用于促进和增强神经修复和再生的肌肉来源的细胞(MDC)

摘要

本发明描述涉及使用肌肉来源的细胞（MDC）的方法，所述细胞优选从骨骼肌获得，以支持受损伤组织和器官的神经支配和修复，特别是与神经损伤或神经病变相关的那些。本发明涉及用于促进或增强神经细胞神经支配的方法的MDC，尤其是在周围神经系统中，以及当MDC引入到由于损伤、破坏、疾病或功能障碍而需要修复的组织或器官位点或其附近时它们有助于神经元组织发育的能力。这些方法可用于治疗中枢和周围神经系统紊乱并缓解、减轻或消除动物的神经病学或神经退行性疾病的症状，尤其是哺乳动物，包括人。所述方法也可用于在神经和肌肉组织类型损伤、破坏或功能障碍后治疗这些组织。

说明书

本申请是申请日为2004年4月26日，申请号为200480018035.2 的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。

根据来自国家卫生部的研究基金NIH 1P01 AR45925-01，美国政府 可能对本发明有某些权力。

本专利公开含有受版权保护的材料。以它在美国专利商标局专利 文件或记录的形式，版权所有人对于任何人传真复制专利文档或专利 公开没有异议，但保留任何和所有版权。

发明领域

本发明一般的涉及肌肉来源的细胞的用途，所述细胞优选从骨骼 肌获得，此处称为MDC，以促进和增强神经细胞和神经元组织的再生和 修复。本发明进一步涉及用于修复神经组织的方法的MDC，尤其是在周 围神经系统中，以及它们有助于神经元组织发育的能力。这些方法可 用于治疗中枢和周围神经系统紊乱并缓解、减轻、改善或消除动物的 神经病学或神经退行性疾病的症状，尤其是哺乳动物，包括人。

发明背景

神经系统用作广泛分离的身体部件之间的通讯网络并迅速工作以 控制对刺激的反应、处理信息并产生控制复杂行为的复杂信号模式。

脊椎动物如哺乳动物的神经系统包括中枢神经系统（CNS），其中 包含脑和脊髓，它们通过神经（也称为神经细胞、神经元或神经元细 胞）连接到很多周围结构，例如感觉器官、肌肉和腺体。CNS也连接到 周围神经细胞簇，称为神经节，它们在周围和中枢神经系统之间通讯 中发挥作用。尽管不同物种间神经连接模式有很大不同，单个神经元 （或神经细胞）的特性在动物神经系统中大致相同。成熟的脊椎动物 如哺乳动物的中枢神经系统由神经元和胶质细胞如星形胶质细胞和少 突胶质细胞组成。神经细胞、神经节和感觉器官组成周围神经系统。

神经系统包含大量高度特化的细胞，它们一起相互作用以完成基 本任务并发挥与其在系统中位置相关的功能。例如，神经细胞和骨骼 肌之间形成的神经肌肉连接由三种类型细胞组成：肌肉细胞、神经细 胞和施旺细胞。每种细胞具有如下述非常不同的作用，然而它们协同 工作允许肌肉刺激和收缩。肌肉细胞是特化的收缩细胞。其细胞质充 满蛋白质丝的有组织阵列，其中包括大量肌动蛋白丝。在这些蛋白质 纤维中间也散布有很多线粒体，它们供应ATP作为收缩装置的能量来 源。

神经肌肉连接的神经细胞刺激肌肉细胞收缩，从而传递来自脑或 脊髓的兴奋性信号给肌肉。神经细胞极其长；其包含细胞核的主体可 距离肌肉连接一米或更远。因此，神经细胞的细胞骨架发育良好，使 得可以维持不寻常的细胞形状，并经长神经细胞“突起”从细胞一端 向另一端有效运输物质。神经细胞质膜含有离子泵和通道蛋白，这些 蛋白已经被神经细胞利用，使得动作电位形式的电信号或脉冲可以以 秒的分数从细胞的一端向另一端传播，从而传递动作信号。

神经肌肉连接的最后细胞是施旺细胞。施旺细胞是特化的质膜产 生细胞，产生的质膜包裹神经细胞的延长部分。周围神经系统中的施 旺细胞形成髓磷脂并铺下很多层膜而在神经细胞突起（称为轴突）周 围形成绝缘的髓鞘。

新神经细胞的产生也称为神经发生过程，一般在脊椎动物哺乳动 物的出生后早期完成。到哺乳动物发育的出生后晚期，CNS含有多种类 型的神经细胞的完整补充。多数成年哺乳动物如人和非人灵长类不能 产生新神经细胞，当损伤或疾病引起不可替代的神经元细胞和组织的 破坏或死亡时这导致严重问题。

CNS紊乱和疾病包括多种不利状况，如神经退行性疾病例如帕金森 病及其相关的运动障碍；阿尔茨海默病；多发性硬化症（MS），肌萎缩 性侧索硬化症（ALS），亨廷顿病；急性脑损伤例如中风、脑瘫、头部 损伤；和其它中枢神经功能障碍例如癫痫、抑郁、精神分裂症和瘫痪。 随着老龄人口的增长，现在人的预期寿命更长和更长寿，这些紊乱和 疾病正变得愈加明显。以上疾病中的很多，尤其是老年人的疾病，与 CNS特定区域中细胞的退化或异常相关，致使CNS或周围神经系统中的 细胞不能行使正常功能。现有神经细胞的功能异常不是细胞完全丧失， 而是包括大面积CNS紊乱、疾病和功能障碍。神经元细胞异常可能是 因为神经元不适当激发或神经递质的异常合成、加工和／或释放。涉 及受破坏或功能障碍的神经细胞和组织的其它疾病和紊乱包括创伤或 组织损伤或多种类型例如钝伤、烧伤、背部损伤、肌肉损伤和勃起功 能障碍等。

根据在身体上的位置，脑中基底神经节退化可导致发生具有很多 认知和运动症状的疾病。基底神经节包含很多不同区域，包括纹状体， 即含有尾状核和豆状核、苍白球、黑质、无名质、腹侧苍白球、Meynert 基底核（将胆碱能发射传递到大脑皮层）、腹侧盖区和下丘脑核。已经 发现基底神经节的很多区域经历退化或局部退化，特别是在疾病中如 阿尔茨海默病或运动障碍和疾病如亨廷顿舞蹈症或帕金森病。

脱髓鞘疾病包括CNS和周围神经系统中的神经元细胞病变，它们 导致这两个系统内和之间的错误的信号传导。髓鞘、细胞鞘用于提高 髓鞘围绕的轴突和轴突突起的多种电化学性能，它们也提供对神经元 的营养支持。在CNS中，少突胶质细胞产生髓鞘，而在周围神经系统 中施旺细胞产生这种绝缘物质。脱髓鞘疾病多发性硬化（MS）和肌营 养不良是与需要治疗的神经损伤相关的疾病类型。

越来越需要减轻和克服CNS和周围神经系统神经退行性紊乱和疾 病的新治疗和方法。尽管已经发展了多种治疗方案，因为缺乏持续性 长期作用、与其使用相关的并发症、和／或随着时间缺乏易操作性作 用和效力，具有长期使用很多治疗导致的缺陷。例如，精神安定药和 药剂已被用于治疗CNS紊乱并取得有限成功。由于这些药剂跨过血脑 屏障的能力有限而随着出现问题。耐药性也会出现，特别是长期向患 者给药时，因此限制了治疗的有效性。对策如增加给药量以获得更高 效力，可能导致不良副作用，例如，迟发性运动障碍、振颤、和其它 无意识动作。已经尝试用移植技术进行神经移植，然而所用细胞类型 经常不能分化成正确的神经元表型、或者在导入宿主或接受者后存活 时间很短。

哺乳动物CNS中细胞的低更新率和成年哺乳动物不能在损伤或疾 病如神经退行性疾病后再生或替换神经元细胞都支持这种观念，即成 年CNS不含有且不能产生神经干细胞或早期细胞，这些细胞表现自我 更新，因而产生更多后代神经元细胞。一般来说，干细胞的几个典型 特点是它们可以更新并维持自身、增殖、产生很多分化的功能性后代 并在损伤或疾病后再生组织。因而干细胞一般是多潜能的并具有在自 然或诱导的细胞死亡、疾病、损伤或功能障碍后替换细胞损失的功能。 损伤或死亡后产生新CNS细胞在哺乳动物物种中很少见（Kaplan,1981, J.Comp.Neurol.,195:323;Bayer,1985,Ann.New YorkAcad.Sci., 457:163;美国专利6,497,872），进一步支持成年哺乳动物CNS不含 有多能神经干细胞的理论，这些细胞可以替换因损伤或疾病而丢失的 神经元细胞。

在治疗多种类型的神经退行性疾病和神经损伤中，需要重复性和 有效的细胞来源，它们可以导入或移植到需要治疗的宿主所需要量来 提供。用于治疗神经系统损伤和疾病的多种细胞类型的报告包括自发 存在的细胞系、永生化细胞系、原代神经细胞培养物、如描述于Gage 等人的美国专利5,082,670中的细胞，其中使用遗传修饰以表达酪氨 酸羟化酶的成纤维细胞从而允许产生多巴胺以在植入后治疗帕金森 病、和如描述于Weiss等人的美国专利6,497,872中的细胞，其中披 露神经元干细胞从胎儿或成人神经组织分离、用生长因子处理并允许 在移植入宿主之前分化成神经细胞类型。

因此，对于使用具有多种能力的可靠细胞类型有明确和充分的需 求，这些能力是支持神经细胞生长和存活，促进或增强损伤神经再生， 和促进或增强移植或植入组织的神经支配，这些组织用于治疗多种神 经系统相关损伤、破坏、疾病、紊乱或功能异常。还需要可局部或系 统性给予接受组织的细胞，以修复、改善、消除或恢复例如与周围神 经退化或炎症相关的功能。如此处所述的本发明致力于解决在神经病 理学和神经细胞和组织疾病治疗、改善、修复和恢复领域的这种需要。

发明简述

本发明的一方面提供利用优选分离自骨骼肌的肌肉来源的细胞 （此处称为MDC）支持神经系统、尤其是周围神经的神经细胞再生的方 法。MDC是一类早期肌肉来源的细胞，包括成肌细胞，具有整合入再生 神经、尤其是周围神经区域的能力，并促进或增强受破坏的神经组织 的治疗和／或修复。此外，与未受损肌肉相比，MDC显示修复神经受损 的肌肉中周围神经和骨骼肌纤维的潜能。如此处所用，术语“周围神 经”表示中枢神经系统以外的所有神经组织，包括脊神经、颅神经、 自主神经、背根神经节和自主神经节。在一些方面，受神经损伤上调 的神经营养因子能提高用MDC注射到疾病、破坏、损伤或功能障碍组 织的治疗。作为对来自受破坏的组织和器官的局部环境信号（例如生 长和分化因子）的应答，MDC也能有助于修复损伤组织，例如神经和肌 肉组织。在一些方面，通过连续培养物铺板除去非肌肉细胞和成纤维 细胞可以富集成肌细胞MDC，并且这些富集、培养的成肌细胞MDC可被 用于此处描述的方法。

本发明的另一方面提供MDC的可靠来源，当引入或移植到发生神 经破坏、损伤或疾病的区域时，这些MDC能增殖并维持持续的存活力。 根据该方面，提供利用MDC的方法以富集成在需要的地方存活的细胞 群体，从而治疗、改善或消除神经和神经组织的损伤、疾病或破坏。 MDC来源适用于自体移植物中神经元细胞和／或组织修复和再生。有些 情况下，MDC可适用于同种异体移植物和异种移植物而无需考虑肿瘤形 成或排斥，因为这些细胞可具有免疫优先，这允许它们逃过宿主免疫 系统导致排斥如移植物-宿主排斥的监测。

