叶酸修饰的多功能靶向造影剂磁性氧化铁/金纳米颗粒的制备方法

摘要

本发明涉及一种叶酸修饰的多功能靶向造影剂磁性氧化铁/金复合纳米颗粒的制备方法，包括：合成Fe

说明书

技术领域

本发明属于造影剂材料的制备领域，特别涉及一种叶酸修饰的多功能靶向造影剂磁性氧 化铁/金纳米颗粒的制备方法。

背景技术

近年来，随着纳米技术的发展，纳米医学（Nanomedicine）这一新兴领域得到了人们广 泛的重视和极大的研究兴趣，例如细胞分离、药物传递、肿瘤的靶向诊断和治疗、分子手术、 医学成像和纳米机器人等。而肿瘤的早期诊断和治疗是当前世界各国着重研究的一个重要课 题。应用纳米科学与技术发展高准确率的肿瘤早期诊断分子影像活体成像技术显得越来越重 要。常见的分子影像学手段包括X/射线断层摄影术（X-ray computed tomography imaging,CT） 和磁共振成像术(Magnetic Resonance Imaging,MRI)。这些医学成像技术通常需要适当的纳米 颗粒作为造影剂辅助肿瘤的早期诊断。为达到和体内组织反衬的效果，纳米颗粒造影剂通常 由无机化合物、金属或氧化物组成。由于纳米金和纳米氧化铁颗粒具有非常好的生物相容性， 已有较多的文献报道了它们成功地应用于肿瘤早期CT和MRI诊断。研究证实，基于纳米金 颗粒的CT造影剂能够有效地延长成像时间，减弱对肾脏的毒副作用，并具备较好的造影效 果，其尺寸和形貌容易控制，且其表面化学修饰已得到了较多的研究。所以，纳米金颗粒用 于CT造影剂的研究引起了很大的兴趣。MRI是上世纪七十年代发展起来的一项先进医学成 像诊断技术，已广泛应用于人体多种疾病的检测与诊断。超顺磁性氧化铁（Fe₃O₄）纳米颗粒 可提高成像对比度和清晰度，是一种很好的T₂MRI造影剂。

在肿瘤早期临床诊断研究中，人们希望通过多模态成像对病灶组织进行确认，提高肿瘤 诊断准确度。因此，发展新型的的多模态造影剂成为当前纳米医学和影像诊断学的发展趋势。 目前，双功能纳米Au和Fe₃O₄复合材料得到了广泛的研究，其纳米结构主要有：1）金包覆 Fe₃O₄的核/壳纳米颗粒（Au作为保护层并与巯基化的有机分子反应可进一步多功能化）；2） 三组分磁纳米复合材料Fe₃O₄/3rd component/Au；3）哑铃状的Fe₃O₄/Au纳米颗粒；4）Fe₃O₄Au 纳米杂化材料。这些双功能或后续的多功能化结构的纳米颗粒综合具有磁和光性能，广泛应 用于生物医学，如分子影像和药物输送等。然而，还没有通过调节多功能化的纳米Au和Fe₃O₄复合材料的Au/Fe₃O₄的摩尔比例，优化其MRI/CT双模态成像效果，使其能更好地对肿瘤进 行靶向诊断的相关文献报道。

树状大分子是一种高度支化的、合成性的、高度单分散的大分子。它具有非常精确的核、 内部空间和表面功能基团。树状大分子经表面修饰后具有较好的生物相容性，没有免疫原性， 因而可以应用于生物医学领域。树状大分子特定的结构和性质使其已被用作模板或稳定化试 剂合成各种不同的金属纳米粒子。之前用树状大分子包裹合成纳米金颗粒，以超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒为核，通过静电自组装在Fe₃O₄纳米颗粒表面形成生物相容性好的高分子多层膜， 并在最外层组装修饰树状大分子包裹的纳米金颗粒（Dendrimer-entrapped gold nanoparticles, Au DENPs），最后进行壳层交联，并将Au DENPs表面氨基通过乙酰化，得到胶体稳定性良 好的、具备生物相容性的纳米颗粒材料Fe₃O₄Au。但此法合成的Fe₃O₄Au中Au/Fe₃O₄的 摩尔比（0.152）较小，且不可控，不利于同时进行高灵敏MRI/CT双模态成像（Cai,H.;Li,K.; Shen,M.;Wen,S.;Luo,Y.;Peng,C.;Zhang,G.;Shi,X.Facile assembly of Fe₃O₄Au  nanocomposite particles for dual mode magnetic resonance and computed tomography imaging  applications.Journal of Materials Chemistry,2012,22,15110）。因此我们在此基础上，先合成 Fe₃O₄Au-FA靶向纳米杂化材料，然后通过控制逐层金种还原反应的次数来调节 Fe₃O₄Au-FA纳米材料的Au/Fe₃O₄摩尔比，优化双模态成像效果，最后将表面氨基进行乙酰 化反应，得到具有最好MRI/CT双模态成像效果的Fe₃O₄/Au-FA纳米材料。

