一株对柑橘木虱具强致病力的淡紫拟青霉菌株

摘要

本发明涉及一株对柑橘木虱具强致病力的淡紫拟青霉（Paecilomyceslilacinus）菌株，属于微生物技术领域。所述菌株为淡紫拟青霉（Paecilomyceslilacinus）ZJPL08，已于2013年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.7318。本发明所述的淡紫拟青霉ZJPL08对柑橘木虱具有更强的致病力，可被开发为生防菌制剂用于对柑橘木虱的生物防治，较目前防治柑橘木虱的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性的特征。菌株ZJPL08较其他淡紫拟青霉菌株对柑橘木虱有更强的作用效果，菌株ZJPL08培养快，产孢量大，孢子萌发率高，易于制备，具有良好的市场应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一株对柑橘木虱具强致病力的淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）菌株，属于微生物技术领域。 

背景技术

柑橘木虱（Diaphorina citri）属同翅目（Homoptera）、木虱科（Chermidae），是柑橘、柠檬、黄皮、九里香、枸杞等芸香科植物新梢期的主要害虫，也是传播柑橘黄龙病的唯一自然虫媒。柑橘黄龙病作为当前柑橘生产上防治最难、威胁最大的一种毁灭性病害，对柑橘产业的稳定和发展带来了严重的威胁。但目前对该病害尚未获得有效的防治药剂，以防治柑橘木虱为主的综合防治是当前该病害防控的主要办法。因此，加强对柑橘木虱的防治，无论对于控制柑橘黄龙病的流行还是降低虫体本身对柑橘的危害都具有重要的意义。 

目前对于柑橘木虱的防治多采用化学防治措施，然而化学农药的频繁使用造成了农药残留、环境污染、生物多样性破坏和柑橘木虱产生抗药性等诸多问题，而生物农药以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被人们认为是未来化学农药的理想替代药剂。因此，利用生物农药防治柑橘木虱也逐渐引起人们的重视。目前，国内外研究者在利用植物提取物、昆虫天敌等防治柑橘木虱方面进行了诸多有益的尝试，在柑橘木虱虫生真菌方面也开展了一定的研究，如目前已报道的对柑橘木虱具有致病效果的真菌有檬形被毛孢（Hirsutella citriformis）、宛氏拟青霉（paecilomyces varioti）、玫烟色拟青霉（Paecilomyces fumosoroseus）、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、蚜笋顶孢霉（Acrostalagmus aphidium）、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）和蜡蚧轮枝菌（Lecanicillium lecanii）等。目前对于柑橘木虱生防菌的研究多处于实验室阶段，在农业生产中利用生防菌制剂成功防治柑橘木虱的实例尚未有见报道。因此，目前对于柑橘木虱虫生真菌进一步的分离筛选和生物潜能的深入研究，对于促进将来柑橘木虱生物防治的顺利开展具有重要的意义。 

淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）是一种重要的生防真菌，研究发现该菌除对多种植物线虫具有较强的致病性外，还可寄生荔枝蝽象、叶蝉、褐飞虱、白蚁、象鼻虫和茶蚕等多种昆虫，另外，该菌对小麦赤霉病菌、黄瓜炭疽病菌和棉花枯萎病菌等多种植物病原菌具有一定的拮抗作用，且其代谢产物还可促进种子萌发、促进植物根系和植株生长等，其产生的多种功能酶还具有一定的农药降解效应。目前，已有市场化的针对防治根结线虫等的淡紫拟青霉生防菌制剂。然而，对于淡紫拟青霉可寄生于柑橘木虱的现象及利用淡紫拟青霉防治柑橘木虱的研究在国内外尚未有见报道。本发明所提供的对柑橘木虱具有强致病力的淡紫拟青霉菌株，是对目前柑橘木虱虫生真菌资源的有益补充，具有被开发为柑橘木虱生防菌制剂的潜能。 

发明内容

本发明的目的在于提供一株对柑橘木虱具强致病力的淡紫拟青霉菌株，该菌株具有被开发为生物农药的潜能，具有良好的市场应用前景。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 

本发明所提供的淡紫拟青霉菌株为淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）ZJPL08，已于2013年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 7318。