另一方面，本发明提供支持神经细胞和组织存活、再生和修复的 方法，其中包含将MDC引入到损伤、破坏、疾病或功能障碍组织的位 点上或其周围，以支持进行MDC治疗的组织或组织区域中神经细胞的 神经支配（或再支配）、再生和修复。MDC包含活的、非成纤维细胞的、 结蛋白阳性的、成肌细胞的、早期肌肉来源的细胞的富集群体。通过 在组织培养容器中进行至少两次连续铺板以除去成纤维细胞、非肌肉 和非成肌细胞，可以富集用于本发明方法的MDC。MDC对于导入的组织 可以是自体的。

在这些方面的另一方面，本发明提供用MDC细胞促进和／或增强 移植组织或器官中神经元存活和再生并刺激移植组织或器官由宿主组 织或器官的神经纤维的神经支配。根据该方面，或者单独或者与生理 学可接受的载体、赋形剂或稀释剂一起，沿着移植和宿主组织之间的 边界给予MDC或者给予到该边界附近。因此，根据这些方法，MDC可防 止或延缓例如由对组织或器官的严重烧伤或外伤或钝伤导致破坏的周 围皮肤轴突的退化，从而增强这些轴突支配自体皮肤移植物的能力。 在相关方面，MDC携带编码一种或更多神经营养或生长因子的一种或更 多异源多核苷酸，这些因子由MDC体内表达并有助于用于本方法的MDC 的神经保护和改善特性。

在本发明的另一方面，利用MDC促进和／或增强经历手术重连接 的切断或部分切断的组织或肢体的神经支配或再支配。根据本发明的 这一方面，MDC施用到损伤位点例如远位点、近位点或两者都有，并且 或者单独或者与生理学可接受的载体、赋形剂或稀释剂一起给予。MDC 的神经保护特性促进重连接的组织的神经支配或再支配和切断的轴突 间的功能性连接的恢复。本发明的该方面的MDC也可工程化以表达一 种或更多神经营养或生长因子，这些因子在体内表达后能增强用于本 方法的MDC的神经保护和改善特性。

本发明的另一方面提供可用于体外培养系统的MDC，用于测试或筛 选药物、化合物、试剂和分子等，它们是潜在的神经治疗剂，以确认 它们允许MDC支持在损伤、破坏、疾病或功能障碍的神经元组织中的 神经细胞生长和／或再生、和／或影响神经元细胞行为、生长、存活、 活性或功能的效力。根据该方面，提供使用MDC筛选这些潜在神经治 疗剂和药物的方法，MDC优选例如用一种或更多生长或营养因子如NGF、 睫状神经营养因子（CNTF）、神经营养蛋白或其它因子处理并在体外培 养。另外，如果MDC培养物不经生长或营养因子预处理，这些培养物 可用于评价或测试候选或待测化合物、物质、药、药物或其它试剂影 响（例如刺激、诱导等）MDC支持神经支配和／或神经细胞生长和／或 再生的能力。这样的测试方法可涉及用测试物质处理MDC培养物；将 处理的MDC引入神经组织损伤、疾病或破坏的位点；并比较相对于未 处理MDC支持接受者中神经支配或神经细胞生长而言，处理后MDC支 持具有神经组织疾病、破坏或损伤的接受者中神经支配或神经细胞生 长的能力。适当的对照例如未处理培养物包括在测试和筛选方法中。

本发明的另一方面提供将MDC引入或移植到具有神经退行性疾病、 紊乱、损伤或功能障碍的宿主的方法，其中所述方法包含向宿主组织 引入MDC或其生理学可接受的组合物。作为早期肌肉来源的细胞如成 肌细胞的富集的终末群体，MDC可通过一系列铺板和培养步骤从骨骼肌 中分离。培养富集提供用于此处描述方法的MDC的终末群体。MDC是活 的、非成纤维细胞的、结蛋白阳性的细胞，它们可形成肌肉纤维（肌 纤维）并也能促进、增强或改善神经支配和神经细胞和组织破坏的修 复。在细胞连续铺板到新容器中期间，从非MDC型细胞如成纤维细胞 和脂肪细胞、内皮细胞和结缔组织细胞中富集并分离MDC（包括成肌细 胞、卫星细胞和早期肌肉来源的细胞例如肌肉干细胞）。可进行连续铺 板约3-7天或4-6天或3-5天，直至非成纤维细胞的MDC在培养物中 保留并增殖。培养期间，通过将肌肉细胞的细胞悬液传代到新组织培 养皿或瓶（可以包被或不包被胶原），贴壁的成纤维细胞和非肌肉细胞 基本上从连续细胞培养物中消耗尽。在连续铺板中，贴壁成纤维细胞 被除去。将肌肉细胞连续传代到具有新培养基的组织培养皿或瓶中， 例如以约24小时间隔，直至MDC以存活并增殖的细胞保留富集在培养 物中，而例如在一系列超过约2次铺板例如约3-7次铺板、4-6次铺板、 或3-5次铺板的最后，几乎没有成纤维细胞成分。MDC的终末群体被富 集为能形成肌肉纤维细胞，例如成肌细胞或早期肌肉来源的细胞，当 注射到动物组织例如肌肉组织中时，其中MDC存活，细胞群恢复并增 殖。所得这种终末MDC细胞群体被导入需要治疗的宿主中，例如以治 疗神经退行性疾病。根据需要，这些MDC也可用载体转染或转导，这 些载体可表达基因产物例如异源基因产物如生长因子、生长因子受体、 肽神经递质或参与神经递质合成的酶，包括氨基酸、生物胺和神经肽。

在具体方面，本发明涉及利用MDC支持移植或植入组织神经支配、 或神经组织再生的方法，其中当导入到组织环境中时，MDC增殖并存活 数天、数周、数月或更长时间，以支持神经组织的神经支配或再生。 当注射到需要修复神经细胞和组织的组织位点时，MDC可暴露于因子、 信号和引入或移植的周围环境中的其它成分。另外，可工程化MDC以 含有和表达某些蛋白，这些蛋白可改善或促进和／或增强移植或植入 组织的神经支配、或修复肌肉和／或神经细胞生长。因此，在神经组 织环境中，产生或传递的信息能影响神经元细胞系的细胞发育以修复 该环境中的缺陷、损伤和破坏等。

本发明也提供利用此处描述的从骨骼肌中分离并富集的MDC而基 于细胞的治疗方法，用于治疗、修复或帮助恢复疾病、损伤、破坏或 功能障碍的肌肉组织以及相伴随神经细胞或组织的破坏。在此方面， 本发明提供作为基于细胞的治疗的MDC，用于治疗导致多种泌尿生殖功 能障碍的神经组织破坏，特别是在盆腔内根治性手术如前列腺切除术 后特别是根治性前列腺切除术后，其中神经组织例如海绵体神经组织 和／或盆神经组织被破坏。另外在此方面，本发明提供作为基于细胞 的治疗的MDC，用于治疗勃起功能障碍，这频繁伴随前列腺切除术，特 别是根治性前列腺切除术后海绵体神经组织和／或盆腔神经组织被破 坏。根据本发明，MDC促进神经元存活和再生，也能支持组织，例如， 破坏、损伤、疾病、或移植的组织的神经支配，因而允许修复神经组 织并伴随提供对术后相关功能障碍如勃起功能障碍的治疗和改善。本 发明的这方面也对盆神经修复有用；前列腺切除术和其它盆腔手术期 间可能发生盆神经破坏。这些神经损伤伴随膀胱排空障碍，如此处实 施例5中所述。因此，本发明的MDC对治疗由于尿道括约肌去神经支 配引起的内在括约缺陷是有优势的。根据此方面，MDC可给予到神经损 伤位点或目标器官的神经支配位点，例如阴茎、膀胱或括约肌，或两 者都给予。

本发明另一方面提供治疗或修复神经和肌肉组织破坏、损伤或功 能障碍的方法，优选在相同位点或相同位置，如修复与勃起功能障碍 相关的神经组织破坏和盆神经破坏。在具体方面，MDC促进或增强前列 腺手术后的神经恢复和勃起功能或膀胱功能恢复。在另一方面，MDC 促进或增强前列腺切除术或盆腔手术后的神经恢复和盆神经功能的恢 复。本方法涉及将MDC引入包括神经和肌肉组织两者的破坏、损伤或 功能障碍位点，并允许细胞增殖、分化并在所述区域恢复细胞群，以 修复有需要患者的神经和肌肉组织。

另一方面，从下面的详细描述和举例说明中，本发明具有的特征 和优点将显而易见。

发明详述

本发明涉及基于细胞的治疗方法，用肌肉来源的细胞（MDC）例如 成肌细胞或早期肌肉来源的细胞治疗、修复、改善或缓解神经退行性 疾病和神经和／或肌肉组织和器官的损伤、疾病、破坏、或功能障碍， 这些细胞分离自肌肉组织起始材料如骨骼肌细胞群体。获得用于这种 治疗的MDC的方法在此处描述；这些方法也已经描述于共同所有和共 同未决的专利申请：美国序号09/302,896和09/549,937，其全部内容 引入此处作为参考。

本发明提供身体早期肌肉细胞尤其是自体细胞的易获得的来源， 所述细胞可用于治疗和修复神经退行性破坏和神经细胞和组织的疾 病、紊乱和损伤例如神经肌肉疾病。如果可用于例如累及神经和肌肉 组织两者的疾病、紊乱、损伤或功能障碍，特别是在相同位置，MDC 也有利的用于治疗和修复肌肉相关损伤、疾病、破坏或功能障碍。

另外和如果期望或需要，MDC可被遗传修饰以含有表达载体例如质 粒或病毒，其中含一个或多个被表达的异源多核苷酸，并且其表达产 物在引入MDC的位点体内产生。因此，所述细胞可被遗传工程化以含 有一或多个核酸序列，这些序列编码一或多个活性分子并表达这些分 子，包括蛋白质、多肽、肽、激素、代谢物、药物、酶等。因此MDC 可用于表达生物活性物质，例如神经递质或生长因子，并可以作为这 些物质的长期局部递送系统在损伤、破坏、疾病或功能障碍位点或其 附近起作用。

可用多种本领域技术人员已知的分子技术和方法对MDC进行遗传 工程化，例如转染、感染、转导或直接DNA注射。此处所用的转导一 般表示通过引入病毒或非病毒载体到细胞中而已被遗传工程化以含有 一或多种编码外源或异源产物的多核苷酸的细胞。优选病毒载体。转 染更常见地表示已被遗传工程化以含有一或多种编码外源产物的多核 苷酸的细胞，这些多核苷酸位于质粒或非病毒载体中。MDC可以被不同 载体转染或转导并因此用作基因递送载体以允许感兴趣基因产物在所 述组织或器官位点或其附近被表达和生产。