检索国内外有关MRI/CT靶向双模态造影剂Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒的文献和专利结果表 明，通过调节多功能靶向Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒的Au/Fe₃O₄的摩尔比例，优化其MRI/CT双 模态成像效果的研究还未见相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种叶酸修饰的多功能靶向造影剂磁性氧化铁/金复 合纳米颗粒的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作分离；制备的Fe₃O₄/Au-FA 纳米颗粒不仅可以调节Au/Fe₃O₄摩尔比，优化双模态成像效果，而且能够长时间地分散在水 基溶液中，具有良好的生物相容性，可应用于MRI/CT双模态靶向成像诊断。

本发明的一种叶酸修饰的多功能靶向造影剂磁性氧化铁/金纳米颗粒的制备方法，包括：

（1）配制NaOH溶液，氮气保护下，提前预热到80°C，然后将Fe源溶解于盐酸中，排除 空气，再加入到提前预热好的NaOH溶液中，并于氮气保护下搅拌反应2小时；反应 结束后，自然冷却至室温，将黑色沉淀洗涤分离后，得到Fe₃O₄纳米颗粒；

（2）将叶酸和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐EDC分别溶于溶剂中，混合， 搅拌活化2-3h，然后滴加到末端为氨基的第5代聚酰胺/胺树状大分子G5.NH₂溶液中， 搅拌反应2-3d，透析除掉过量的反应物，冷冻干燥，得到G5.NH₂-FA；其中G5.NH₂的表面氨基、叶酸、EDC的摩尔比为22:1:10；

（3）将HAuCl₄·4H₂O水溶液加入G5.NH₂-FA溶液中，搅拌10-30min，然后加入硼氢化钠 NaBH₄溶液，搅拌反应1-2h，透析，冷冻干燥，得到{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-FA}DENPs纳米 颗粒；其中G5.NH₂-FA和HAuCl₄·4H₂O摩尔比为1:50；

（4）通过静电层层自组装的方法，在Fe₃O₄纳米颗粒表面一次组装聚谷氨酸PGA、聚赖氨 酸PLL和聚谷氨酸PGA三层膜，然后进一步组装末端为氨基的{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-FA} DENPs，组装结束后，进行EDC交联反应，反应时间为15-20h，离心，洗涤，得到 Fe₃O₄/PGA/PLL/PGA/{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-FA}DENPs；其中每次组装吸附时间为 15-20min，Fe₃O₄纳米颗粒溶液、PGA溶液、PLL溶液、PGA溶液的体积比为0.5:1:1： 1；

（5）可以通过控制逐层金种还原反应的次数来调节Fe₃O₄Au-FA纳米材料的Au/Fe₃O₄摩 尔比，将HAuCl₄·4H₂O溶液加入上述合成的Fe₃O₄/PGA/PLL/PGA/{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-FA} DENPs溶液中，超声反应5-8min，再加入水合肼N₂H₄·H₂O超声反应5-8min，重复还 原反应6-7次，离心，洗涤，得到Fe₃O₄/Au-FA纳米材料，将Fe₃O₄/Au-FA纳米材料 分散在水中，然后加入三乙胺，振荡混合，再滴加入乙酸酐，振荡反应18-20h，离心， 洗涤，再分散在水中，即得表面乙酰化的Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒，其中HAuCl₄·4H₂O 溶液、Fe₃O₄/PGA/PLL/PGA/{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-FA}DENPs溶液、水合肼N₂H₄·H₂O溶液 的体积比为40μL：2mL：40μL；三乙胺、乙酸酐与树状大分子中的表面NH₂摩尔比 为11:5:1。

所述步骤（1）中NaOH溶液的浓度1M，体积为250mL；盐酸的浓度为0.4M，体积为25mL。

所述步骤（1）中Fe源为摩尔比为2:1的FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O。

所述步骤（2）中溶剂为二甲基亚砜DMSO。

所述步骤（3）中HAuCl₄·4H₂O水溶液的浓度为6.00mg/mL，G5.NH₂-FA溶液的浓度为2mg/ml， 硼氢化钠溶液浓度为6.91mg/ml。

所述步骤（3）中NaBH₄溶液的溶剂为体积比为1:2的甲醇和超纯水混合液，NaBH₄溶液为冰 浴处理。

所述步骤（2）（3）中透析为对水透析3天。

所述步骤（4）中Fe₃O₄纳米颗粒溶液浓度为10mg/mL，聚谷氨酸溶液的浓度为1mg/mL， 聚赖氨酸溶液浓度为1mg/mL，{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-FA}DENPs溶液的浓度为1mg/mL。

所述步骤（4）中PGA、PLL、和{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-FA}DENPs溶液的溶剂都是pH为7.4的 PBS。

所述步骤（4）中EDC交联反应条件为在pH5.5的2-（N-吗啉）乙磺酸MES缓冲液条件下 进行的，MES缓冲液的浓度为50mM。

所述步骤（4）中离心转速为8000rpm，离心时间为8-10min纯化，离心水洗3-5次。

所述步骤（5）中HAuCl₄·4H₂O溶液浓度为31.74mg/mL； Fe₃O₄/PGA/PLL/PGA/{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-FA}DENPs溶液中[Fe]=0.97mg/mL，[Au]=0.32 mg/mL；

