成分会释放至特定的作用部位。PLGA基质中所述包封染料木黄酮的释放曲线显示，在从T＝0开始(即从向受试者施用它们的时间开始)的24小时内，在累积释放百分数方面，与未处理染料木黄酮释放率相比释放率降低几乎2.4倍。 

如果需要，本文所讨论的不同功能可以以不同的顺序和/或彼此同时进行。此外，如果需要，一个或者更多个上述功能可以是任选的或者可以相组合。 

虽然本发明的许多方面在独立权利要求中描述，但是本发明的其他方面包 括来自所述实施方案和/或从属权利要求的特征与独立权利要求的特征的其他组合，而不仅仅是权利要求书中明确陈述的组合。 

在本文中应当注意，虽然在上面描述了本发明的示例性实施方案，但是这些描述不应看作是限制性意义。而是，在不脱离如后附权利要求书中所限定的本发明范围的情况下可以做出若干变更和修改。