尽管优选病毒载体，本领域技术人员将意识到对细胞进行遗传工 程操作以含有编码期望蛋白或多肽、细胞因子和其它等的核酸序列可 用本领域已知的方法实施，例如美国专利5,538,722描述的内容，包 括融合、转染、由DEAE-Dextran或磷酸钙沉淀介导的脂转染（Graham  and Van Der Eb,1973,Virology,52:456-467;Chen and Okayama, 1987,Mol.Cell.Biol.7:2745-2752;Rippe et al.,1990,Mol. Cell.Biol.,10:689-695）；使用高速微粒的基因轰击（Yang etal., 1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:9568-9572）；微注射（Harland  and Weintraub,1985,J.Cell Biol.,101:1094-1099）；电穿孔 （Tur-Kaspa etal.,1986,Mol.Cell.Biol.,6:716-718;Potter  etal.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:7161-7165）；负载 DNA（载体）的脂质体（Fraley etal.,1979,Proc.Natl.Acad.Sci. USA,76:3348-3352）；lipofectamine-DNA复合体；细胞超声处理 （Fechheimer et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84: 8463-8467）；受体介导的转染（Wu and Wu,1987,J.Biol.Chem.,262: 4429-4432;Wu and Wu,1988,Biochemistry,27:887-892）；等。 在另一个方案中，逆转录病毒或质粒载体可被包裹在脂质体中、或偶 联到脂质上，然后导入细胞中。此外，cDNA、合成产生的DNA或染色 体DNA可以被用作载体插入片段，使用已知并由本领域技术人员实施 的方法和方案。

生产复制缺陷型逆转录病毒的标准方案在以下参考文献中提供， 例如M.Kriegler,1990,"Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,"W.H.Freeman Co.,NY;和E.J.Murry,Ed., 1991,"Methods in Molecular Biology,"vol.7,Humana Press,Inc., Clifton,N.J.，其中包括以下步骤：1）将外源遗传材料整合到质粒 中；2）用质粒转染包装细胞系并用包装细胞系生产重组逆转录病毒； 3）从组织培养基中收集病毒颗粒；和4）用病毒颗粒感染靶细胞。

含所有表达必需元件的表达载体有商品供应并且本领域技术人员 已知。见例如Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning:A  Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor  Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY;F.M.Ausubel et al. (eds),1995,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley  &Sons,Inc.,New York,NY;D.N.Glover(ed),1985,DNA Cloning: A Practical Approach,Volumes I and II;M.L.Gait(ed),1984, Oligonucleotide Synthesis;Hames and Higgins(eds),1985, Nucleic Acid Hybridization;Hames and Higgins(eds),1984, Transcription and Translation;R.I.Freshney(ed),1986,Animal  Cell Culture;Immobilized Cells and Enzymes,1986,(IRL Press); Perbal,1984,A Practical Guide to Molecular Cloning;The Series, Methods in Enzymology,Academic Press,Inc.;J.H.Miller and  M.P.Calos(eds),1987,Gene Transfer Vectors for Mammalian  Cells,Cold Spring Harbor Laboratory;Wu and Grossman(eds), Methods in Enzymology,Vol.154;Wu(ed),Methods in Enzymology, Vol.155。

根据本发明一个实施方案，用于转染或感染的媒介物或载体构建 体的例证性实例包括复制缺陷型病毒载体、DNA病毒或RNA病毒（逆转 录病毒）载体，如腺病毒、单纯疱疹病毒、修饰的HIV载体和腺伴随 病毒载体。优选的是腺病毒载体。这些载体包括用于表达异源分子如 生物活性分子（例如蛋白质、多肽或肽）的一种或更多启动子。可以 使用的合适启动子包括但不限于腺病毒启动子如腺病毒主要晚期启动 子；异源启动子如巨细胞病毒（CMV）启动子；呼吸道合胞病毒（RSV） 启动子；诱导型启动子如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启 动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶 启动子如单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTR（包括修饰的 逆转录病毒LTR）；β-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。所述启 动子也可以是控制编码所述多肽的核酸序列的天然启动子。优选病毒 载体一般来源于非细胞致病性真核病毒，其中非必需基因已经被感兴 趣核酸序列替换。非细胞致病性病毒包括逆转录病毒，其经过病毒基 因组RNA逆转录成DNA并随后原病毒整合入宿主细胞DNA而复制。

逆转录病毒已经被批准用于人基因治疗试验。一般来说，所述逆 转录病毒是复制缺陷的，即能指导期望蛋白合成但不能制造感染性颗 粒。可以从中衍生逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于莫 洛尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒如劳斯肉瘤病毒、哈维 肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺 病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒。一般来说，用于创建病 毒载体的逆转录病毒优选在某些方面被减弱或突变以预防疾病传播。 如果希望，可以用感染性复制缺陷性病毒载体在体内注射细胞之前对 细胞进行遗传工程操作。在此方面，所述载体可以导入逆转录病毒生 产细胞进行双嗜性包装。肌肉来源的前体细胞自然扩张入临近区域避 免大量注射入感兴趣位点或注射在该位点。

载体一般基本不含原核DNA并可以包含多种不同功能的核酸序列。 这种功能性序列的实例包括核酸如DNA或RNA，包含转录和翻译起始的 序列和终止调节序列，包括启动子（例如强启动子、诱导型启动子和 其它等）和增强子，例如它们在食管或小肠细胞中有活性。另外作为 所述功能性序列的部分还包括编码感兴趣蛋白、多肽或肽的开放读码 框（核酸序列）。为了定点整合也可以包括旁侧序列。在某些情况下， 5’-旁侧序列可允许同源重组，因此改变转录起始区的性质，从而例如 提供诱导型或非诱导型转录以增加或降低转录水平。

所使用的载体通常也包括复制起点和在宿主细胞中复制必需的其 它基因，这已经被本领域技术人员常规使用。作为实例，包含复制起 点和由特定病毒编码的与复制相关的任何蛋白的复制系统可以被包括 为所述构建体的部分。复制系统的选择必须确保编码复制必需产物的 基因不能最终转化MDC自身。这种复制系统由如下述的复制缺陷性腺 病毒代表，例如G.Acsadi et al.,1994,Hum.Mol.Genet.3:579-584 和EB病毒。复制缺陷性载体、特别是复制缺陷性逆转录病毒载体的实 例是下文描述的BAG，Price et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci. USA,84:156;和Sanes et al.,1986,EMBO J.,5:3133。将会理解， 最终基因构建体可以含有一个或多个感兴趣基因例如编码生物活性代 谢分子的基因。

一般来说，期望由MDC表达的核酸序列是结构基因或其功能片段、 节段或该基因部分的序列，所述序列对用作递送媒介物的细胞是异源 的并且编码期望的蛋白或多肽产物。所编码和表达的产物可以是细胞 内的，即保留在细胞的细胞质、核或细胞器中，或可以由细胞分泌。 为了分泌，可以保留所述结构基因上的天然信号序列，或可以使用所 述结构基因上不天然存在的信号序列。当多肽或肽是较大蛋白的片段 时，可以提供信号序列，以便通过分泌和在加工位点的加工，期望蛋 白将具有天然序列。根据本发明使用的感兴趣基因的实例包括编码细 胞生长因子、抑制分子、细胞分化因子、细胞信号转导因子和程序性 细胞死亡因子的基因。

优选存在标记物以选择含所述载体构建体的细胞。该标记物可以 是诱导型或非诱导型基因并将一般的允许分别在诱导或不诱导时进行 阳性选择。常用标记物基因的实例包括新霉素、二氢叶酸还原酶、谷 氨酰胺合成酶等。所用载体也一般的包括复制起点和在宿主细胞中复 制必需的其它基因，这已经被本领域技术人员常规使用。作为例子， 含复制起点和由特定病毒编码的与复制相关的任何蛋白的复制系统可 以被包括为所述构建体的部分。

在一个实施方案中，最终基因构建体优选含有至少一个基因或多 核苷酸序列，它们编码产物并优选编码生物活性产物，这可用于治疗 中枢或周围神经系统的特定紊乱。在某些情况下，生物活性产物可用 于治疗肌肉相关紊乱、疾病或功能障碍。在另一些方面，比如同时治 疗神经和肌肉障碍、疾病或功能障碍，提供一或多种编码影响神经细 胞/组织的产物的基因或多核苷酸和一或多种编码影响肌肉细胞/组织 的产物的基因或多核苷酸。生长因子产物可以被表达和分泌；这种产 物包括蛋白质、肽、有丝分裂原、或对生长、增殖、分化或趋向性有 影响的其它分子。能被用于治疗CNS障碍的生长因子产物的非限制性 实例包括神经生长因子（NGF）、睫状神经营养因子（CNTF）、脑来源的 神经营养因子（BDNF）、神经营养蛋白3、神经营养蛋白4、白细胞介 素、成纤维细胞生长因子1和2（FGF-1，FGF-2）、胰岛素样生长因子、 糖皮质激素、促生长素抑制素、血小板来源的生长因子（PDGF）、破伤 风类毒素、TGF-α和β、表皮生长因子和视黄酸。此外，可以修饰MDC 以表达和生产生长因子受体如前述生长因子的受体或trk家族神经营 养蛋白受体（例如trk、trkB、trkC），或表达和生产神经递质或其受 体例如血清素、L-多巴、多巴胺、速激肽、P物质、肾上腺素和去甲肾 上腺素、脑啡肽、GABA、乙酰胆碱、谷氨酸、谷氨酰胺、组胺、和其 它等。

对于基于MDC的治疗，优选从自体或异体（例如同种异体）的人 或动物来源获得骨骼肌外植体。自体动物或人来源特别适合。然而， 同种异体或非自体供体包括MDC的成人、胎儿、胚或胎儿供体细胞来 源以及异种来源都包括在本发明内。在CNS情况下，对宿主使用异种 来源的MDC不如身体其他位点关键，因为CNS自身倾向于是免疫优势 的。因此当有对异种植入物的免疫应答时，相对于身体其它位置的反 应而显著降低。然而，为确保使用异种植入物时不被排斥，可以使用 降低或消除对引入或植入细胞或组织的免疫应答的方法。因此，通过 使用免疫抑制药物（如环孢霉素）或通过用局部给药的免疫抑制剂的 局部免疫抑制治疗（例如Rossini的美国专利5,026,365描述用于局 部免疫抑制的胶囊化方法），宿主或受体可以被免疫抑制。替代性方法 可以涉及采用同源重组的基因替换或敲除，如去除MHC或HLA基因以 降低供体细胞的抗原性；表面修饰；或组织分型以匹配供体和受体的 组织相容性类型，特别是同种异体供体细胞。（也见，例如，Weiss等 人的美国专利6,497,872）。

为向接受的宿主，优选哺乳动物包括人引入或移植根据本发明的 MDC和/或含MDC的组合物，制备单核的MDC悬液，优选如此处所述从 骨骼肌来源或自体骨骼肌来源。以可有效在组织或器官中恢复细胞群 体和再生的量，将MDC引入或给予接受者（动物，例如哺乳动物，包 括人）的组织或器官中。可以用标准临床技术确定为治疗、修复、促 进、增强、或改善对组织或器官的损伤、状况、病理、紊乱或破坏的 MDC有效量。MDC的“有效量”或“药学有效量”表示在根据本发明使 用MDC的情况下，治疗、修复、促进、增强、改善和其它相似处理疾 病、状况、病理、紊乱、损伤、破坏或功能障碍的有效量。在一个具 体实施方案中，有效MDC量包含在神经破坏、疾病或损伤位点有效促 进或增强轴突再生和/或神经元存活的量；在另一个实施方案中，有效 MDC量包含有效促进或增强与神经破坏或神经病变相关组织中的神经 支配的量；在另一个实施方案中，有效量MDC包含在相同组织位点或 位置有效修复周围神经和肌肉组织的量；在另一个实施方案中，有效 MDC量包含有效促进或增强宿主组织或器官中组织或器官移植物或植 入物的神经支配的量；在另一个实施方案中，有效MDC量包含有效支 持周围神经尤其是自主神经再生的量，这些神经在根治性盆腔手术尤 其是根治性前列腺切除术中受到损伤；在另一个实施方案中，有效MDC 量包含前列腺切除术后有效促进或增强组织的神经支配的量；和在另 一个实施方案中，有效MDC量包含有效促进或增强切断或部分切断的 组织或肢体在手术重连接后的神经支配的量；在另一个实施方案中， 有效MDC量包含有效预防或延缓周围皮肤轴突在破坏或损伤后的退化。 对于所包括的实施方案这些有效量可以相同或不同并容易由执业医生 确定。如果与MDC一起在给药制剂中联合使用另一种治疗剂，治疗剂 的有效量表示有效提供所述治疗剂治疗作用的量。制剂中待使用的精 确剂量也依赖于给药途径以及个体患者的状态如年龄、健康和生命体 征统计、和疾病、状况或紊乱的严重程度。给药剂量应该根据执业医 生基于对患者评价和患者生理条件和病史的考虑的判断决定。此外， 体外测试任选可用于帮助确定最佳剂量范围。可从来源于体外或体内 动物模型测试系统的剂量－反应曲线外推出有效剂量。