所述步骤（5）中三乙胺的密度为0.726～0.729g/mL，体积百分浓度为99.0%；乙酸酐的密度 为1.08g/mL，体积百分浓度为98.5%。

所述步骤（5）中为在TS-2型摇床上，振荡反应；离心转速为10000rpm，离心时间为5-10min。

本发明通过修饰靶向分子FA的G5PAMAM树状大分子包裹合成纳米金颗粒，以超顺磁 性Fe₃O₄纳米颗粒为核，通过静电自组装在Fe₃O₄纳米颗粒表面形成生物相容性好的高分子 多层膜，并在最外层组装修饰{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-FA}DENPs纳米材料，然后进行壳层交联，得 到具有良好胶体稳定性和生物相容性的纳米颗粒Fe₃O₄/PGA/PLL/PGA/{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-FA} DENPs(Fe₃O₄Au-FA)。并进一步通过控制逐层金种还原反应的次数来调节Fe₃O₄Au-FA纳 米材料的Au/Fe₃O₄摩尔比，优化双模态成像效果，最后将表面氨基进行乙酰化反应，得到具 有最好双模态成像效果的Fe₃O₄/Au-FA纳米材料。该方法制备的多功能靶向Fe₃O₄/Au-FA纳 米材料具有良好的生物相容性，可成功用于MRI/CT双模态靶向成像诊断。

本发明使用透射电子显微镜（TEM）、能量分散谱（EDS）、紫外-可见光分光光度计 （UV-Vis）、电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）以及水动力学粒径（DLS）等方法 表征本发明制备的多功能靶向造影剂Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒和对比例中的对照材料Fe₃O₄/Au 纳米颗粒，同时利用MTT法和溶血试验来分别检验纳米颗粒的细胞相容性和血液相容性，最 后通过CT和磁共振成像仪检测纳米颗粒体外X-射线衰减特性和T₂弛豫性能，以及对体外癌 细胞和体内肿瘤模型的双模态造影性能。具体测试结果如下：

（1）紫外-可见光分光光度计（UV-Vis）和电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）的测 试结果

通过静电层层自组装的方法，在Fe₃O₄纳米颗粒表面组装PGA/PLL/PGA多层膜，在形成 的PGA/PLL/PGA多层膜修饰的Fe₃O₄纳米颗粒表面进一步组装端基为氨基的 {(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-FA}纳米颗粒，然后通过EDC化学键合法将Fe₃O₄纳米颗粒表面的羟基、PGA 的羧基、PLL的氨基和{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-FA}的氨基进行交联，接着通过控制逐层金种还原反 应的次数来调节Fe₃O₄/Au-FA纳米材料的Au/Fe₃O₄摩尔比；纳米颗粒外围的氨基则通过进一 步完全乙酰化，使整体纳米颗粒电荷接近中性（见反应示意图，图14）。通过UV-Vis和ICP-AES 测试来鉴定对比例中的对照材料Fe₃O₄/Au和本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒的Au/Fe₃O₄摩尔比（图1和图2）。其中图1代表乙酰化前不同Au/Fe₃O₄摩尔比的Fe₃O₄/Au的UV-Vis图 谱，图2代表乙酰化后的Fe₃O₄/Au和Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒的UV-Vis图谱，从图1和图2 中可以看出，与没有吸收峰的Fe₃O₄纳米颗粒相比，Fe₃O₄/Au和Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒在520 nm处显示出一个吸收峰，证实了Au元素的存在；随着金种还原反应的次数的增加，在520nm 处的吸收峰越来越明显，且ICP结果也证实了Fe₃O₄/Au纳米颗粒的Au/Fe₃O₄摩尔比从0.20:1 增加到1.59:1，参考附图1和2；

（2）透射电子显微镜（TEM）和能量分散谱（EDS）的测试结果

TEM测试结果（图3a）显示Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒的形貌，黑色的小圆点代表Au颗粒， 浅色颗粒为Fe₃O₄颗粒，其中Au颗粒围绕在Fe₃O₄核心颗粒表面，但总体结构则显示合成 的Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒为杂化结构。能量分散谱（EDS）也更进一步地证实了Fe₃O₄/Au-FA 杂化颗粒中元素Au和Fe的共同存在，参考附图3b。

