一种融合型原核表达载体及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种融合型原核表达载体及其构建方法和应用，包括：启动子、纯化标签基因、蛋白酶切割位点、多克隆位点和终止子；其中，在纯化标签基因和蛋白酶切割位点之间连接有β2微球蛋白基因。本发明融合型原核表达载体中带有β2微球蛋白（β2M）基因，将不易表达的外源蛋白连接在β2M基因的下游，使表达载体在表达不易表达的外源蛋白时能充分利用β2M基因的优良特性，使外源蛋白在宿主细胞中高效表达，且利于后期目标蛋白的复性及分离纯化。此外，本发明融合型原核表达载体中带有纯化标签和酶切位点，也有利于蛋白表达完成之后的分离纯化，也有利于纯化标签以及β2M蛋白的去除，获得更加接近天然序列的目的蛋白。

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达载体，尤其涉及一种融合型原核表达载体及其构 建方法，本发明进一步涉及该融合型原核表达载体在表达外源蛋白中的应 用，属于融合型原核表达载体领域。

背景技术

自1983年人免疫缺陷病毒（HIV-1）首次从一个全身淋巴结肿大的 病人体内分离出来以来，在对病毒生活周期以及HIV-1编码的九个基因的 功能意义的理解上已经取得了巨大的进步。大量的注意力被放在了HIV-1 的四个开放读码框Vif，Vpr，Vpu和Nef上。这些基因最初被称为附属基 因，这些基因产物共同调节宿主细胞生理来利于病毒复制，它们在HIV-1 的致病机制中起很大的作用，特别是Vpr蛋白的表达，它导致细胞周期 G2期阻滞和细胞凋亡。

人免疫缺陷病毒（HIV-1）的病毒蛋白R（Vpr）含有96个氨基酸残 基，分子量大约为14KD，在HIV-1，HIV-2，SIV中高度保守。Vpr对 AIDS的致病机理极其重要，研究表明Vpr在病毒复制过程中具有多种功 能：1.影响反转录过程的准确性；2.作为前整合体复合物的一个组成部分 参与病毒DNA转运至细胞核；3.使被感染细胞的繁殖周期发生G2期阻滞； 4.诱导病毒被感染细胞的凋亡；5.与宿主基因共同反式激活HIV-1长末端 重复序列（Long terminal reprat,LRT）。因此，研究HIV病毒的Vpr蛋白 对于艾滋病的致病以及发病和后期的治疗具有一定的意义。

β2微球蛋白（β₂M）基因编码的是一个只有99个氨基酸组成的小分 子蛋白质，现有大量的文献资料显示，该基因可以在大肠杆菌中高效表达， 可达到总蛋白30%。迄今为止，没有文献报道将难以表达的目的蛋白基因 融合在β2微球蛋白基因的下游后进行表达能够提高目的蛋白在原核系统 中的表达效率。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种融合型原核表达载体，该表达载体能 够将不易表达的蛋白在原核系统中进行高效表达；

本发明的目的之一是提供一种构建所述融合型原核表达载体的方 法；

本发明的目的之三是将所述融合型原核表达载体应用于在原核系统 中表达外源蛋白。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种融合型原核表达载体，包括：启动子、纯化标签基因、蛋白酶 切割位点、多克隆位点和终止子；其中，在纯化标签基因和蛋白酶切割位 点之间连接有β2微球蛋白基因；纯化标签基因位于启动子的下游，多克 隆位点位于蛋白酶切割位点和终止子之间。

所述β2微球蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

所述的启动子可以大肠杆菌表达体系中常用的启动子，例如可以是 lac启动子、trp启动子、P₁启动子、由lac启动子-10区和trp启动子 -35区融合形成的tac启动子或Tn5启动子等。

所述的纯化标签可以为his标签、avidin标签、t7标签或myc标签 等，优选为his标签。

所述的蛋白酶切割位点的蛋白酶可以为PSP酶、肠激酶或凝血酶等， 优选为PSP酶。

本发明的另一目的是提供一种构建所述融合型原核表达载体的方 法，包括：（1）将纯化标签基因、β2微球蛋白基因、蛋白酶切割位点和 多克隆位点依次连接在一起，得到融合基因：（2）将融合基因可操作的 与原核表达载体的启动子和终止子连接在一起，即得；其中，融合基因序 列位于原核表达载体的启动子下游。

其中，所述的原核表达载体可以是pET28a、pET28b、pET28c、pET32、 pMAL、pKK、pBAD或pBV220等原核表达载体；优选为pET28a。

所述的融合基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了利用所述融合型原核表达载体生产外源蛋白的方法， 该方法包括：将外源蛋白基因可操作的插入到上述融合型原核表达载体中 得到含有外源蛋白基因的重组融合型原核表达载体，再将该重组融合型原 核表达载体表达载体导入宿主细胞，获得重组菌株；培养重组菌株，诱导 外源基因表达，收集表达产物，分离纯化，即得。