MDC可包含组合物，包括悬液。这些悬液含有在生理学可接受的载 体、赋形剂或稀释剂中的本发明MDC。MDC悬液中的细胞数目和给药模 式可根据待治疗位点和状况而变化。作为本发明的非限制性实例，注 射约1-1.5×10⁴到1.5×10¹⁰、或约1-1.5×10⁶到1-1.5×10⁸、或 约1-1.5×10⁶MDC用于治疗约8mm直径的组织或器官破坏区域，例 如用于包含肌肉和/或神经组织的区域。应该理解，有经验的执业医生 可根据每个病例确定的要求、限制和/或优化而确定和调整用于基于 MDC的治疗中的MDC的量。包含MDC的组合物的其它非限制性实施例包 括组织工程化的构建体，例如含胶原的支架和基质、小肠粘膜下层 （SIS）和SIS凝胶，例如共同未决的专利申请美国序号10/081,835， 其内容引入此处作为参考。对于提供MDC的支持结构和防止MDC从注 射或植入位点的不期望迁移，这些构建体特别有利。

用于给予受试者的MDC悬液可包含例如在无菌溶液中的约10⁴到 10¹⁰细胞/ml或约10⁴到10⁸细胞/ml或约10⁴到10⁶细胞/ml，无菌溶液 例如生理盐水或作为胎牛血清替代物而改进含受试者血清的完全培养 基。另外，MDC悬液可以是无血清、无菌溶液，如冻存液（Celox  Laboratories,St.Paul,MN）。然后MDC悬液可通过注射引入供体组 织的一个或更多位点。例如通过注射或移植将MDC引入中枢和周围神 经系统中被破坏的区域，允许修复这种损伤或破坏，如通过产生适当 细胞类型、通过修复损伤或破坏的回路、通过促进或增强神经细胞支 配和/或通过提供神经递质以恢复或改善神经功能。MDC提供可靠的既 非致肿瘤也非永生化的细胞来源，这些作用通过转染或转化而导致。

神经紊乱和CNS或周围神经破坏的动物模型适于证明MDC用于治 疗神经紊乱、破坏和损伤的功效。例如，MDC可给予以任何方式获得的 具有异常神经病或神经退行性症状的任何动物，包括作为试验操作造 成的机械、化学或电解损伤的结果而获得，这些操作如神经区域抽吸、 神经组织或细胞冻伤或衰老过程。小鼠和大鼠是可接受模型系统的实 例。

MDC可作为含生理学可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药学或生理 学可接受的制剂或组合物被给予，并给予感兴趣受体动物的组织，包 括人和非人哺乳动物。可通过重悬细胞在合适液体或溶液中来制备含 MDC的组合物，液体或溶液如无菌生理盐水或其它生理学可接受的水性 注射液体。这些组合物中的待使用成分的量可由本领域技术人员常规 确定。也可在给予MDC之前、之后或与之一起给予或共同给予生长因 子和其它类似物。

可通过非胃肠道的注射途径给予MDC或其组合物，包括皮下、静 脉内、肌内和胸骨内。其它给药方式包括但不限于鼻内、鞘内、皮内、 经皮、经肠、注射插管、时控释放、经口和舌下途径。在本发明一个 实施方案中，可由内窥镜手术介导给予MDC。为治疗多种影响脑的神经 疾病或紊乱，可将MDC引入覆盖脑室的组织。几乎所有受疾病或紊乱 影响的脑区的脑室系统允许更容易接近脑部的不同区域。例如为了治 疗，可植入装置如插管和渗透泵以给予MDC、遗传修饰的MDC或MDC 和生长因子，优选包含药学可接受的组合物。直接将MDC注射到组织 如脑室组织也是合适的给药方式。而后，作为疾病或损伤的结果，MDC 可迁移到需要治疗的那些区域。例如，通过MDC或其后代，与很多脑 区紧密接触的脑室有益于分泌或引入的神经物质扩散入治疗位点中或 其周围。

例如为向接受者注射给药，含MDC的组合物是无菌溶液或悬液或 可以重悬于药学或生理学可接受的水性或油性介质例如SIS凝胶中， 其中可含有防腐剂、稳定剂和提供与接受者体液（即血液）等渗的溶 液或悬液的物质。适用的赋形剂的非限制性实例包括水、磷酸盐缓冲 液（pH7.4）、0.15M氯化钠水溶液、右旋糖、甘油、稀乙醇、和类似物、 及其混合物。稳定剂实例是聚乙二醇、蛋白质、糖、氨基酸、无机酸、 和有机酸，它们可单独或混合使用。给药量以及给药途径根据个体基 础确定，并对应本领域技术人员已知的相似类型的应用或适应症中使 用的量。

为使例如组织或器官移植和植入中的基于细胞的治疗成功性最 大，希望供体和受体之间的免疫学匹配尽可能接近。如果没有自体来 源可以用，可以分析供体和受体的I类和II类组织相容性抗原以确定 可用的最接近匹配。这使免疫排斥降到最低或使之消除，并降低免疫 抑制或免疫调节治疗的需要。如果需要，可以在注射或移植程序之前、 期间和/或之后开始免疫抑制或免疫调节治疗。例如环孢霉素A或其它 免疫抑制药物可被给予所述移植受体。也可在移植之前用本领域已知 的替代方法诱导免疫耐受（例如D.J.Watt et al.,1984,Clin.Exp. Immunol.55:419;D.Faustman et al.,1991,Science 252:1701）。

与本发明一致，可将MDC给予CNS或周围神经系统组织，其中包 含神经细胞或其它细胞类型，如脑、脊髓、周围神经以及肌肉组织（即 骨骼/横纹肌或平滑肌），以治疗具有异常神经病或神经退行性症状、 紊乱、状况或影响的动物中的多种疾病、功能障碍、损伤和破坏。脱 髓鞘疾病、外周神经退化和肌营养不良疾病是本发明细胞和方法适用 的状况实例。对于前脑区域受影响的那些神经疾病和紊乱，例如帕金 森病、亨廷顿氏病或阿尔茨海默病，MDC、表达神经或生长因子的MDC、 和/或MDC和生长因子可被引入前脑脑室。作为更具体的实例，对于帕 金森病，纹状体受低水平多巴胺影响。因此，MDC和多巴胺例如表达多 巴胺的MDC或联合多巴胺一起给予MDC可以被使用（例如，向侧脑室 给药）以治疗或修复受影响的纹状体细胞并提供多巴胺以在需要的地 方增加这种神经化合物的水平。这样的用途提供超过使用药物左旋多 巴的优点，对于左旋多巴患者可能随着时间产生耐受或产生不利的副 作用。对于紧邻脑室周围的CNS组织，治疗可包含向腰池给药以使循 环遍及CNS。为治疗运动神经元疾病如肌萎缩性侧索硬化（ALS）、或为 治疗脱髓鞘疾病如MS，单独MSC或与其它治疗物质组合的MDC可以被 给予到中央管。

MDC和使用MDC的方法可被用于治疗多种CNS和周围神经系统紊 乱、疾病和损伤。作为治疗靶的神经退行性紊乱、疾病和损伤的非限 制性实例包括，例如，帕金森病及其相关运动障碍；阿尔茨海默病； 多发性硬化（MS）；肌萎缩性侧索硬化（ALS）；亨廷顿病；急性脑损伤 例如中风、脑瘫、头部损伤；脊髓创伤、损伤或感染；糖尿病；和其 它CNS功能障碍例如癫痫、抑郁、精神分裂和瘫痪；和周围神经损伤、 退化或炎症。其它疾病包括脱髓鞘疾病如脑硬化、弥漫性脑硬化、播 散性静脉周脑脊髓炎、视神经脊髓炎、多发性硬化（Charcot and  Marburg型）、视神经脊髓炎、同心硬化、急性播散性脑脊髓炎、后脑 脊髓炎、疫苗接种后脑脊髓炎、急性出血性白质脑病、进行性多病灶 性白质脑病、特发性多神经炎、白喉神经病、Pelizaeus-Merzbacher 病、脑桥中央髓鞘溶解症（central pontine myelinosis）、海绵样脑 白质营养不良和脑白质营养不良（Alexander型）。

在其它实施方案中，MDC和使用MDC的方法可被用于促进和/或增 强移植组织或器官与宿主组织和器官之间的神经元突起如轴突和树突 的存活和/或生长。非限制性实例包括例如在修复严重烧伤或发生周围 神经破坏的其它皮肤组织损伤中的自体、同种异体或异种皮肤或皮肤 替代物移植。然而另一个非限制性实例包括根据本发明的MDC用于促 进和/或增强经受手术重连接的截断肢体或器官中的神经元存活和神 经支配或再支配的用途。在相关实例中，MDC可被用于促进和/或增强 移植的自体、同种异体或异种组织和器官的神经支配。

本发明包括的另一个实施方案涉及MDC用于治疗神经源性背痛和 其它与腰髓破坏或疾病相关的疼痛状况例如坐骨神经痛的用途。背痛 尤其是下背痛经常是来自由于腰神经根病、骨侵入（bony  encroachment）或病毒感染对脊髓神经的损伤或刺激。根据本发明的 MDC可提供支持恢复与背部、脊髓或脊椎的疾病、状况或紊乱相关的破 坏或损伤的神经，并进而降低疼痛。

MDC在治疗脱髓鞘疾病中特别有优势。引入要求再髓鞘化位点的 MDC可以用作有益的再髓鞘化治疗剂。为了引入所述MDC使之可以与待 修复的脱髓鞘化轴突结合，所述MDC可一次或更多次注射到脱髓鞘化 靶区域或其周围的位点，即具有脱髓鞘化轴突的位点。此外，正如通 过β-半乳糖苷酶标记物表达观察到的，已经显示所述MDC可存活更长 时间，例如引入脑中后超过4周，和最高达10周或更长，从而证实它 们用于处理和治疗对于神经退行性疾病、障碍和损伤的有效性和效力。