（3）T₂弛豫率测试结果

为了研究Fe₃O₄/Au纳米颗粒中Au摩尔量的增加对杂化纳米颗粒的弛豫率的影响，我们测 定了对比例中不同Au/Fe₃O₄摩尔比的Fe₃O₄/Au纳米颗粒的弛豫率（图4）。从图4中可以看 出，Fe₃O₄/Au材料的弛豫率随着铁浓度的增加（在0-0.2mM浓度范围内）具有很好的线性关 系。从线性关系图可知，Au/Fe₃O₄摩尔比为0.2的Fe₃O₄/Au的纳米颗粒R₂弛豫率为127.86 mM^-1s^-1，而Au/Fe₃O₄摩尔比为0.66、1.06及1.59的Fe₃O₄/Au的纳米颗粒R₂弛豫率分别降为 99.52、97.59和112.25mM^-1s^-1，这些结果表明Au摩尔量的增加没有阻挡其与质子的接触率， 对杂化纳米颗粒的弛豫率影响不大，这些杂化纳米颗粒都具有良好的弛豫率。我们也测量了 本发明制备的Au/Fe₃O₄摩尔比为2.02的靶向材料Fe₃O₄/Au-FA的弛豫率为92.66mM^-1s^-1（图 5）。

（4）X-射线衰减测试结果

金纳米颗粒由于有很高的原子序数和电子密度，因而具有很好的X-射线衰减性质，可用 作CT造影剂。图6显示了对比例中不同Au/Fe₃O₄摩尔比的Fe₃O₄/Au和本发明制备的Au/Fe₃O₄摩尔比为2.02的靶向材料Fe₃O₄/Au-FA随金浓度（图6a）或铁浓度（图6b）变化的X-射线 衰减效应关系。在图6b中，在同样的铁浓度下，跟对比例中具有不同Au/Fe₃O₄摩尔比的 Fe₃O₄/Au（摩尔比为0.2至1.59）相比较，Au/Fe₃O₄摩尔比为2.02的靶向材料Fe₃O₄/Au-FA 具有最高的金浓度，从而显示了最好的X-射线衰减特性。因此，当用于材料双模态成像时， 在同样的铁浓度下，Au/Fe₃O₄摩尔比为2.02的靶向材料Fe₃O₄/Au-FA材料既可达到良好的 MRI成像效果，又由于具有最高的金浓度，因而具备最好的CT成像效果。而在图6a中，在 同样的金浓度下，由于Au/Fe₃O₄摩尔比最低0.2的Fe₃O₄/Au材料具有最高的铁浓度，因而其 具有最好的X-射线衰减效应，这表明Fe₃O₄纳米颗粒也能增强金纳米颗粒的X-射线衰减效应。 因此，本发明所合成的靶向材料Fe₃O₄/Au-FA以及对比例中的对照材料不仅具有可调控的 Au/Fe₃O₄摩尔比和良好的弛豫率，而且Au摩尔量的增加并没有阻挡其质子与Fe₃O₄内核的接 触效率，对其T2弛豫率没有太大影响。Au摩尔量越高其X-射线衰减效应越强。这些结果表 明靶向材料Fe₃O₄/Au-FA可作为一种很有潜力的多功能造影剂，有望应用于MRI/CT双模态 医学成像诊断。

（5）水动力学粒径分布

为了分析对比例中Fe₃O₄/Au和本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA纳米材料在水相中的稳定性， 我们测定了其水动力学粒径（如图7所示）。对比例中的Fe₃O₄/Au和本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA 纳米材料在水相中分散稳定，其水动力学粒径大小分别是418.3nm和532.5nm，跟以前合成 的Fe₃O₄Au（200nm，Cai,H.;Li,K.;Shen,M.;Wen,S.;Luo,Y.;Peng,C.;Zhang,G.;Shi,X. Facile assembly of Fe₃O₄Au nanocomposite particles for dual mode magnetic resonance and  computed tomography imaging applications.Journal of Materials Chemistry,2012,22,15110）的水 动力学粒径相比较，明显大些，可能是由于金壳厚度的增加，导致其水动力学粒径增加，但 其在水相中还是具有很好的稳定性。

（6）MTT细胞活力测试和血液相容性

通过MTT比色法测定KB细胞（一种人类上皮癌的细胞株）的活力检测所合成材料的细 胞毒性。KB细胞分别与对比例中Fe₃O₄/Au和本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA（质量浓度为10、 25、50和100μg/mL）在37℃下共培养24小时。然后，经MTT处理后在570nm处测量吸 光值，并根据此值计算细胞的增殖及活力。不同浓度下材料对细胞增殖的影响与对照组（缓 冲液PBS，pH7.4）的统计比较，通过单因素方差分析方法实施。与对照组相比，Fe₃O₄/Au 和Fe₃O₄/Au-FA在从0到100μg/ml实验浓度范围内对KB细胞的存活率没有显著性差异，没 显示细胞毒性，这表明它们在此浓度范围内具有良好的生物相容性，参考附图8。

为了便于材料能更好地用于体内生物成像，本试验又测定了对比例中的Fe₃O₄/Au和本发 明制备的Fe₃O₄/Au-FA纳米材料的血液相容性。图9中显示了Fe₃O₄/Au（a）和Fe₃O₄/Au-FA 纳米颗粒（b）在不同浓度（50、100、200、400μg/mL）下的溶血性测试结果。通过对上层 清液的吸光度进行测量来定量评价样品的溶血性。如图9右上角紫外图谱显示，在浓度达到 400μg/mL条件下，Fe₃O₄/Au和Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒的溶血率分别为5.05%和3.14%，低 的溶血率表明材料具有良好的血液相容性。