本发明还提供了所述淡紫拟青霉菌株在防控柑橘黄龙病中的应用，以及在制备用于防治柑橘木虱的生物农药中的应用，菌株ZJPL08的分生孢子悬浮液对柑橘木虱具有强致病力。 

所述淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）菌株ZJPL08是从浙江省台州市黄岩区的橘园中采集的柑橘木虱虫体上分离获得的，该菌株的形态特征、培养特性、ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列和菌种分类结果如下： 

1、菌株ZJPL08的形态特征：菌株ZJPL08在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基生长良好，在PDA平板上菌落呈圆形、隆起，菌丝较致密，表面无分泌物；培养初期菌落颜色为白色，产生孢子后菌落颜色显示为淡紫色，分生孢子呈粉质状。随着产孢量的增多，菌落颜色逐渐加深，至培养后期，菌落颜色变为深紫色。在光学显微镜下观察，菌株ZJPL08分生孢子梗单生或轮生，瓶梗基部柱状或瓶状，向上变为细长管状，7.5~9×1.8~3 μm。分生孢子为单细胞，卵形或纺锤形，无色至黄色，1.5~2.8×1.3~2.5 μm，在孢子梗上呈链状排列。

2、菌株ZJPL08的生物学特性：菌株ZJPL08在PDA培养基上于15℃~35℃的温度条件下均可生长，但不同温度对菌株的生长有显著影响。25℃~30℃时菌丝生长速率明显高于其他温度，为菌株ZJPL08的适宜生长温度。而15℃及以下低温或35℃及以上高温下菌株ZJPL08的菌丝生长缓慢，产孢量减少。在全光照、全黑暗和12 h光照/12 h黑暗条件下，菌株ZJPL08在PDA培养基上均生长良好，光照时间的长短对菌株ZJPL08的生长影响不明显。接种后1 d菌株ZJPL08在马铃薯蔗糖（PS）液体培养基中的分生孢子产量明显高于马铃薯葡萄糖（PD）液体培养基、萨氏葡萄糖酵母浸膏（SDY）液体培养基、察氏（CD）液体培养基和麦芽浸膏（ME）液体培养基。在接种后7 d，菌株ZJPL08在PD液体培养基中的菌丝产量最高，而在PS培养基中的菌丝产量较低。菌株ZJPL08的分生孢子在15℃~35℃的温度条件下均能萌发，其适宜萌发温度为25℃~30℃，15℃以下的低温和35℃以上的高温孢子均难以萌发。孢子萌发率随时间的延长而升高，至培养9 h后，30℃下菌株ZJPL08的分生孢子萌发率达99.5%。 

3、菌株ZJPL08的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列：测序所得菌株ZJPL08的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列SEQ ID NO.1所示，利用NCBI Blast比对分析发现，该序列与GenBank中淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）的多个分离物（如JN650588、FR751342、HM439952、HM032028、EU553316等）的对应序列相似性高达100%，与购自中国农业微生物菌种资源库的淡紫拟青霉的3个对照菌株（ACCC30640、ACCC32480和ACCC31532）的相似性也高达99.8%。 

根据以上关于菌株ZJPL08的形态特征、生物学特性及ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列特征，将菌株ZJPL08鉴定为丝孢目（Hyphomycetales）拟青霉属（Paecilomyces）的淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）。 

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：（1）目前国内外尚无关于淡紫拟青霉侵染柑橘木虱的报道，而本发明的菌株ZJPL08是从浙江省台州市黄岩区柑橘园中被侵染的柑橘木虱虫体上分离获得的，与分离自其它基物的淡紫拟青霉菌株相比，本发明所述的淡紫拟青霉ZJPL08对柑橘木虱具有更强的致病力；（2）本发明所述的淡紫拟青霉ZJPL08是一种昆虫病原真菌，可被开发为生防菌制剂用于对柑橘木虱的生物防治，较目前防治柑橘木虱的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性的特征；（3）本发明所述的淡紫拟青霉ZJPL08的分生孢子悬浮液对柑橘木虱具有强致病力，接种柑橘木虱后第3 d的LC₅₀为5.77×10⁹ spores/mL，浓度为1.0×10⁸ spores/mL的孢子悬浮液的LT₅₀仅为3.1 d。菌株ZJPL08较其他淡紫拟青霉菌株对柑橘木虱有更强的作用效果，具有良好的市场应用前景。（4）菌株ZJPL08培养快，产孢量大，孢子萌发率高，易于制备。 