在另一个实施方案中，已经暴露于神经营养或神经病学因子如NGF 的MDC培养物、或MDC的克隆或亚克隆，可用于筛选潜在治疗药物、 化合物、药剂、物质或组合物。这些测试物质，以不同量和不同时间， 可加到培养的MDC中，以确定或监测细胞对这些测试物质的反应。所 述细胞的细胞生长调节和物理特性变化可通过用显微镜观察细胞增殖 来确定，其中使用或不使用其它已知技术如免疫染色等。如果用测试 物质诱导新的或增加水平的蛋白如酶、受体、其它细胞表面分子、或 神经递质、氨基酸、神经肽或生物胺的表达，本领域已知并实际应用 的技术可用于鉴定这些分子的水平或其改变。这些技术举例但非限制 性的包括用抗特异性分子抗体的免疫组织化学，或生化分析如蛋白质 阵列、酶阵列、受体结合阵列、酶联免疫吸附测试（ELISA）、放射免 疫测试（RIA）、Western印迹和高效液相色谱（HPLC）。对于核酸分析， 可用Northern印迹确定所述分子或产生所述分子的酶的mRNA水平； 也可使用聚合酶链式反应（PCR）。

在相关实施方案中，如此处所述制备的MDC培养物、或其克隆或 亚克隆可被用于筛选测试物质、化合物、药物（drug）、药剂 （pharmaceutical）、化学品和有潜力用作神经病药物的其它试剂，它 们可以改善或提高MDC促进或增强神经治疗和修复的能力。这些测试 物质，以不同量和不同时间，可加到培养的MDC中。然后可用常规测 试如免疫染色检查所述MDC，以确定所述暴露细胞是否对所述测试物质 应答而被诱导分化成神经元表型。

作为本领域常规已知，商用试剂如抗体可被用于确定细胞标记物 和鉴定表面蛋白，它们典型表达于所述细胞表面。例如，对于神经细 胞类型，O4抗体（Boerhinger Mannheim）结合少突胶质细胞及其前 体；几种可获得抗体结合星形细胞，例如RNA2抗体（ATCC TIB-119； 以及ATCC CRL-2534、CRL-2535或CRL-2541；和抗破伤风类毒素抗体 （TT，Boerhinger Mannheim）结合神经元。抗标记物如结蛋白、CD56、 Sca-1等的其它抗体可用于确定细胞的细胞表面标记物谱。用MDC培养 物，可实施筛选和测试方法用于评价生物剂（如药物）对用于所述方 法的细胞增殖或对其存活或功能的潜在有害影响。作为指导，细胞铺 板密度可以是约5-10×10⁵细胞/ml、或约5-10×10⁶细胞/ml。

生物剂对细胞如神经元细胞或MDC的作用基于相对于一种或多种 对照培养物关于表型变化、表达表型比、细胞存活力和基因表达变化 的显著差异来确定。生物剂的非限制性实例包括加入培养基中的营养 因子如EGF、FGF、BDNF、CNTF、TGFα、GDNF和其它等。FGF已知可增 加神经元比率；CNTF已知可增加少突胶质细胞的比率。通过用显微镜 观察细胞形态和生长可以分析细胞的物理变化。可用电生理分析确定 任意的测试生物剂是否可影响细胞膜特性如静息膜电位、诱发电位、 电流方向和离子特征以及离子通道的动力学。这些类型的分析的实施 可使用本领域中进行分析的任何方法，例如细胞外单单元电压记录、 细胞内电压记录、电压钳、膜片钳和钙成像技术。这些方法也可包括 使用电压敏感的染料、光学成像和离子敏感电极。如此处理的细胞， 优选包含生理的组合物，可被移植入动物以进行进一步体内评价，如 确定长期存活、以及多种免疫学和生化特性，以及治疗或支持神经疾 病和障碍的治疗。

在另一个实施方案中，通过使用被引入接受的宿主动物组织位点 的MDC，本发明提供向包括人的接受的哺乳动物宿主细胞和组织的离体 基因递送。所述MDC也可使用工程化以含有编码期望基因产物的异源 基因的腺病毒载体而被病毒转导。这样的离体方法提供高效病毒基因 转移的优点，它比直接基因转移方法效率更高。离体方法涉及使用从 肌肉组织获得和分离的MDC。用作MDC来源的肌肉活体组织可以从损伤 位点或从临床医生更容易获得的另一个区域获得。

将会意识到，根据本发明，克隆分离物可以用多种本领域已知的 方法来源于MDC群体，例如用在组织培养基中有限稀释铺板的方法。 克隆分离物包含遗传学相同的细胞，它们来源于单个独立的细胞。此 外，可在有限稀释后用FACS分析获得克隆分离物，以达到每孔单个细 胞从而建立克隆分离的细胞系。MDC克隆分离物可用于本方法，以及用 于工程化所述细胞而表达一种或更多生物活性分子，或用于基因治疗。

在另一个实施方案中，首先用工程化病毒载体感染MDC，其中病毒 载体含有至少一种编码期望产物的异源多核苷酸，所述细胞悬浮于生 理学可接受的载体或赋形剂如盐水或磷酸盐缓冲液中，然后将MDC给 予到宿主的适当位点。与本发明一致，期望产物由所注射细胞表达， 并因此将所述产物引入宿主中。引入和表达的产物可用于治疗、修复 或改善损伤、功能障碍或疾病，这是由于本发明MDC在长时间期间表 达，以及在宿主组织中具有长期存活（超过2周，优选超过4周，更 优选超过6周，和最优选超过8周）。

举例说明而非限制性的，约10⁵到10¹²、或10⁶到10¹²、或10⁶到10⁸、 或10⁸到10¹²、或10⁸到10¹⁰、或10¹⁰到10¹²悬于生理相容介质中的MDC 细胞可以被植入期望组织用于70kg人的基因治疗。本发明MDC的这个 数目可以从来源于人的单个100mg骨骼肌产生。为治疗具体的损伤位 点，遗传工程化的MDC到给定损伤组织或位点的注射液中包含溶液或 悬液中的治疗有效量的细胞，例如约10⁵到10¹²细胞/cm³待治疗组织， 所述细胞在生理学可接受的介质中。

在本发明另一个实施方案中，在适当指导和被批准的条件和规则 下，人胎儿或胚MDC可被用于移植方法和治疗，而具有最少或没有由 于潜在供体－宿主不相容性的排斥问题。例如，来自胎儿肢体肌肉（早 期骨骼肌）的人MDC被发现是免疫耐受的并表现高水平存活，因为它 们在注射后能在SCID小鼠中维持超过2周（例如见PCT/US 01/12084）。 因此，在适当指导、规则和条件下，人胎儿MDC可被使用并经连续铺 板而富集，用于此处所述的治疗和移植。

本发明的另一个实施方案涉及MDC用于促进和/或增强移植或植入 组织或器官的神经支配或再支配的用途。具体然而非限制性的实例涉 及使用移植组织治疗烧伤。灼烧相关损伤经常伴随皮肤的周围神经的 破坏，导致感觉过敏、感觉迟钝和其它感觉缺陷。当前，自体全厚度 皮肤移植物、游离皮瓣和蒂状皮瓣是能恢复感觉功能的治疗选择。然 而，甚至在最佳条件下，由于移植或植入组织的不完全神经支配，感 觉仍有障碍。更有甚者，在使用组织工程化皮肤替代物进行移植时， 例如种植自体角质细胞和成纤维细胞的胶原基质时，触觉的恢复甚至 更不令人满意。本发明允许将MDC应用到损伤如烧伤位点，以增强损 伤的周围神经元突起如轴突和树突的存活，并促进和/或增强移植或植 入组织或器官如皮肤和皮肤替代物的神经支配。在根据本发明的另一 个实施方案中，MDC可被注射或施用到移植或植入组织或器官自身上。

也可将MDC种植到任何数量的用作皮肤替代物的组织工程化构建 体或工程化材料中，以促进和/或增强神经再生入皮肤替代物内。这样 的皮肤替代物可以单独或组合包含任意的以下成分：无细胞的尸体皮 肤基质、聚乳酸、透明质酸、聚乙醇酸、聚环氧乙烷、聚对苯二甲酸 丁二醇酯、硅酮、自体和/或同种异体的培养的成纤维细胞、自体和/ 或同种异体的培养的角质细胞、自体和/或同种异体的培养的表皮、自 体和/或同种异体的培养的上皮、去表皮的真皮、胶原海绵、胶原－脱 乙酰壳多糖海绵、脱乙酰壳多糖－交联胶原－糖胺聚糖基质、胶原凝 胶、polyglactin网、小肠粘膜下层（SIS）。本发明的该实施方案也涉 及含异源核酸序列的MDC的用途，其中所述异源核酸序列编码多种改 善性蛋白或多肽的表达，包括但不限于神经生长因子（NGF）、神经营 养蛋白3(NT3)、脑来源的神经营养因子（BDNF）和胶质细胞来源的神 经营养因子（GDNF）。将会明白以上实例只是代表性和非限制性的，因 为也可给予MDC以促进其它移植或植入组织的神经支配、或神经再支 配，包括但不限于平滑肌、骨骼肌、血管组织和腺体组织。

在一个实施方案中，本发明涉及促进或增强组织或器官移植物或 组织或器官植入物在宿主或器官中的神经支配的方法，其中包含：将 肌肉来源的细胞（MDC）引入包含所述组织或器官移植物或植入物与所 述宿主组织或器官之间边界的区域。熟练的从业者将会认识到，所述 MDC可以注射或引入到或临近移植或植入组织或器官与宿主组织或器 官之间形成的边界、边缘、边沿、边或周缘，或其区域。通过这种方 法，MDC促进宿主组织或器官与组织或器官移植物或植入物之间神经纤 维的存活和生长，并因此促进神经支配。在所述方法的一个实施方案 中，所述MDC或者对宿主组织或器官、或者对组织或器官移植物或植 入物是自体的。在所述方法的另一个实施方案中，用于移植或植入的 组织或器官选自消化、生殖、心血管、泌尿、呼吸、上皮、结缔、神 经元、内分泌、皮肤、平滑肌、骨骼肌组织或器官、或其部分或节段。 在所述方法的另一个实施方案中，所述组织或器官移植物或植入物包 含设计为具有模拟天然组织特性的皮肤替代物或工程化材料。在所述 方法的另一个实施方案中，所述皮肤替代物或工程化材料包括无细胞 的尸体皮肤基质、聚乳酸、透明质酸、聚乙醇酸、聚环氧乙烷、聚对 苯二甲酸丁酯、硅酮、自体的培养的成纤维细胞、异体的培养的成纤 维细胞、自体的培养的角质细胞、异体的培养的角质细胞、自体的培 养的表皮、异体的培养的表皮、自体的培养的上皮、异体的培养的上 皮、去表皮的真皮、胶原海绵、胶原－脱乙酰壳多糖海绵、脱乙酰壳 多糖－交联胶原－糖胺聚糖基质、胶原凝胶、polyglactin网、或小肠 粘膜下层（SIS）中的一种或多种。在所述方法的另一个实施方案中， 所述皮肤替代物或工程化材料与皮肤组织或皮肤组织成分组合引入。 皮肤组织或皮肤组织成分的示例性例子包括但不限于角质细胞、成纤 维细胞、黑素细胞、树突细胞、附器细胞（adnexal cells）、神经元 细胞、胶质细胞、内皮细胞、或平滑肌细胞。在该方法的另一个实施 方案中，所述MDC携带至少一种编码异源蛋白或多肽的异源多核苷酸， 以增强移植组织或器官的神经支配。合适蛋白或多肽的例子包括但不 限于生长因子、生长因子受体、肽神经递质、或参与神经递质合成的 酶中的一种或多种。更具体的，合适生长因子包括但不限于神经生长 因子（NGF）、睫状神经营养因子（CNTF）、脑来源的神经营养因子（BDNF）、 神经营养蛋白3、神经营养蛋白4、白细胞介素、成纤维细胞生长因子 1（FGF-1）、成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、胰岛素样生长因子（IGF）、 糖皮质激素、促生长素抑制素、血小板来源的生长因子（PDGF）、破伤 风类毒素、TGF-α、TGF-β、表皮生长因子或视黄酸。合适的生长因子 受体包括但不限于trk家族神经营养蛋白受体、神经生长因子（NGF） 受体、睫状神经营养因子（CNTF）受体、脑来源的神经营养因子（BDNF） 受体、神经营养蛋白3受体、神经营养蛋白4受体、白细胞介素受体、 成纤维细胞生长因子1（FGF-1）受体、成纤维细胞生长因子2（FGF-2） 受体、胰岛素样生长因子（IGF）受体、糖皮质激素受体、血小板来源 的生长因子（PDGF）受体、TGF-α受体、TGF-β受体、表皮生长因子（EGF） 受体或视黄酸受体。