这些结果表明Fe₃O₄/Au-FA纳米材料具有良好的生物相容性和血液相容性，可用于体内 各种生物医学应用。

（7）KB细胞内吞结果

为了测定靶向材料的靶向性，我们选用表达叶酸受体的KB细胞作为模型，把KB细胞 分别与对比例中Fe₃O₄/Au和本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA（Au浓度为4和20μM）在37℃下 共培养4小时。用ICP-AES测定相同数量细胞的Au内吞量。如图10结果表明，Fe₃O₄/Au 和Fe₃O₄/Au-FA两种材料内吞量都为浓度依赖型，随着Au浓度增加，内吞量也越高，表明对 比例中非靶向材料能通过内吞作用或自由扩散而进入细胞。但在同样的Au浓度下，与对比 例Fe₃O₄/Au相比较，本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA靶向材料共培养的KB细胞的内吞量更高， 表明材料除通过内吞作用或自由扩散而进入细胞外，具有靶向分子的Fe₃O₄/Au-FA能通过叶 酸受体介导而进入KB细胞。

（8）体内CT成像结果

为了研究材料的体内靶向CT成像，我们选用4到6周的BALB/c裸鼠（上海动物实验 中心）作为动物模型。腋下注射1×10⁶表达叶酸受体的KB细胞于裸鼠体内，注射约3周后， 肿瘤体积即可达到0.1-1cm³。将肿瘤裸鼠麻醉后，随机抽取作为对照组和实验组，实验组老 鼠通过尾静脉注射189μL对比例材料Fe₃O₄/Au(Au/Fe₃O₄摩尔比为1.59)或本发明制备的 Fe₃O₄/Au-FA(Au/Fe₃O₄摩尔比为2.02)靶向纳米材料的PBS溶液(Au质量为0.2mg)，然后在 不同时间点（2h，6h，24h）进行Micro-CT扫描。图11a和b分别代表了靶向材料和非靶 向材料的Micro-CT图片，跟对照组比较，我们能够看出，注射2h后，两种材料的CT信号 强度都加强了，没有明显区别，但是从6h到24h靶向材料Fe₃O₄/Au-FA主要集中在肿瘤部 位，而非靶向材料则慢慢被代谢掉。CT信号强度变化图（图11c）进一步定量验证了Micro-CT 图片的结果，跟非靶向材料比较，在24h，注射靶向材料Fe₃O₄/Au-FA的肿瘤的CT信号强 度增加到200.16%，而非靶向材料Fe₃O₄/Au的肿瘤的CT信号强度只有109.31%，这些结果 表明本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA纳米材料能对肿瘤实施靶向CT成像。

（9）体内MRI结果

对于MRI，首先通过尾静脉注射189μL对比例材料Fe₃O₄/Au或本发明制备的 Fe₃O₄/Au-FA纳米材料的PBS溶液(Fe质量为0.9mg)，然后在不同时间点（2h，6h，24h） 进行MRI扫描。从图12a和b可以看出，注射靶向材料Fe₃O₄/Au-FA的裸鼠肝脏处的MRI 信号强度明显比注射非靶向材料Fe₃O₄/Au的裸鼠肝脏处的MRI信号强度低得多。跟对照组 相比，注射靶向材料Fe₃O₄/Au-FA的裸鼠肿瘤部位的信号逐渐从亮白色变到灰色，表明靶向 材料降低了肿瘤部位的MRI信号强度；而注射非靶向材料Fe₃O₄/Au的裸鼠肿瘤部位的信号 没发生太大变化，这些结果表明靶向材料Fe₃O₄/Au-FA能特异性靶向裸鼠肿瘤部位用于靶向 MRI成像。MRI信号强度变化图（图12c）进一步定量验证了MRI图片的结果，跟对照组比 较，注射靶向材料Fe₃O₄/Au-FA的裸鼠肿瘤部位的信号强度从2h（79.38%）到24h（56.24 %）逐次降低，而注射非靶向材料Fe₃O₄/Au的裸鼠肿瘤部位的信号强度从2h（82.71%）到 24h（93.43%）逐次升高，信号慢慢恢复到初始强度。