所述外源蛋白优选为不易表达的蛋白，尤其是多肽、小蛋白或毒性 蛋白等，优选为HIV的Vpr蛋白；所述HIV的Vpr蛋白基因的核苷酸序 列为SEQ ID No.3所示。

所述的宿主细胞可以是大肠杆菌、芽孢杆菌、蓝藻、或衣藻等，优 选为大肠杆菌BL21。

本发明融合型原核表达载体中带有β2M基因，将不易表达的外源蛋 白连接在β₂m基因的下游，使表达载体在表达蛋白时能充分利用β2M基 因的优良特性，使外源蛋白高效表达，并且利于后期目标蛋白的复性及分 离纯化。同时本发明表达载体中带有的纯化标签和酶切位点，这也有利于 蛋白表达完成之后的分离纯化，有利于纯化标签以及β2M蛋白的去除， 获得更加接近天然序列的目的蛋白。

附图说明

图1为重组质粒pET-β2M的物理图谱。

图2为各表达载体在大肠杆菌中表达Vpr蛋白结果；A为阴性对照； B为表达载体pET-β2M-Vpr在大肠杆菌中表达Vpr蛋白；C、D为表达 载体pET-Vpr在大肠杆菌中表达Vpr蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会 随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围 构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和 范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改 和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1含有β2M基因的表达载体pET-β2M的构建

1)合成以下带有His纯化标签、β2微球蛋白、肠激酶切位点、多克隆 酶切位点的核苷酸序列：

CATCATCATCATCATCATATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTA CTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCT ATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAG AATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCA GCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCC ACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTC ACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGGACGACGACGACAAGGGATCCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGC（SEQ ID No.2）

2)在引物1：5’GTACCCATGGGCCATCATCATCATCATCATAT3' （下划线部分为Nco I识别位点）

引物2：5’GTACGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCG3’（下 划线部分为Not I识别位点）的引导下，以步骤1）中的序列为模板进行 PCR，扩增得到带有NcoI和Not I的以下核苷酸序列：

GTACCCATGGGCCATCATCATCATCATCATATCCAGCGTACTCCAAA GATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAAT TTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGT TGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCA GACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACT GAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACC ATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACAT GGACGACGACGACAAGGGATCCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGC CGCGTAC

3)将pET-28a(+)空载质粒，以及步骤2）得到的带有NcoI和Not I 酶切位点的基因，分别用NcoI和Not I进行双酶切。回收大片段，用T4 DNA连接酶连接，CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α，用含100ug/ml卡那霉 素的LB固体培养基进行筛选，PCR法挑取阳性克隆，碱裂解法提取阳性 克隆质粒，经基因测序鉴定，获得正确的克隆命名为pET-β2M。

实施例2含有HIV的Vpr蛋白基因及β2M基因的表达载体pET-β2M-Vpr 的构建

1)合成以下Vpr基因序列

ATGGAACAAGCCCCAGAAGACCAAGGGCCACAGAGGGAGCCACAC AATGAATGGACACTAGAGCTTTTAGAGGAGCTTAAGAATGAAGCTG TTAGACATTTTCCTAGGATTTGGCTCCATGGCTTAGGGCAACATATC TATGAAACTTATGGGGATACTTGGGCAGGAGTGGAAGCCATAATAA GAATTCTGCAACAACTGCTGTTTATCCATTTCAGAATTGGGTGTCGA CATAGCAGAATAGGCGTTACTCAACAGAGGAGAGCAAGAAATGGA GCCAGTAGATCC（SEQ ID No.3）

2)以引物1:5’GTACGGATCCATGGAACAAGCCCCAGAAGA3’(下 划线部分为BamH I识别位点)

引物2：5’GTACGCGGCCGCTTAGGATCTACTGGCTCCATTTC(下 划线部分为Not I识别位点1)为引导，以步骤1）中的基因为模板，进行 PCR，获得以下带有Bam H I和Not I识别位点的Vpr基因:

GTACGGATCCATGGAACAAGCCCCAGAAGACCAAGGGCCACAGAG GGAGCCACACAATGAATGGACACTAGAGCTTTTAGAGGAGCTTAAG AATGAAGCTGTTAGACATTTTCCTAGGATTTGGCTCCATGGCTTAGG GCAACATATCTATGAAACTTATGGGGATACTTGGGCAGGAGTGGAA GCCATAATAAGAATTCTGCAACAACTGCTGTTTATCCATTTCAGAAT TGGGTGTCGACATAGCAGAATAGGCGTTACTCAACAGAGGAGAGCA AGAAATGGAGCCAGTAGATCCTAAGCGGCCGCGTAC

3)将实施例1中获得的pET-β2M质粒以及步骤2）中获得带有Bam H I和Not I酶切位点的Vpr基因，分别用Bam H I和Not I进行双酶切。 回收大片段，用T₄DNA连接酶连接，CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α，用 含100ug/ml卡那霉素的LB固体培养基进行筛选，PCR法挑取阳性克隆， 碱裂解法提取质粒，经基因测序鉴定正确的表达质粒命名为 pET-β2M-Vpr。