在另一个实施方案中，本发明包括涉及关于MDC用作基于细胞的 疗法治疗勃起功能障碍的方法，所述疾病经常伴随前列腺切除术特别 是根治性前列腺切除术，其中神经组织如海绵体神经组织被破坏。根 据本发明，MDC可以支持组织例如破坏、损伤、疾病、或移植的组织的 神经支配，从而允许神经组织修复，并同时提供勃起功能障碍的治疗 和改善。这种特性对于此处实施例2和4描述的方法特别有利。在一 个实施方案中，本发明涉及促进或增强前列腺切除术后的神经恢复和 勃起功能恢复，其中包含向需要这种治疗的患者给予有效量的自体的 肌肉来源的细胞（MDC），以促进或增强患者的神经恢复和勃起功能恢 复。在一个实施方案中，所述MDC给予到一个或多个前列腺切除术的 吻合位点。MDC也可给予到以下组织或器官或其周围：海绵体神经、盆 神经、腹下神经、盆丛、和盆腔自主神经节，或给予入阴茎。在一个 实施方案中，在前列腺切除术后一定时间如6个月、1年或更长，如通 过膀胱镜检查再次给予MDC。在另一个实施方案中，通过将肌肉细胞悬 液铺板为至少两次连续培养物而从所述悬液中富集MDC，从而消除成纤 维细胞和非肌肉细胞并富集单核的MDC终末群体，其中包含成肌细胞 作为富集的肌肉来源的细胞群体。在另一个实施方案中，从骨骼肌组 织获得所述MDC。在另一个实施方案中，给予所述MDC的量为约10⁵到 10⁶细胞/cm³患者组织。在另一个实施方案中，与生理学可接受的载体、 稀释剂或赋形剂一起给予所述MDC。在另一个实施方案中，将所述MDC 的克隆群体引入患者。

实施例

提供下述实施例是为了举例说明本发明，而不是用于限制本发明 的目的。

实施例1

材料和方法

动物：正常小鼠（和Mdx小鼠（C57BL/10ScSn DMD^mdx/J），如果使 用）购买自Jackson Laboratories；如果使用，mdx/scid小鼠从mdx 和scid小鼠（C57BL/6J-Prkdc^scid/S2J，免疫缺陷）的近交获得。所述 mdx小鼠的特征是在肌纤维膜中缺少肌营养不良蛋白（dystrophin）， 这导致肌纤维退化和坏死。用于这些实验的所有动物操作方案被匹兹 堡儿童医院IACUC委员会批准（操作方案编号7/00和3/02）。

肌肉来源的细胞（MDC）：MDC来自C57BL/6J小鼠（5日龄）的原 代骨骼肌，其中使用涉及每两天或更长时间连续或系列对细胞铺板的 培养技术，从而产生富集的单核的、结蛋白阳性的、成肌细胞性MDC 的终末群体，这是每隔至少两天系列或连续传代到新培养板中的所述 肌细胞悬液的结果，基本上没有成纤维细胞和非肌肉细胞并富集存活 的培养MDC的终末群体。从这种技术获得细胞的克隆群体可使用本领 域使用的操作方案如有限稀释来建立。

MDC分离和培养：MDC分离自起始肌肉组织如骨骼肌样品以获得富 集的MDC群体。为此，进行系列铺板和培养步骤，从而导致富集MDC 终末群体，其特征是作为早期肌肉来源的细胞如成肌细胞，它们是存 活的、非成纤维细胞的、结蛋白阳性的、单核的和已形成的肌纤维。 在系列铺板、或传代/培养操作的最后分离得到MDC，其中操作包含连 续对所述肌肉细胞起始样品进行铺板。在连续将细胞铺板到新培养容 器期间，MDC（包括成肌细胞和早期肌肉来源的细胞）被从非MDC类型 如成纤维细胞和脂肪细胞、内皮细胞和结缔组织细胞中富集和分离。 可以超过约二天如约3-7天或4-6天或3-5天进行所述连续铺板，直 至如上述的增殖性、非成纤维细胞的MDC保留并在培养物中占优势。 在培养期间，通过将肌肉细胞的细胞悬液传代到包被或不包被胶原的 新组织培养皿或瓶中，贴壁的成纤维细胞和非肌肉细胞基本被从连续 细胞培养物中去除。初步去除贴壁的成纤维细胞发生在将所述肌肉细 胞起始样品放入培养容器中约1-24小时之后，在此之后用新培养基例 如以约24小时间隔将所述细胞连续传代到新组织容器即新培养皿或瓶 中，直至MDC的终末群体作为存活并增殖的细胞保留并富集于培养物 中，同时几乎没有成纤维细胞成分，例如这是在一系列约2-7次铺板、 3-7次铺板、4-6次铺板或3-5次铺板之后。这种MDC的终末群体在形 成肌肉纤维的细胞中被富集，如成肌细胞或早期肌肉来源的细胞，并 且当注射或引入动物组织或器官如肌肉组织中时具有如此处所述的功 能，在这些组织或器官中所述MDC存活、恢复细胞群体并增殖。如果 期望，这些MDC也可以用载体转染或感染，这些载体可以表达基因产 物如异源基因产物如生长因子、生长因子受体、肽神经递质、或参与 神经递质合成的酶，这些神经递质包括氨基酸、生物胺和神经肽。因 此，通过将起始肌肉细胞悬液铺板成至少两次连续培养物从而消除成 纤维细胞和非肌肉细胞并富集单核的、早期肌肉来源的细胞或成肌细 胞的终末群体，可以从所述起始肌肉细胞悬液中获得并富集MDC。

对于使用小鼠的具体试验，取出小鼠后肢骨骼肌并解剖分离出骨。 用解剖刀将肌肉切碎成粗浆液。在37℃在0.2％XI型胶原酶 （Sigma-Aldrich）中酶促解离所述肌肉组织1小时，然后在3500rpm 离心5分钟。收集细胞，在制备成2.4U/ml HBSS（GIBCO BRL）的dispase 酶（GIBCO BRL）中保温45分钟，然后在稀释于HBSS中的0.1％胰酶 -EDTA（GIBCO BRL）中保温30分钟。酶促解离之后，再次3500rpm离 心肌肉细胞并重悬于含DME的增殖培养基（PM），其中补充含有10%马 血清、10%FBS、0.5％鸡胚提取物和1％青霉素－链霉素（全部购自 GIBCO BRL）。

在这些试验中，在一系列培养物转移操作之后，其中涉及用容器 如组织培养瓶（或皿）如T25、T50、T150进行连续传代（也见US Serial  No.09/302,896和09/549,937）以培养所述细胞，从而分离MDC。所 述容器可以用胶原包被（I型胶原，Sigma Aldrich）。初步重悬于PM 中之后，此试验中的起始肌肉细胞悬液在胶原包被的瓶中铺板如约2 小时。允许成纤维细胞贴壁如约1-2小时之后，将非成纤维细胞转移 到其它瓶中。所述细胞在37℃、100%湿度、95%空气/5%CO2的培养箱 中培养约1天如24小时之后，收集瓶中的活细胞，3500rpm离心约5 分钟，再转移到新瓶中。一般来说，此时约1×10⁴-5×10⁴活细胞被转 移到新培养皿中。如以约24小时间隔，重复进行这种系列转移和铺板 活细胞到新培养皿/瓶中的操作，直至在后来的铺板（也称预铺板 （“preplates”））中，成纤维细胞被除去且培养物中富集结蛋白阳性 的、早期肌肉来源的成肌细胞性细胞。在这种系列铺板操作的最后， 即在最后一次铺板时，富集的MDC终末群体包含活的、生长中的、结 蛋白阳性的（大于约50%）、单核的肌肉来源的细胞，它们被用于注射 并能产生肌肉纤维。

在几天期间中进行系列铺板和培养，直至培养皿中去除成纤维细 胞和非肌肉细胞且只有MDC作为单核的成肌细胞被富集并保持存活和 生长。培养物中获得活MDC的系列铺板和培养过程涉及在初步将肌肉 细胞样品铺板后约3-7天、或约3-6天。连续转移和铺板非成纤维细 胞的细胞到新培养皿/瓶中允许富集非成纤维细胞的、单核的、结蛋白 阳性的早期MDC，它们在注射到动物中后在适当环境中产生肌纤维。

流式细胞术：为检测表面标记物表达，MDC分别与直接的和偶联生 物素的大鼠抗小鼠单克隆抗体（如特异性抗c-kit、CD34、CD56、Sca-1 和CD45的抗体；所有抗体来自Pharmingen）保温30分钟，将链亲和 素-别藻蓝蛋白偶联物加入生物素化抗体标记的细胞中保温20分钟。 在FACSCalibur（Becton Dichinson，San Jose，CA）流式细胞仪上 用Cell Quest软件分析标记的细胞。

组织学：肌肉和组织切片固定于1%戊二醛中，用X-gal底物在37 ℃保温过夜，然后用伊红复染。用抗小鼠抗β-半乳糖苷酶的第一抗体 （1：100，Chemicon，Temecula,CA）进行β-半乳糖苷酶/GFAP/Hoechst 共定位以显示供体来源的细胞。

统计分析：通过对组织化学和免疫组织化学染色的肌肉切片进行 计算机图像分析，来测量注射MDC和伪注射组织中的神经面积以及肌 纤维直径。使用成对t检验比较注射MDC和伪注射组织之间的差异。 对于平均值之间差异，P<0.05的水平被认为具有显著性。

实施例2

本实施例描述在根治性前列腺切除术大鼠模型中使用MDC的神经 恢复和勃起功能改善。尽管外科技术在发展，勃起功能障碍（ED）是 接受根治性前列腺切除术的男性的常见后果。作为对环境提示的反应 以及根据本发明，发现MDC促进和/或增强中枢和周围神经系统中的轴 突再生。由于MDC能促进周围神经再生，进行试验评价MDC作为根治 性前列腺切除术后勃起功能障碍的治疗剂。

如上所述从正常成年小鼠的后肢取骨骼肌活组织并用于预铺板技 术以获得MDC。从铺板/培养技术（即约5-6天的系列培养）分离的异 体小鼠MDC用工程化以表达β-半乳糖苷酶报告基因的逆转录病毒转 导。大鼠海绵体神经截断用作根治性前列腺切除术后勃起功能障碍的 模型。三个试验组包括：（1）对照组（C，n=5）；（2）双侧海绵体神经 截断、伪注射组（T，n=6）；和（3）双侧海绵体神经截断、并在截断 位点接受MDC注射（3x10⁵细胞/每侧）组（M，n=6）。手术后两周，与 压力传感器连接的PE 20管插入海绵体并在电刺激（20Hz,0.5ms,10V） 盆神经期间测量海绵体内压（ICP）。然后处死动物并取海绵体神经截 断位点周围的组织进行LacZ染色。