附图说明

图1为淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）菌株ZJPL08在PDA培养基上的培养特征。 

图2为淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）菌株ZJPL08对柑橘木虱的侵染情况。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。 

一种对柑橘木虱具强致病力的淡紫拟青霉菌，菌种命名为ZJPL08，分类命名：淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus），其保藏编号：CGMCC No. 7318，保藏日期：2013年3月15日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 

实施例1：昆虫病原菌的分离和筛选 

1、病菌的分离纯化：从浙江省台州市黄岩区柑橘园内采集柑橘木虱虫尸，带回实验室将其放于70%乙醇中浸泡30 s，再经过0.1%升汞浸泡3 min，最后用无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干虫体上的水分，然后将其放于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（配制方法为：称取200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000 mL煮沸半个小时，纱布过滤，再加20 g葡萄糖和20 g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装至锥形瓶或玻璃试管中，121℃，高压灭菌20 min）中，置于微生物培养箱中28℃恒温培养，至虫体周围长出菌丝后，挑取菌丝转至新的PDA平板上培养（重复此操作2~3次），持续培养5 d左右，待菌落上产生分生孢子，用无菌水洗脱分生孢子制备成分生孢子悬浮液，然后参照《植病研究方法》中所述的稀释纯化法（方中达. 植病研究方法(第三版)[M]. 北京: 中国农业出版社,1998: 122-140）对病菌进行单孢分离。最后将分离纯化获得的菌株保存于PDA斜面培养基中，培养3~4 d后，置于4℃冰箱保存。

2、致病菌的筛选：将上述分离纯化保存的菌株接种到PDA平板上，于28℃恒温培养10 d左右后，以无菌水洗脱菌落上产生的分生孢子，制备获得分生孢子悬浮液，向其中加入适量的吐温-80至终浓度为0.1%。取于温室饲养的30头健康柑橘木虱成虫（本说明书实施例均以柑橘木虱成虫为测试对象）浸没于含0.1%吐温-80的分生孢子悬浮液中10~15 s，挑取处理后仍能自由活动的柑橘木虱置于培养皿中的九里香叶片上（培养皿底部铺有2层用无菌水湿润过的滤纸，其上放置一个带10个左右叶片的九里香嫩枝，枝条底端以无菌水湿润的脱脂棉包裹），然后放于28℃光照培养箱中（每天14 h光照/10 h黑暗，湿度95%以上）培养，同时设立含0.1%吐温-80的无菌水处理柑橘木虱为对照，培养7 d后观察病菌对柑橘木虱的侵染和致死情况。之后再按步骤1中的方法从处理后的柑橘木虱虫体中分离病菌，比较再分离的病菌与初始接种的病菌的形态特征和培养特征。 

通过以上操作，筛选出符合科赫氏法则的对柑橘木虱具致病性的菌株，排除从柑橘木虱虫体上分离到的腐生菌等非致病菌。通过筛选，获得1株对柑橘木虱具有致病力的菌株，将其命名ZJPL08。 

3、菌株的复壮：制备上述筛选到的对柑橘木虱具致病力的菌株ZJPL08的分生孢子悬浮液，接种到健康柑橘木虱虫体上，然后再从发病的柑橘木虱虫体上分离纯化病菌，具体操作方法同上。最后获得分离纯化的菌株ZJPL08。 

实施例2：菌株ZJPL08的鉴定 

1、菌株ZJPL08的形态特征：将上述分离纯化的菌株ZJPL08接种到PDA培养基平板中央，置于28℃恒温培养，每天观察菌落生长情况并记录菌落颜色和形态。将菌株ZJPL08接种到另一PDA培养基平板中央，同时将灭菌后的盖玻片（1 cm×1 cm）斜插入距接种点约1 cm左右处的培养基内，置于28 ℃恒温培养5 d左右待菌丝爬到盖玻片上后，取出盖玻片置于光学显微镜下观察菌株ZJPL08的菌丝和孢子形态。

