一种具有自抗炎功能的胶原基海绵伤口敷料的制备方法

摘要

本发明属生物医用材料应用领域，具体涉及一种具有自抗炎功能的胶原基海绵伤口敷料的制备方法。该敷料为海绵型，其质地柔软，具有均匀的多孔结构，可快速吸水溶胀，可能有效降低炎症因子分泌，消除伤口炎症，并能吸除伤口分泌物、促进伤口修复，同时海绵耐酶降解，可减少更换次数，可应用于烧伤、机械损伤等多种类型皮肤创伤的修复。其制备方法是将聚乙烯吡咯烷酮在氢氧化钾溶液中经高温高压部分开环，再将开环聚乙烯吡咯烷酮与胶原蛋白混合配制成溶液，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺为活化剂交联，之后将交联产品经去离子水浸泡、冲洗，去除多余的活化剂，之后冷冻干燥得到的。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有自抗炎功能的胶原基海绵伤口敷料的制备方法。属生物医用材料应用领域。 

背景技术

炎症反应是皮层损伤后常见的一种病理反应，会引起伤口红肿、发热、疼痛。大面积深度的皮层损伤会刺激机体产生严重的炎症反应，造成创伤组织的水肿、溃烂、甚至坏死，导致伤口难以愈合，所产生的大量毒素还会损害身体机能，因此人们一直在寻找降低炎症，促进伤口修复的方法。伤口敷料是常用的医用卫生材料，具有保护伤口、防止感染、促进创面修复的作用。不过，传统纱布敷料不能促进伤口修复，还可能因粘连造成二次损伤。用合成高分子材料制备的敷料可消除粘连，但其不具备生物活性，无法加速伤口愈合。用胶原蛋白制备的海绵是目前国际上常用于伤口修复及外科手术的敷料材料。 

I型胶原大量存在于皮肤及其他结缔组织当中，作为细胞外基质中的重要成分，其能提供细胞粘附环境及生长支架，显著促进细胞增殖，帮助组织和器官的修复。另外，I型胶原的低免疫原性、生物相容性、可降解性也使其在医学材料领域中得到广泛应用。不过，胶原敷料存在无法抑制炎症反应的缺点，在敷料中添加抗炎药物则易造成伤口着色，不适于面部或大面积损伤的治疗。因此，制备可保护创面，又能降低炎症反应，促进组织修复的新型伤口敷料具有重要意义。 

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是广泛用作药用辅料的水溶性高分子。研究发现，其与胶原蛋白混合使用时能够显著降低包括NO因子、白介素-1、转化生长因子、肿瘤坏死因子等在内的多种炎症因子的生成，具有良好的协同抗炎作用。不过由于聚乙烯吡咯烷酮水溶性极佳，在体内或存在组织液交换的环境中易溶解流失，无法维持协同抗炎作用。 

因此，拟选用胶原蛋白和聚乙烯吡咯烷酮，通过将聚乙烯吡咯烷酮部分开环，再将开环聚乙烯吡咯烷酮与胶原蛋白混合，之后交联、冻干得到新型海绵伤口敷料。可应用于烧伤、机械损伤等多种类型皮肤创伤的修复，并且无需外加抗炎药物即具有良好的抗炎性能。 

发明内容

本发明的目的是提供一种具有自抗炎功能的胶原基海绵伤口敷料的制备方法。 

本发明的技术方案为：将聚乙烯吡咯烷酮在氢氧化钾溶液中经高温高压部分开环，再将开环聚乙烯吡咯烷酮与I型胶原蛋白混合配制成溶液，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺为活化剂交联，之后将交联产物经去离子水浸泡、冲洗，去除多余的活化剂，冷冻干燥得到具有自抗炎功能的海绵伤口敷料。 

本发明涉及一种用于皮肤创伤修复具有自抗炎功能的胶原基海绵敷料的制备方法，敷料为海绵型，其质地柔软，具有均匀的多孔结构，可快速吸水溶胀，可能有效降低炎症因子分泌，消除伤口炎症，并能促进伤口修复，同时海绵耐酶降解，可减少更换次数。经初步的研究确认，具有一定的抗炎症及促进皮肤伤口愈合功能，可以作为医用敷料应用于临床皮肤创伤修复领域。 