C、T和M组的最大ICP分别是115±11.2cmH₂O、25.4±6.6cmH₂O 和52.5±9.5cmH₂O。MDC处理组（M组）的ICP显著大于伪注射组 （p<0.05）。LacZ染色显示在注射MDC区域周围有很多LacZ(+)细胞。 这些结果表明MDC能修复损伤周围神经并改善勃起功能的免疫组织学 和功能性证据。根据本发明，勃起功能障碍是在根治性前列腺切除术 时使用MDC治疗的候选状况。

实施例3

根据本发明的MDC用于烧伤相关周围神经破坏的动物模型。从裸 鼠背部切除2.5cm²全厚度皮肤区域以模拟严重烧伤的作用。在试验组 中，在移植组织工程化皮肤替代物之前根据本发明的MDC被施用到全 部损伤区域。而在对照组中，移植前不施用MDC。所述皮肤替代物包含 种植人角质细胞和成纤维细胞的胶原海绵基质。在移植后40、70和120 天处死小鼠，重构皮肤的活组织样品用于免疫组化和组织学分析以证 明神经再生和支配。通过抗体染色蛋白质基因产物9.5（PGP9.5），即 一种神经元细胞特异性表型标志物，而检测轴突。通过抗体染色蛋白 S100，即一种表达于胶质细胞中的钙结合蛋白，来检查移植组织中及 其周围施旺细胞的存在和丰度。

实施例4

本实施例描述用于调查治疗方法的临床研究和方案以及相关试 验，所述治疗方法通过注射自体MDC用于在根治性前列腺切除术时预 防、降低或改善压力性尿失禁和勃起功能障碍的问题。

至少18岁具有前列腺癌并准备接受根治性前列腺切除术的男性， 并且乙肝、丙肝、HIV和牛蛋白变应原检测阴性，这样的男性符合参与 研究的标准。知情同意参与研究的合格患者按初次门诊程序访问泌尿 诊所，其中用针刺活组织检查技术收集肌肉细胞。样品经连续细胞铺 板/培养技术处理，从而得到富集的非成纤维细胞、活的、增殖中的、 单核的、肌肉来源细胞（成肌细胞）终末群体，它们可以产生肌管。 细胞处理遵守良好组织规范以预防污染并保留组织功能和完整性，并 包括明确规定的组织和细胞操作、处理和鉴定程序。富集的MDC终末 群体在培养中扩展以获得更多数目的细胞用于随后用途。

几周后，分离并扩增的MDC被冷冻并运输到调查医生。扩增MDC 在含人血清白蛋白（HSA）的低温介质中冷冻下提供给医生。然后所述 MDC被解冻并用生理盐水稀释，由医生或临床医师注射给患者。接触患 者尿道周围组织的材料包括患者自身的MDC、悬浮并运送细胞的冷冻介 质和用于稀释注射混合物的生理盐水。

在直接观察下所得悬液在患者接受根治性前列腺切除术时被注射 到尿道吻合处。在治疗后1、3、6和12个月评价患者不利事件和尿失 禁以及性功能的发生率。如果在6个月随访时没有改善，通过简单的 门诊膀胱镜检查注射程序而无需重复肌肉活组织检查，患者可以选择 用所述肌肉细胞注射进行重复治疗。

从由于注射MDC悬液而增加的物理量可以预期出现初步治疗作用。 然而，所述细胞可保持存活并在注射处维持更长期作用。最终，并且 不希望受理论约束，所述组织环境“指导”所注射MDC重建为与天然 尿道括约肌相似的组织，进而随时间改善尿失禁。在根治性前列腺切 除术的吻合位点注射MDC可用于在恢复过程中保护阴茎神经和促进或 增强勃起功能恢复。

本实施例涉及多达20位患者的小规模、单中心研究，意图鉴定建 议治疗方案的安全性和潜在疗效。患者用作自身对照，在治疗前和治 疗后多个时间点定量和定性测量评价尿失禁和勃起功能。在治疗后一 年对患者进行随访为了注射，自体MDC悬于生理盐水中。

在根治性前列腺切除术时使用以下操作方案：

1．用标准技术，准备患者作根治性前列腺切除术。切除前列腺并 重新吻合膀胱颈和尿道后，在手术结束时实施注射MDC。

2．用等体积生理盐水稀释，使冷冻的MDC解冻，并将MDC悬液吸 入注射器。

3．根据制造商使用说明连接预充注射器与注射针。

4．直接观察下，将针尖插入尿道和尿道周围组织，并缓慢注射准 备的MDC悬液。在吻合处周围的三个位置进行这种操作。

5．记录注射的细胞悬液位置和体积。

在膀胱内注射6个月时，如果没有改善并且患者要求重复注射， 遵照以下操作方案：

1．用标准技术，给予适当麻醉以插入膀胱镜，使患者准备进行膀 胱镜检查。

2．准备带透镜和穿尿道针的膀胱镜，仔细观察确保针尖包含在远 端膀胱镜外套之内。

3．仔细推进膀胱镜到预期位置。

4．用等体积生理盐水稀释从而解冻MDC悬液，并将MDC悬液吸入 注射器。

5．根据制造商使用说明连接预充注射器与注射针。

6．直接观察下，将针尖插入尿道括约肌，并缓慢注射准备的MDC 悬液到粘膜下尿道壁中。

7．如果必要，在尿道周围多个位置继续注射直至观察到尿道关闭。

8.记录注射的细胞悬液位置和体积。

MDC注射需要的培训和经验包括熟悉根治性前列腺切除术、膀胱镜 检查和在尿道周围注射膨胀剂。

本领域临床医生和医师知道压力性尿失禁和勃起功能障碍是根治 性前列腺癌手术中两种最常见和令人烦恼的并发症。由于内源性括约 肌缺陷（ISD）的压力性尿失禁是远端尿道括约肌内在性功能异常的结 果。对于人，通常在根治性前列腺切除术后发生ISD。随着每年手术次 数的增加，前列腺切除术后尿失禁患病率继续增加。在一系列60位患 者中，67％前列腺切除术后尿失禁是单独由于I SD，这是用LPP技术作 为评价基础得出的（Carlson,K.V.and Nitti,V.W.,Prevention  and management of incontinence following radical prostatectomy. Urol.Clon North Am,28:595,2001）。在另一项研究中，对接受根 治性前列腺切除术的20位患者进行前瞻性尿动力学评价，在这20位 患者中有17位发现术后内在性括约肌压力组分。（Pfister,C.et al., Assessment of the intrinsic urethral sphincter component  function in postprostatectomy urinary incontinene.Neurourol  Urodyn,21:194,2002）。

勃起功能障碍（ED）定义为持续性不能实现或维持性满足需要的 勃起。ED估计单独在美国就影响高达约3千万男性（World Health  Organization International Consultation on Impotence.(WHO,1st  International Consultation in Impotence,Plymbridge  Distributors Ltd,Plymouth,UK,1998)。生活质量数据已经记载勃 起功能障碍对其他慢性健康状况如抑郁的重要性。由此，ED不仅破坏 性的影响男性而且也影响其性伴侣。尽管外科技术已有进展，但ED仍 然经常在接受根治性前列腺切除术后男性中发生。在那些重新勃起的 人中恢复可能被延长，在术后长达36个月的观察中启动并维持勃起得 到缓慢改善。与去除神经血管束上面的前列腺相关的创伤可能产生神 经麻痹（neuropraxia）。进而，局部炎症和免疫应答也可引起ED。常 规治疗如Viagra对有心血管疾病史的男性并不总是有效或安全。

向下尿道注射MDC的非临床试验已经在多种动物研究中进行。总 的来说，这些研究包括：1）初步评价注射到小鼠模型的膀胱壁后MDC 的持续性和分化；2）在自体大鼠模型中与注射牛胶原比较评估注射MDC 的持续性；3）评估在大鼠尿失禁模型中尿道周围注射异体MDC；4）前 列腺切除术后尿失禁模型中的MDC结果；和5）在前列腺切除术模型中 注射MDC对勃起功能障碍的作用。这些研究提供关于前列腺手术后用 MDC和注射治疗人的可行性模型。

前列腺切除术后压力性失禁模型：为产生与人患者中根治性前列 腺切除术类似的内源性括约肌缺陷，在成年Sprague-Dawley大鼠（n =16）中烧灼尿道中段旁侧的周围组织。烧灼一周后，将LacZ转染的 1.5×10⁶MDC注射到尿道中段周围。所述16只大鼠分成3组，MDC注 射后2、4或6周进行评价。作为对照，接受烧灼的9只大鼠一周后注 射Hanks’s平衡盐溶液(HBSS)。用垂直倾斜桌/膀胱内压力钳技术测量 渗尿点压力（LPP）来研究括约肌功能。用快速肌球蛋白重链和lacZ 染色评价所述MDC的位置。

电烧灼尿道对膀胱功能没有影响。注射MDC后2、4和6周后大鼠 的平均LPP分别是38.2±2.2cm H₂O、43.1±2.6cm H₂O和51.5±0.9cm H₂O。注射HBSS后2、4和6周后大鼠的平均LPP分别是17.2±1.4cm H₂O、 26.9±1.9cm H₂O和25.5±1.3cm H₂O。与时间匹配的对照组比较时， 每个对应的注射MDC组中LPP增加显著更高（p<0.001）。组织学分析 显示所述MDC有助于横纹肌和神经再生。因此，尿道周围注射MDC修 复ISD大鼠的破坏的尿道括约肌。

前列腺切除术后勃起功能障碍模型：支配海绵体的神经对雄性启 动和维持勃起是关键的。该神经的损伤是根治性前列腺切除术后勃起 功能障碍的主要来源。本试验的目的是确定在根治性前列腺切除术的 大鼠模型中MDC是否促进和/或增强周围轴突再生、并从而导致更快从 勃起功能障碍中恢复。

在本试验和与实施例2所述类似的试验中，如此处所述，经连续 培养以富集包括成肌细胞的早期肌肉来源细胞，从而从骨骼肌中获得 MDC。海绵体神经横断用作根治性前列腺切除术后勃起功能障碍的模 型。三个试验组包括对照组（C,n=6）；双侧海绵体神经横断组（T,n=6）； 双侧海绵体神经横断并注射赋形剂组（V,n=6）；和双侧海绵体神经横 断并在损伤位点注射MDC（3×10⁵细胞/每侧）组（V,n=6）。手术两周 后，切断耻骨联合并向侧边缩回髋骨以暴露远端海绵体神经。刺激电 极放置在盆神经上，而记录电极放置在损伤位点远侧。每次刺激（X Hz, 0.25ms,10V）后测量复合动作电位（CAP）。与压力传感器连接的PE 20 管插入海绵体，在电刺激（20Hz,0.5ms,10V）盆神经期间测量海绵 体内压（ICP）。

本试验的结果显示，与T和V组比较，M组中海绵体神经的CAP幅 度更大。然而M组的CAP没有对照组大。M组的平均最大ICP（52.5±9.5 cmH₂O）也显著大于T组（25.4±6.6cmH₂O），（p<0.05）。C组的ICP是 115±11.2cmH₂O。此分析表明，当从与电场刺激后ICP的相关性来看， CAP可用作神经恢复的良好指标。与仅伪注射组比较，对于海绵体损伤 大鼠，给予MDC促进恢复CAP并改善勃起功能。因此，在涉及阴茎神 经破坏的ED模型中，在神经破坏位点周围注射MDC改善了勃起功能， 因而支持使用MDC作为根治性前列腺切除术后勃起功能障碍恢复的促 进剂。