这些结果也表明靶向材料Fe₃O₄/Au-FA能特异性靶向表达叶酸受体的裸鼠肿瘤部位用于 MRI/CT双模态成像。

（10）体内组织分布结果

为了研究靶向材料Fe₃O₄/Au-FA在体内生物组织分布情况，首先通过尾静脉注射纳米材 料的PBS溶液（Au质量为0.2mg），然后用ICP-AES测量Au元素在注射后不同时间点（12 或36h）在各个重要器官中的含量（图13）。从图中可看出，跟对照组（注射前）相比，Au 元素主要分布在肝（在注射12和36h后，每克器官含Au量分别为19.5μg和56.1μg）和 脾脏（在注射12和36h后，每克器官含Au量分别为59.0μg和190.6μg）处，并且随着时 间的增长，聚集量越多；而对于这两个时间点，在其他的器官，比如：肺、肾和肿瘤，金的 聚集明显少得多。这些结果表明，靶向材料Fe₃O₄/Au-FA能被巨噬细胞吞噬掉，并在小鼠体 内正常的代谢清除。同时需要指出的是，跟对照组肿瘤部位（每克肿瘤含金量为0.1μg）比 较，靶向材料能特异性靶向肿瘤部位，在注射24h后，肿瘤部位含金量最多，达到1.0μg， 在注射36h后，肿瘤部位含金量降低到0.6。这些结果不仅表明靶向材料Fe₃O₄/Au-FA对肿 瘤部位具有很好的靶向性，可用于肿瘤靶向成像，而且表明材料能在小鼠体内能慢慢的正常 的代谢清除，且不显示毒性。

有益效果

（1）本发明利用静电层层自组装方法和树状大分子独特性质来合成水溶性良好的 Fe₃O₄Au-FA纳米颗粒，然后通过控制逐层金种还原反应的次数来调节Fe₃O₄Au-FA纳米 材料的Au/Fe₃O₄摩尔比，优化双模态成像效果，最后将表面氨基进行乙酰化反应，得到具有 最好成像效果的双模态的Fe₃O₄/Au-FA靶向纳米材料。本发明工艺简单，反应条件温和，易 于操作分离；

（2）本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒不仅可以调节Au/Fe₃O₄摩尔比，优化双模态成像 效果，而且能够长时间地分散在水基溶液中，具有良好的生物相容性和靶向成像效应，可应 用于MRI/CT双模态成像靶向诊断。

附图说明

图1为对比例中具有不同Au/Fe₃O₄摩尔比的Fe₃O₄/Au和Fe₃O₄纳米颗粒的紫外吸收光谱图；

图2为本发明制备的乙酰化的Fe₃O₄/Au-FA和对比例中Fe₃O₄/Au纳米颗粒的紫外吸收光谱 图；

图3为本发明制备Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒的透射电子显微镜图片(a)和能量分散图谱(b)；

图4为对比例中具有不同Au/Fe₃O₄摩尔比的Fe₃O₄/Au杂化纳米颗粒的T₂弛豫时间倒数随铁 浓度变化的线性关系图；

图5为本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒的的T₂弛豫时间倒数随铁浓度变化的线性关系图；

图6为本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA和对比例中具有不同Au/Fe₃O₄摩尔比的Fe₃O₄/Au纳米颗粒 的X-射线衰减随金浓度变化(a)或随铁浓度变化(b)的线性关系图；

图7为本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA和对比例中Fe₃O₄/Au纳米颗粒的水动力学粒径分布；

图8为MTT法测试的KB细胞经过PBS缓冲液（对照）、对比例中Fe₃O₄/Au和本发明制备 的Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒（浓度范围在0-100μg/ml）处理24小时后的细胞活力；

图9为对比例中Fe₃O₄/Au（a）和本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒（b）（浓度范围50-400 μg/mL）的溶血实验紫外图谱，右上角插图显示的是图中放大的紫外吸收图谱；

图10为经PBS缓冲液（对照）和对比例中Fe₃O₄/Au和本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA（在Au 浓度为4和20μM）纳米颗粒处理4小时后的KB细胞的内吞结果；

图11为尾静脉注射189μL本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA(a)和对比例中Fe₃O₄/Au(Au质量为 0.2mg)(b)入肿瘤裸鼠（4-6周大小）后,于不同时间拍的CT图片和CT值随时间的变化图(c)。 (c)。

图12为尾静脉注射189μL本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA(a)和对比例中Fe₃O₄/Au(Fe质量为0.9 mg)(b)进入肿瘤裸鼠（4-6周）后,于不同时间拍的MRI图片和MRI信噪比随时间的变化图 (c)；

图13为尾静脉注射本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒（Au质量为0.2mg）后，Au元素 在不同时间点（12或36h）在小鼠主要器官（肝、脾、肺、肾、和肿瘤）的组织分布；

图14为本发明的反应示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

（1）首先用共沉淀法合成Fe₃O₄纳米颗粒，配制1M氢氧化钠250mL，氮气保护下，提前 预热到80°，然后将FeCl₂·4H₂O和FeCl₃·6H₂O以摩尔比2:1溶解于0.4M稀盐酸（25mL）中， 排除空气，再加入提前预热好的NaOH溶液中，并于氮气保护下搅拌反应2小时；反应结束 后，自然冷却至室温，将黑色沉淀洗涤分离后，即得Fe₃O₄纳米颗粒；

（2）用末端为氨基的第5代聚酰胺/胺树状大分子（G5.NH₂）为初始材料，首先将1.87mg 叶酸和8.11mg1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐（EDC）分别溶于2mL二甲基 亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）中，混合搅拌活化3h后，再逐滴加入G5.NH₂溶液（22.00 mg溶于8mL DMSO）中，搅拌反应3天，产物对水透析三天除掉过量的反应物，冷冻干燥 得到产品G5.NH₂-FA。