图1示菌株ZJPL08在 PDA培养基上培养7 d后的形态特征，可见菌株ZJPL08菌落呈圆形、隆起，菌丝较致密，表面无分泌物；培养初期菌落颜色为白色，产生孢子后菌落颜色显示为淡紫色，分生孢子呈粉质状。随着产孢量的增多，菌落颜色逐渐加深，至培养后期，菌落颜色变为深紫色。在光学显微镜可观察到菌株ZJPL08分生孢子梗单生或轮生，瓶梗基部柱状或瓶状，向上变为细长管状，7.5~9×1.8~3 μm。分生孢子为单细胞，卵形或纺锤形，无色至黄色，1.5~2.8×1.3~2.5 μm，在孢子梗上呈链状排列。 

2、菌株ZJPL08的序列分析：将菌株ZJPL08接种至PDA培养基平板，置于28℃恒温培养至菌落长满整个培养皿，以无菌药匙刮取PDA平板上生长的真菌菌丝于无菌研钵中，加入液氮研磨至粉末状，采用改良的CTAB法提取菌株ZJPL08的总DNA，以纯化的DNA为模板，用真菌通用引物ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′） 和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增（具体操作方法参考：鹿连明等. 柑橘黄龙病菌核糖体蛋白基因的多态性及系统发育分析. 浙江大学学报, 2011, 37(2):125-132）。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒回收后送交公司测序。 

测序所得菌株ZJPL08的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列如SEQ ID NO.1所示，利用NCBI Blast比对分析发现，该序列与GenBank中淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）的多个分离物（如JN650588、FR751342、HM439952、HM032028、EU553316等）的序列相似性高达100%，与购自中国农业微生物菌种资源库的淡紫拟青霉的3个对照菌株（ACCC30640、ACCC32480和ACCC31532）的相似性也高达99.8%。 

根据以上关于菌株ZJPL08的形态特征及ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列特征，可将菌株ZJPL08鉴定为丝孢目（Hyphomycetales）拟青霉属（Paecilomyces）的淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）。 

实施例3：菌株ZJPL08的生物学特性 

1、不同温度对菌株ZJPL08生长的影响：以无菌打孔器于在PDA培养基上培养7 d左右的菌株ZJPL08的菌落周围打取5 mm大小的菌饼，然后将菌饼分别置于数个新鲜制备的PDA平板（直径为9 cm）中央，分别于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃光照培养箱中倒置培养，每个温度下设3个重复。培养14 d，每24 h观察菌落生长情况并采用十字交叉法记录菌落直径。

结果见表1，可以看出，菌株ZJPL08在PDA培养基上于15℃~35℃的温度条件下均可生长，其中25℃和30℃时菌丝生长速率明显高于其他温度，培养14 d菌落几乎可长满整个培养皿，而35℃时菌落生长速度明显减缓，10℃和5℃低温下菌落几乎不生长。因此，25℃~30℃为菌株ZJPL08的适宜生长温度。 

表1 接种后不同天数不同温度下菌株ZJPL08的生长情况 

2、不同光照条件对菌株ZJPL08生长的影响：以无菌打孔器于在PDA培养基上培养7 d左右的菌株ZJPL08的菌落周围打取5 mm大小的菌饼，然后将菌饼分别置于数个新鲜制备的PDA平板（直径为9 cm）中央，于28 ℃培养箱中分别在每天0 h、12 h和24 h光照条件下培养，连续培养14 d，每隔24 h观察并记录菌落直径。