风险分析和评价：与男人中根治性前列腺切除术相关的风险与注 射MDC完全分离。参与注射MDC以治疗ED的临床研究相关的风险包括 与以下相关的内容：

膀胱镜检查：膀胱镜检查风险预期很少发生（约在1-10％人中出 现），并包括可能不适、出血、和感染。罕见的副作用（预期在少于1 ％人中发生）包括检查后不能排尿与膀胱穿孔。

肌肉活组织检查：肌肉活组织检查的风险预期很少发生（约在1-10 ％人中出现）并包括可能的伤口感染、血肿和疼痛。

静脉穿刺：静脉穿刺的风险包括出血、不适、轻微头痛、疼痛、 瘀伤，和罕见的取血位置的感染。

细胞注射：细胞注射的潜在风险包括免疫应答，尽管这种风险预 期是最低限度的，因为使用自体细胞并筛选患者对可能存在的痕量牛 蛋白的潜在反应。

尿道导管插入：尿道导管插入的风险预期很少发生（约在1-10％ 人中出现），并包括可能短暂的不能排尿、插入导管期间的不适、尿道 感染、出血和不适或疼痛。

尿动力学研究：尿动力学研究的风险与尿道导管插入相似，并包 括可能短暂的不能排尿、插入导管期间的不适、尿道感染和出血

牛皮肤点刺试验：确定是否患者对牛（母牛）蛋白过敏的皮肤点 刺变态反应试验的潜在风险可以包括少量出血、疼痛、皮疹、或可能 的过敏性休克。另外的风险预期与注射胶原的标准治疗相关的风险相 当，并且包括可能的连续失禁、失禁增加、尿潴留、感染、膀胱出口 阻塞、发热、形成肿瘤、注射材料移位和对注射试剂的变态反应。由 于使用自体细胞并基于动物模型研究的满意结果，细胞注射的风险预 期是最低限度的。

临床调查的目标：

要求和待验证的预期性能

本研究目标是确定建议治疗方案的安全性和潜在疗效。所述MDC 治疗的预期性能包括在剩余尿液体积、尿道感染、其它不利事件的发 生率方面的合理安全性，以及在改善患者生活质量（QOL）、渗尿点压 力（LPP）、失禁发生次数/24小时期间方面的对预防尿失禁和性功能障 碍的疗效。

待评价的风险和可预见不良反应

通过注射后膀胱镜检查评价出血和穿孔的风险。通过患者报告、 每日患者排尿记录和治疗后1、3、6和12个月的临床随访来评价连续 失禁、尿道感染、尿潴留、注射细胞移位和对注射试剂的变态反应的 风险。

待评估的具体假设

待评估的假设是，在出血、穿孔、尿道感染和排尿后剩余发生率 方面，所述MDC治疗是相当安全的，并且在改善生活质量（QOL）、减 少失禁发生次数/24小时期间和增加LPP和改善勃起功能方面观察到 具有疗效的证据。

调查设计：

对具有合理选择的待实施的调查类型的描述

本研究设计作为小规模、单中心的前瞻性调查，其中多达20位患 者作为自身对照。本设计适于初步确认建议治疗方案的安全性和潜在 疗效。

对照人群

在本研究中患者用作自身对照，评价治疗前与治疗后不同时间的 定量和定性尿失禁测量值。

避免偏差

依赖于客观性测量如膀胱日志（bladder diary），包括24小时垫 收集和失禁发生频率，使由于使用患者自身对照带来的潜在偏差降到 最小。

主要和次要的终点（结局）

主要终点包括：不良事件发生率；经尿动力学研究观察到的 valsalva LPP；膀胱日志中记录的失禁发生频率；和UCLA前列腺癌排 尿控制和性功能评分。次要终点包括：患者生活质量/患者满意度调查 （退出时）；和剩余尿液体积。

经合理选择的待测变量

参与研究者的待测变量包括病史、生命体征、膀胱日志、性功能、 CBC、血液化学、尿分析、妊娠状态、尿道高运动性（如果有）、剩余 尿液体积和经膀胱镜检查的尿道外观、经尿动力学的渗尿点压力。

评价、记录和分析变量的方法和时间选择

标准化数据格式用于记录数据。用标准方法确定病史、身体检查、 生命体征、CBC、血液化学、尿分析和妊娠状态。经膀胱日志并通过完 成UCLA前列腺癌指数来评价排尿控制和性功能评分。经膀胱镜检查评 价尿道和膀胱的外观。经尿动力学评价渗尿点压力（LPP）。经标准超 声技术评价排尿后剩余尿液体积。变量评价的时间选择在以下事件时 间表中给出。

事件时间表

M-1:注射后1月

x1:活组织检查/注射前

*阳性浸片试验要求尿培养

x2:活组织检查/注射后

除了表中选定的事件，经注射后24到48小时内电话联系患者评 价任何不利作用的发生率。对于总时间15或18个月的研究中，第6 个月接受第二次注射的患者的随访回到第一次注射的时间表（即随后 24-48小时、和1、3、6和12个月）。

入选和排除标准

符合参与研究的人将满足以下入选标准：（1）提供书面知情同意； （2）至少18岁；（3）有局限性前列腺癌并安排根治性前列腺切除手 术；（4）沿尿道和膀胱内有有活力的粘膜内层；（5）乙肝、丙肝和HI V 检测阴性；（6）对可能的痕量牛蛋白敏感性检测阴性；（7）尿培养阴 性、或阳性培养，预期到治疗时清除；（8）具有至少1年预期寿命；（9） 同意参与本方案要求的随访评价；和（10）PTT INR在正常范围内。满 足以下排除标准的人将不予登记：（1）已知具有膀胱输尿管反流、膀 胱过度活动症、逼尿肌不稳定、或高压不稳定；（2）正接受急迫性尿 失禁药物治疗；（3）有神经源性尿失禁；（4）有留置的导尿管；（5） 有神经肌肉疾病（如肌营养不良、多发性硬化症）；（6）有糖尿病；（7） 在可能的注射位点有组织纤维化；（8）有能导致显著的手术后并发症 的任何状况，包括正处于感染或因膀胱出口阻塞引起的剩余尿量增加 （即重复的PVR>150mL）；（9）病态肥胖（定义为超过理想体重100 磅）并预期不能从治疗中受益；（10）正处于膀胱炎或尿道炎或与之相 关的急性病况；（11）由于疾病状态或慢性类固醇或免疫抑制剂致使免 疫系统受损；或（12）由于试验或对照产品标签的禁忌症和/或警告而 排斥治疗的任何情况。

同意参与研究并满足所有入选标准后，在收集肌肉活组织时将患 者登记入研究中。向同意参与本研究并满足研究入选标准的患者给予 指导使之完成三天研究日志的方法。完成膀胱和性功能调查问卷以及 总体改善调查问卷。也收集患者血液和尿液样品供实验室分析，包括 筛选血源病毒。患者接受超声检查确定剩余尿液体积。此外，患者接 受变态反应皮肤试验以确定他们对可能的痕量牛蛋白是否敏感。

约两周后，患者按初步门诊程序看泌尿科医生，其中使用针活组 织检查技术收集肌肉细胞。活组织检查后约4周，患者回到医院接受 根治性前列腺切除手术，其中用小针将患者自身的处理后细胞注射到 尿道周围。患者也提供用于评价的研究日志、完成QOL和总体改善调 查问卷，收集尿样品用于实验室分析，并经超声确定剩余尿液体积。

注射后约24到48周，通过电话联系患者确定是否有任何不良作 用发生。在1、3、6和12个月时患者回来接受随访。每次随访时，患 者提供包括24小时垫收集的膀胱日志、完成QOL调查问卷、收集血液 和尿液样品供分析、并接受超声以确定剩余尿液体积。在第6个月时 间点上，患者也接受膀胱镜检查以评价尿道组织外观、接受尿动力学 研究以评价渗尿点压力。如果在第6个月随访时没有改善，患者可以 选择用肌肉细胞注射重复治疗，而不需重复采集肌肉活组织。这种病 例的随访回到第一次注射的时间表（即随后24-48小时和1、3、6和 12个月）。活组织穿刺针用于肌肉组织收集。生理盐水用于稀释和解冻 冷冻的MDC，所述MDC冷冻于含HSA的冷冻介质中。所述MDC可以含有 痕量牛血清。

患者保持在本研究中直到注射其MDC后完成12个月的随访。如果 在任何时间患者声明他们不希望继续参与，他们可以无偏见或无护理 损失地退出。根据主要研究人员的判断，如果认为对患者的医疗护理 有最佳利益，可以让患者退出研究。选择退出研究的患者被请求完成 退出访问程序，但没有这样做的义务。

本研究计划多达20位患者。预期患者登记能在一年内完成。每位 登记患者接受一次初次注射，如果患者没有改善或回到基线允许在第6 个月随访时再次接受注射。从最后注射算起随访患者一年。患者组织 样品由发起人在注射MDC后保留18个月，随后被破坏。

实施例5

本实施例描述膀胱周围神经病大鼠模型中的MDC诱导的神经恢复。 盆神经创伤在根治性盆腔手术如前列腺切除术期间常见并能导致严重 的排尿功能障碍。这些功能障碍对大多数当前治疗方法都是难以治疗 的。向盆神经损伤位点或其周围给予MDC，代表治疗神经性排尿紊乱的 新方法。

方法：从正常成年大鼠的腓肠肌分离MDC并如前所述经铺板和培 养技术纯化。单侧盆神经横断用于研究成年雌性大鼠的周围神经再生。 三个试验组包括：（C）对照组（n=5）；（S）单侧盆神经横断并给予伪 注射组（n=5）；（M）单侧盆神经横断并给予MDC注射（3×10⁵细胞/位 点）组（n=5）。注射后两周，在电刺激神经节前盆神经横断位置近端 时测量膀胱内压。刺激前即刻，切除对侧（未损伤）的主盆神经节（MPG） 以确保任何观察到的膀胱活动一定是由于单侧（损伤侧）输入。试验 后，处死大鼠，取出单侧MPG并测试脑啡肽免疫反应性（ENK-IR）以 评价膀胱发射神经元的存活。

结果：手术后两周，C、S和M组的最大膀胱内压分别是31.7±10.3 cmH₂O、9.6±4.5cmH₂O、15.2±7.7cmH₂O。与正常对照动物（C）比较， 伪注射大鼠（S）的压力反应显著降低（p<0.01）。与S组比较，M组的 压力反应显著更高（p<0.01）但未达到正常水平。横断神经节前盆神 经后，与M组相比，S组中细胞周围脑啡肽－免疫反应性（ENK-IR）静 脉曲张的强度显著降低。与C组相比，在S组中MPG中脑啡肽染色阳 性的面积显著降低（p<0.001）（47.6±2.3比87.0±3.5％的总MPG面 积）。然而，C组和M组之间MPG中脑啡肽染色阳性的面积没有显著差 异（92.1±3.3％比88.7±2.0％）。这些结果证明在周围神经损伤模型 中MDC可以促进神经元存活和再生。

本说明书引用的所有专利申请、公开申请、专利、文本和参考文 献的全部内容引入此处作为参考，以更完整的描述本发明涉及领域的 技术状态。

因为可以对以上方法和组合物作多种改变而不偏离如所述的本发 明范围和精神，以上描述中含有的、附图中表示的、或附属权利要求 书中定义的所有主题都应认为是例证性的，而非限制性意义。