（3）将2.0mL HAuCl₄水溶液（6.00mg/mL）加入上述合成的G5.NH₂-FA溶液（20mg溶 解于10mL超纯水中）中，搅拌半小时。然后向其中加入冰浴处理的硼氢化钠溶液（6.91mg 溶于1mL超纯水/甲醇（v/v=2:1）中）还原反应2小时，对水透析三天，冷冻干燥得到产品 {(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-FA}DENPs纳米颗粒。

（4）通过静电层层自组装的方法，在0.5mL Fe₃O₄（10mg/mL水溶液）纳米颗粒表面依 次组装聚谷氨酸（PGA,1mg/mL溶于pH7.4的PBS缓冲液，1mL）、聚赖氨酸（PLL,1mg/mL 溶于pH7.4的PBS缓冲液,1mL）和聚谷氨酸（PGA,1mg/mL溶于pH7.4的PBS缓冲液,1mL） 三层膜，在形成的PGA/PLL/PGA多层膜修饰的Fe₃O₄纳米颗粒表面进一步组装过量的端基 为氨基的{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-FA}DENPs溶液（1mg/mL溶于pH7.4的PBS缓冲液）。每次组 装吸附持续20min，8000rpm离心10min除掉过量的反应物，离心洗涤3次，再重新分散于 水中。组装结束后，在pH5.5的2-（N-吗啉）乙磺酸（MES，50mM）缓冲液条件下，进行 EDC交联反应20小时后，用水离心洗涤3次得到Fe₃O₄/PGA/PLL/PGA/{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-FA} DENPs（Fe₃O₄Au-FA）纳米材料。

（5）可以通过改变逐层金种还原反应的次数来调节Fe₃O₄Au-FA纳米材料的Au/Fe₃O₄摩 尔比。首先将40μL HAuCl₄·4H₂O溶液（31.74mg/mL）加入上述合成的Fe₃O₄Au-FA([Fe]= 0.97mg/mL，[Au]=0.32mg/mL，2mL)溶液中，超声反应8min，再加入40μL水合肼 （N₂H₄·H₂O）超声反应8min，重复还原反应6-7次。最后将上述制备的材料离心（10000rpm， 8min.）洗涤4次，再均匀分散在5mL超纯水中，加入50μL三乙胺。振荡30分钟充分混合 后，逐滴加入15μL乙酸酐（三乙胺、乙酸酐与树状大分子中的-NH₂摩尔比=5：5：1），将 玻璃瓶放置在摇床上，振荡反应20小时，离心（10000rpm，8min）洗涤4次，再均匀分散 在2mL超纯水中，制得表面乙酰化的Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒。

通过UV-Vis和ICP-AES测试来鉴定本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒的Au/Fe₃O₄摩 尔比（参考附图2）。图2代表乙酰化后的对比例中Fe₃O₄/Au和本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA纳 米颗粒的UV-Vis图谱，从图中可以看出，Fe₃O₄/Au和Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒在520nm处显 示出一个吸收峰，证实了Au元素的存在；且通过ICP测定了对比例中Fe₃O₄/Au和本发明制 备的Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒的Au/Fe₃O₄摩尔比分别为1.59:1和2.02:1。可通过TEM测试和 EDS能谱等测试方法表征Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒，结果显示了Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒的形貌 大部分为杂化颗粒，黑色的小圆点代表Au颗粒，少部分为核壳结构，其中Au颗粒围绕修饰 在Fe₃O₄核心颗粒表面；能量分布图谱（EDS）更进一步地证实了Fe₃O₄/Au-FA杂化颗粒中元 素Au和Fe的存在（参考附图3）。