结果如表2，可以看出，菌株ZJPL08在不同光照条件下均生长良好，光照时间长短对菌株ZJPL08的生长影响不显著。 

表2 接种后不同天数不同光照条件下菌株ZJPL08的生长情况 

3、不同培养基对菌株ZJPL08产孢量和菌丝产量的影响：配制下列培养基：马铃薯蔗糖（PS）液体培养基（配制方法为：称取200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000 mL煮沸半个小时，纱布过滤，再加20 g蔗糖和20 g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装至锥形瓶或玻璃试管中，121℃，高压灭菌20 min）、马铃薯葡萄糖（PD）液体培养基（配制方法为：称取200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000 mL煮沸半个小时，纱布过滤，再加20 g葡萄糖和20 g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装至锥形瓶或玻璃试管中，121℃，高压灭菌20 min）、萨氏葡萄糖酵母浸膏（SDY）液体培养基（酵母浸膏10 g、葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、琼脂20 g， pH6.0）、察氏（CD）液体培养基（硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、硫酸镁（MgSO₄^.7H₂O）0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、蒸馏水1000 mL）和麦芽浸膏（ME）液体培养基（麦芽浸粉15 g、蒸馏水1000 mL，pH4.7）。挑取新鲜培养的菌株ZJPL08的菌块接种至装有SDY培养液（120 mL/瓶）的锥形瓶中，置28℃摇床上振荡培养（150 rpm/min）2 d，作为种子培养液。然后分别取1 mL种子培养液加入到装有PD、PS、SDY、CD和ME培养液的锥形瓶中（120 mL/瓶），每个处理设3次重复，置28℃摇床振荡培养（150 rpm/min）6 d，每24 h取少量培养液滴在血球计数板上在光学显微镜下观察并记录孢子数量，然后计算各培养基中孢子的浓度。

测定结果如表3，可以看出在接种后1 d，菌株ZJPL08在ME培养基中的孢子产量最高，而1 d后，在PS培养基中的孢子产量均高于其他培养基。在PD、PS和CD培养基中，菌株ZJPL08在接种后第3 d产孢量达到高峰，之后逐渐呈下降趋势。因此，PS培养基为菌株ZJPL08的最佳产孢培养基。在接种后第7 d，将各培养液离心后收集菌体沉淀，于恒温干燥箱中干燥后测定菌丝干重，结果显示菌株ZJPL08在PD培养基中的菌丝产量最高，为32.15 mg/mL，在SDY培养基中的产量最低为3.8 mg/mL，而在产孢量最高的PS培养基中的菌丝产量也相对较低，仅为4.7 mg/L。 

表3 接种后不同时间不同培养基中菌株ZJPL08的孢子浓度 

4、不同温度和时间对菌株ZJPL08孢子萌发率的影响：以PD液体培养基洗脱于PDA上培养的菌株ZJPL08的分生孢子配制成分生孢子悬浮液，分别取30 μL孢子悬浮液滴加至各无菌载玻片的中央，然后置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃培养箱中培养，每个温度条件设3个重复，8 h后在显微镜下计数400~600个孢子，以芽管长度超过孢子长度1/2为标准视为孢子萌发，统计孢子萌发个数并计算孢子萌发率。如上所述将菌株ZJPL08的孢子悬浮液滴至载玻片中央，然后置于28℃恒温培养箱中培养，每1 h观察并记录萌发的孢子数，计算孢子萌发率。

结果如表4和表5，可以看出，菌株ZJPL08的分生孢子在15℃~35℃的温度条件下均能萌发，其中在30℃下孢子萌发率最高，25℃次之，5℃以下的低温和35℃以上的高温孢子均难以萌发。在28℃条件下，菌株ZJPL08的分生孢子前3 h几乎不萌发，5 h后萌发率显著上升，至9 h萌发率近100%。因此，25℃~30℃为菌株ZJPL08的适宜产孢温度。 

  

表4 不同温度条件下菌株ZJPL08的分生孢子萌发率

表5 不同培养时间下菌株ZJPL08的分生孢子萌发率

实施例4：菌株ZJPL08对柑橘木虱的致病性测定

1、菌株ZJPL08对柑橘木虱的致死中浓度和致死中时间：将菌株ZJPL08接种至PS液体培养基中，于28℃恒温摇床振荡培养（150 rpm/min）3 d后，培养的菌液经由无菌纱布过滤除去菌丝体，收集分生孢子悬浮液，以无菌水进行系列稀释，获得浓度分别为1.0×10⁸ spores/mL、1.0×10⁷ spores/mL、1.0×10⁶ spores/mL、1.0×10⁵ spores/mL、1.0×10⁴ spores/mL的菌株ZJPL08的分生孢子悬浮液，并向其中加入适量的吐温-80至终浓度为0.1%。按实施例1所述将健康柑橘木虱放于上述各浓度的含0.1%吐温-80的分生孢子悬浮液中浸润处理，之后放于28℃光照培养箱中（每天14 h光照/10 h黑暗，湿度95%以上）培养，同时设立以含0.1%吐温-80的无菌水处理柑橘木虱为对照。以上每个处理设3个重复，每个重复处理30头柑橘木虱。从培养第2 d开始每天观察病菌对柑橘木虱的侵染和致死情况，记录柑橘木虱死亡数目，按如下公式计算死亡率和校正死亡率，所得数据通过SAS软件进行回归分析，得到回归方程和相关系数r，计算致死中浓度（LC₅₀）和致死中时间（LT₅₀）。