具体来说，首先向100mL浓度为10～50mg/mL的氢氧化钾溶液中加入1～10g聚乙烯吡咯烷酮，然后在耐压密封瓶中于温度120～150℃条件下反应15～24小时，除去溶剂后用二氯甲烷复溶，滤除不溶物后将溶剂蒸干得开环聚乙烯吡咯烷酮，开环率为1～20％。将100mg胶原蛋白与25～100mg开环聚乙烯吡咯烷酮混合并溶解至浓度为5～20mg/mL。(1)采用液态交联法：在10mL上述混合溶液中加入0.25～1mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及0.125～0.5mmol的N-羟基琥珀酰亚胺，于模具中活化交联4～24小时，交联温度为10～30℃，之后将交联产物经去离子水浸泡、冲洗，去除多余的活化剂，冷冻干燥得到海绵产品。(2)采用固态交联法：将10mL上述混合溶液于模具中冷冻干燥成型，然后将冻干产品浸泡在含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为25～100mmol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为12.5～50mmol/L的90％丙酮溶液中活化交联，交联时间为4～24小时，交联温度为10～30℃，之后将交联产物用去离子水浸泡、冲洗，去除多余的活化剂，冷冻干燥得到海绵产品。样品放入4℃冰箱保存，最后对复合水凝胶进行理化性能测试、抗炎实验以及皮肤伤口修复动物实验。 

具体实施方式

下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。 

实例一(采用液态交联法) 

首先向100mL浓度为50mg/mL的氢氧化钾溶液中加入10g聚乙烯吡咯烷酮，然后在耐压密封瓶中于温度130℃条件下反应12小时，除去溶剂后用二氯甲烷复溶，滤除不溶物后将溶剂蒸干得开环聚乙烯吡咯烷酮，开环率为4％。将100mg胶原蛋白与100mg开环聚乙烯吡咯烷酮混合并溶解至浓度为10mg/mL，然后加入1mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及0.5mmol的N-羟基琥珀酰亚胺，于模具中活化交联16小时，交联温度为25℃，之后将交联产物经去离子水浸泡、冲洗，去除多余的活化剂，冷冻干燥得到海绵产品，样品放入4℃冰箱保存。 

实例二(采用固态交联法) 

首先向100mL浓度为25mg/mL的氢氧化钾溶液中加入2.5g聚乙烯吡咯烷酮，然后在耐压密封瓶中于温度140℃条件下反应24小时，除去溶剂后用二氯甲烷复溶，滤除不溶物后将溶剂蒸干得开环聚乙烯吡咯烷酮，开环率为8％。将100mg胶原蛋白与50mg开环聚乙烯吡咯烷酮混合并溶解至浓度为7.5mg/mL，于模具中冷冻干燥成型，然后将冻干产品浸泡在含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为50mmol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为25mmol/L的90％丙酮溶液中活化交联，交联时间为24小时，交联温度为20℃，之后将交联产物用去离子水浸泡、冲洗，去除多余的活化剂，冷冻干燥得到海绵产品。样品放入4℃冰箱保存。 

实例三 

将制备得到复合海绵敷料进行理化性质评价，以纯胶原海绵为空白对照。 

1.实验方法 

(1)溶胀率测定： 

称取10mg完全干燥的海绵样品浸泡在PBS缓冲液中(pH7.4)，在指定的时间点，将样品取出，小心拭去表面溶液，然后称重(W_t)，完全溶胀后的重量为W_s。海绵的溶胀率(Swelling ratio，SR)按照下 列公式计算： 

SR(％)＝(W_t-10)×100/W_s

(2)最大吸水量及保水率测定： 

先将10mg完全干燥的海绵样品浸泡在PBS缓冲液中(pH7.4)24小时完全溶胀，重量为W_s，最大吸水量为W_s-10，然后放入有滤网的离心管内，500rpm离心3min，之后取出称重(W)，按如下公式计算保水率，平行测三组取平均值： 