实施例3HIV的Vpr蛋白的表达及分离纯化

1）将实施例2中获得的表达质粒pET-β2M-Vpr，采用CaCl₂法转化 大肠杆菌BL21，用含100ug/ml卡那霉素的LB固体培养基进行筛选。获 得Vpr表达菌株，命名为pET-β2M-Vpr/BL21。

2）挑取单菌落，用含100ug/ml卡那霉素的LB液体培养基37℃， 220rpm振荡培养16小时左右，1%的比例转接至新鲜的含100ug/ml卡那 霉素的LB液体培养基37℃，220rpm振荡培养3小时左右至OD600≈0.6， 加入IPTG至终浓度1mM，继续振荡培养3小时。

3）10000rpm4℃离心10分钟，收集菌体。PBS重悬菌体，离心10 分钟收集菌体，用20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA重悬菌体，4℃超 声破菌。4℃10000rpm离心，分别收集上清与沉淀，进行SDS-PAGE电 泳，结果表明，目的蛋白表达明显大菌体总蛋白10%以上，并且以包涵体 沉淀形式存在。

4）包涵体沉淀用20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿素充 分溶解，16000rpm离心30分钟收集上清。镍离子亲和层析，咪唑梯度洗 脱纯化包涵体。平衡缓冲为20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿 素。梯度洗脱缓冲分别为：A.20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿 素，20mM咪唑；B.20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿素，60mM 咪唑；C.20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿素，100mM咪唑； D.20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿素，200mM咪唑；E.200mM  pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿素，500mM咪唑。结果表明目的蛋 白β2M-Vpr主要集中于200mM咪唑洗脱峰，纯度大于90%。

5）按照文献（张劲郭霭光丰美福人β2微球蛋白在大肠杆菌中 的表达与纯化的方法《西北农林科技大学学报：自然科学版》2006年第 7期87-90页）进行复性。获得β2M-Vpr融合蛋白。用肠激酶酶对复性后 的β2M-Vpr融合蛋白进行酶切，融合蛋白被充分切开。

6）酶切后的蛋白产物，进行镍离子螯合层析。平衡缓冲为20mM  pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA。梯度洗脱缓冲分别为：A.20mM pH8.0 Tris-HCl，5mM EDTA，20mM咪唑；B.20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA， 60mM咪唑；C.20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，100mM咪唑；D.20mM  pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，200mM咪唑；E.200mM pH8.0Tris-HCl， 5mM EDTA，500mM咪唑。结果表明目的蛋白his-β2M标签主要集中于 200mM咪唑洗脱峰，Vpr蛋白主要位于流穿液中，流穿液中Vpr蛋白纯 度大于90%。

7）SDS-PAGE胶验证流穿液中的Vpr蛋白，结果见附图2，从图2 的结果可见，pET-β2M-Vpr表达载体在大肠杆菌中可高效表达Vpr蛋白。 实施例4pET-β2M-Vpr表达载体与pET-Vpr表达载体在大肠杆菌中表达 Vpr蛋白的差异

1）构建含有HIV的Vpr蛋白基因的表达载体pET-Vpr

pET-Vpr表达载体除了不含有β2M基因以外，其余与pET-β2M-Vpr 完全相同，pET-Vpr表达载体构建方法参照实施例1和实施例2。

2）HIV的Vpr蛋白的表达及分离纯化

用构建好的pET-Vpr表达载体和pET-β2M-Vpr表达载体在大肠杆菌 BL21中表达HIV的Vpr蛋白，实验方法同实施例3，实验结果见图2， 从实验结果可见，采用带有β2M基因的表达载体pET-β2M-Vpr，其在大 肠杆菌BL21中HIV的Vpr蛋白的表达产量要显著高于不含β2M基因的 表达载体pET-Vpr的表达量。

<110>  武汉华美生物工程有限公司

 

<120>  一种融合型原核表达载体及其构建方法和应用

 

<130>  XLB-0026

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  363

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  1

catcatcatc atcatcatat ccagcgtact ccaaagattc aggtttactc acgtcatcca       60

 

gcagagaatg gaaagtcaaa tttcctgaat tgctatgtgt ctgggtttca tccatccgac      120

 

attgaagttg acttactgaa gaatggagag agaattgaaa aagtggagca ttcagacttg      180

 

tctttcagca aggactggtc tttctatctc ttgtactaca ctgaattcac ccccactgaa      240

 

aaagatgagt atgcctgccg tgtgaaccat gtgactttgt cacagcccaa gatagttaag      300

 

tgggatcgag acatggacga cgacgacaag ggatccgagc tccgtcgaca agcttgcggc      360

 

cgc                                                                    363

 

 

<210>  2

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<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

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cgc                                                                    363

 

 

<210>  3

<211>  288

<212>  DNA

<213>  Human Immunodeficiency Virus

 

<400>  3

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