结果见表6和表7。可以看出，菌株ZJPL08的分生孢子悬浮液浓度越高，对柑橘木虱的致病效果越好。在同一浓度条件下，接种后培养时间越长，柑橘木虱的死亡率越高。接种后各时间段的LC₅₀表现出明显差异，如接种后第3 d，LC₅₀为5.77×10⁹ spores/mL，第7 d则仅为2.20×10⁴ spores/mL。分生孢子悬浮液浓度越高，菌株ZJPL08对柑橘木虱的LT₅₀也越短，如浓度为1.0×10⁴ spores/mL的分生孢子悬浮液对柑橘木虱的LT₅₀为7.15 d，而浓度为1.0×10⁸的孢子悬浮液的LT₅₀仅为3.1 d，以该浓度孢子悬浮液处理的柑橘木虱在培养后第6 d死亡率近100%。 

表6 菌株ZJPL08对柑橘木虱的致死中浓度 

表7 菌株ZJPL08对柑橘木虱的致死中时间

2、菌株ZJPL08对柑橘木虱的防治应用：将菌株ZJPL08接种至PS液体培养基中，于28℃恒温摇床振荡培养（150 rpm/min）3 d后，培养的菌液经由无菌纱布过滤除去菌丝体，收集分生孢子悬浮液，以无菌水稀释至其浓度为1.0×10⁸ spores/mL，加入适量的吐温-80至浓度为0.1%。取健康柑橘木虱放于养虫笼内的盆栽九里香幼苗上（1个养虫笼内放置1株九里香幼苗，1株九里香幼苗上放柑橘木虱30头，设5个重复），将上述制备好的菌株ZJPL08的孢子悬浮液装入小型喷雾器后，对九里香上的柑橘木虱均匀喷雾，至昆虫体表完全湿润。以购自中国农业微生物菌种资源库的淡紫拟青霉菌株ACCC30640（分离自根结线虫卵）作为对比菌株，按上述方法制备与菌株ZJPL08同浓度的孢子悬浮液并处理柑橘木虱。此外，以含0.1%吐温-80的无菌水处理柑橘木虱作为对照。上述各处理完成后，将养虫笼放入玻璃温室，控制温室内温度为25℃~30℃，湿度为90%以上，每天14 h光照/10 h黑暗。图2示处理9 d后淡紫拟青霉菌株ZJPL08对九里香上柑橘木虱的侵染情况，可见柑橘木虱已被菌株ZJPL08侵染致死，淡紫色的真菌菌丝和分生孢子几乎覆盖整个柑橘木虱虫体。于第9 d观察并记录上述各处理的柑橘木虱的总虫数和死亡虫数，按以下公式计算死亡率和校正死亡率。

通过计算得知，在处理后第9 d，以浓度为1.0×10⁸ spores/mL的淡紫拟青霉菌株ZJPL08的分生孢子悬浮液处理的柑橘木虱的校正死亡率为91.58%，而以同浓度的淡紫拟青霉菌株ACCC30640的分生孢子悬浮液处理的柑橘木虱的校正死亡率仅为73.68%。可以看出，与分离自根结线虫的淡紫拟青霉菌株相比，本发明提供的分离自柑橘木虱的淡紫拟青霉菌株ZJPL08针对柑橘木虱具有更强的作用效果。 

  

<110> 浙江省柑桔研究所

<120>一株对柑橘木虱具强致病力的淡紫拟青霉菌株

<160> 1

<170> PatentIn Version 3.3

<210> 1

<211> 509

<212> DNA

<213> 淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）

<400> 1

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