WR(％)＝W×100/W_s

2.实验结果 

(1)溶胀率： 

表1为复合海绵和胶原海绵10小时内的溶胀趋势。结果表明复合海绵与胶原相比具有类似的溶胀速率，在10分钟即可以快速吸水至94.98％并接近溶胀平衡，之后溶胀率小幅上升并于10小时接近完全吸水，说明复合海绵具有良好的吸水性，能够保证作为敷料，清除伤口分泌物液体，而海绵还具有持续的吸水能力，可在较长时间内均保持良好的分泌液清除能力。 

表1复合海绵和胶原海绵溶胀率比较 

(2)保水率 

表2为复合海绵和胶原海绵的保水性能。结果显示，通过复合开环聚乙烯吡咯烷酮，复合海绵材料的最大吸水量相比较胶原海绵有所降低，10mg复合海绵样品可吸水728.65mg，而胶原海绵样品可吸水1093mg，但是复合海绵具有更好的保水性，相比较胶原海绵提升约1倍，较高的保液率也能保证伤口表面的湿润环境，利于伤口的修复。 

表2复合海绵和胶原海绵的最大吸水量及保液率比较 

实例三 

将制备得到复合海绵敷料进行细胞炎症因子抑制的测定，以NO细胞炎症因子为模型，胶原敷料为阳性对照。皮肤伤口修复动物实验，以胶原海绵为阳性对照，空白对照组不使用任何敷料。 

1.实验方法 

(1)海绵的抗炎症因子性能 

将RAW264.7细胞培养至对数生长期，消化、重悬并调整细胞浓度至5×10⁵cells/mL，于96孔培养板中接种细胞悬液100μL/孔，在含5％CO₂的培养箱中37℃孵育过夜，小心移去培养基，每孔加入200μL含脂 多糖(5μg/mL)的培养基刺激炎症因子产生，测试组加入20μg海绵样品，继续在培养箱中孵育48h，收集上清液，于492nm处测定吸光值，用NO工作曲线计算其含量。 

(2)海绵的伤口修复性能 

用18-22g的小鼠构建伤口修复模型，雌雄各半，随机分组。首先采用20％的乌拉坦作为实验小鼠的麻醉剂，剂量为0.01ml/g。采用腹腔内注射的方式对小鼠进行麻醉，麻醉剂注射10分钟待小鼠处于麻醉状态后，剪去实验小鼠背部的毛，剪毛的区域可根据伤口的大小而定。剪完后，用酒精棉对小鼠无毛区进行消毒，同时对手术剪、镊子等手术器械消毒。用镊子夹起小鼠背部已经剪过毛的皮，用手术剪剪出直径为5mm的圆形伤口。在伤口处敷上已消毒的海绵，通过对伤口面积测定来记录伤口的变化。 

2.实验结果 

(1)炎症因子抑制性能 

表3为复合海绵和胶原海绵细胞炎症因子抑制性能，从结果可以看出复合海绵可以显著抑制由脂多糖刺激产生的炎症细胞因子的生成，NO炎症细胞因子的抑制率超过50％，而胶原海绵对炎症细胞因子则不具有明显的抑制功能。良好的抗炎作用可以减轻伤口的红肿、疼痛，帮助伤口快速修复。 

表3复合海绵和胶原海绵细胞炎症因子抑制性能评价 

(2)伤口修复性能评价 

表4为复合海绵和胶原海绵对皮肤伤口修复功能的评价，结果显示在用药后的第1天，胶原海绵用药组的伤口面积是初始伤口面积的63％，复合海绵的是62％，而空白对照组是93％，复合海绵敷料的使用可明显促进伤口愈合速度，并且未观察到明显的红肿等发炎现象，而胶原海绵组及空白对照组则均出现了伤口的红肿发炎现象。在以后几天的测试中，结果同样显示为复合敷料具有更好的抗炎性能，伤口愈合速度也因而进一步加快。 

表4复合海绵和胶原海绵对皮肤伤口修复功能的评价 

○：表示伤口具有炎症表现；×：表示伤口不具有炎症表现 。