实施例2

将对比例中Fe₃O₄/Au和本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA纳米材料分散在水溶液中，并通过 ICP-AES测试法测得溶液中Fe和Au元素的含量，再用EP管配制Fe浓度依次为0.002、0.005、 0.01、0.02、0.05、0.1以及0.2mM的水溶液2mL，通过T₂磁共振成像和CT成像研究不同 Au/Fe₃O₄摩尔比的Fe₃O₄/Au和Fe₃O₄/Au-FA的T₂弛豫和CT效应。结果表明Fe₃O₄/Au和 Fe₃O₄/Au-FA的弛豫率在铁浓度0-0.2mM浓度范围内随着铁浓度的增加具有很好的线性关 系。参考附图4和5，从线性关系图可知，Au/Fe₃O₄摩尔比为0.2的Fe₃O₄/Au的纳米颗粒R₂弛豫率为127.86mM^-1s^-1，而Au/Fe₃O₄摩尔比为0.66、1.06及1.59的Fe₃O₄/Au的纳米颗粒 R₂弛豫率分别降为99.52、97.59和112.25mM^-1s^-1，这些结果表明Au摩尔量的增加没有阻挡 Fe₃O₄内核与质子的接触率，对杂化纳米颗粒的弛豫率影响不大，都具有良好的弛豫率。我们 也测量了Au/Fe₃O₄摩尔比为2.02的靶向材料Fe₃O₄/Au-FA的弛豫率为92.66mM^-1s^-1。附图6 显示了不同Au/Fe₃O₄摩尔比的Fe₃O₄/Au和靶向材料Fe₃O₄/Au-FA随金浓度（图6a）或铁浓 度（图6b）变化的X-射线衰减效应。在图6b中，在同样的铁浓度下，跟对比例中具有不同 Au/Fe₃O₄摩尔比的Fe₃O₄/Au（摩尔比为0.2至1.59）相比较，Au/Fe₃O₄摩尔比为2.02的靶向 材料Fe₃O₄/Au-FA具有最高的金浓度，从而显示了最好的X-射线衰减特性。在同样的铁浓度 下，Au/Fe₃O₄摩尔比为2.02的靶向材料Fe₃O₄/Au-FA材料既可达到良好的MRI成像效果，又 由于具有最高的金浓度，因而具备最好的CT成像效果。而在图6a中，在同样的金浓度下， 由于Au/Fe₃O₄摩尔比最低0.2的Fe₃O₄/Au材料具有最高的铁浓度，因而其具有最好的X-射 线衰减效应，这表明Fe₃O₄纳米颗粒也能增强金纳米颗粒的X-射线衰减效应。因此，本发明 所合成的靶向材料Fe₃O₄/Au-FA以及对比例中的对照材料不仅具有可调控的Au/Fe₃O₄摩尔比 和良好的弛豫率，而且Au摩尔量的增加并没有阻挡Fe₃O₄与质子的接触效率，对其弛豫率没 有太大影响，Au摩尔量越高其X-射线衰减效应越强。这些结果表明靶向材料Fe₃O₄/Au-FA 可作为一种很有潜力的多功能造影剂，有望应用于MRI/CT双模态医学成像诊断。

因此，对比例中Fe₃O₄/Au和本发明所合成的靶向材料Fe₃O₄/Au-FA不仅具有可调制的 Au/Fe₃O₄摩尔比和良好的弛豫率，而且Au摩尔量的增加并没有阻挡Fe₃O₄与质子的接触效率， 对其弛豫率没有太大影响。Au摩尔量越高其X-射线衰减效应越强。靶向材料Fe₃O₄/Au-FA 可作为一种很有潜力的多功能造影剂，有望应用于MRI/CT双模态医学诊断，参考附图4-6。

实施例3

分别取0.1mL对比例Fe₃O₄/Au（[Fe]=0.054mol/L，[Au]=0.029mol/L）和0.08mL本 发明制备的Fe₃O₄/Au-FA（[Fe]=0.061mol/L，[Au]=0.041mol/L）纳米颗粒用超纯水配制成 1.5mL的水溶液，然后用于测水动力学粒径。如图7水动力学粒径分布表明，对比例中的 Fe₃O₄/Au和本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA纳米材料在水相中分散稳定，其水动力学粒径大小分 别是418.3nm和532.5nm，跟以前合成的Fe₃O₄Au纳米颗粒的水动力学粒径（200nm，Cai, H.;Li,K.;Shen,M.;Wen,S.;Luo,Y.;Peng,C.;Zhang,G.;Shi,X.Facile assembly of Fe₃O₄Au  nanocomposite particles for dual mode magnetic resonance and computed tomography imaging  applications.Journal of Materials Chemistry,2012,22,15110）相比较，明显大些，可能是由于 金壳厚度的增加，导致其水动力学粒径增加，但其在水相中还是具有很好的稳定性，参考附 图7。

实施例4

以KB细胞为模型细胞，通过MTT比色法测定KB细胞的活力检测所合成材料的细胞毒 性。KB细胞分别与不同质量浓度的对比例Fe₃O₄/Au和本发明制备的靶向材料Fe₃O₄/Au-FA （10、25、50和100μg/mL）纳米材料，在37℃下与KB细胞（96孔，10000万细胞/每孔） 共培养24小时，然后，经MTT处理后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的增殖 及活力检测所合成材料的细胞毒性。与对照组相比，Fe₃O₄/Au和Fe₃O₄/Au-FA在从0到100 μg/ml实验浓度范围内对KB细胞的存活率没有显著性差异，没显示细胞毒性，这表明它们在 此浓度时范围内具有良好的生物相容性，参考附图8。

实施例5

为了便于材料能更好地用于体内生物成像，本试验进一步测定了对比例中的Fe₃O₄/Au和 本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA材料的血液相容性。取人血，首先离心(2000rpm/min，10min)去 上清液，并用PBS洗涤5次，收集健康的红细胞，然后用PBS将红细胞稀释10倍备用。再 将Fe₃O₄/Au或Fe₃O₄/Au-FA材料（50-400μg/mL）与稀释后的红细胞混合静置2小时后，10000 rpm/min离心1min后，并测上清液的紫外吸光度。

图9中显示了Fe₃O₄/Au（a）和Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒（b）在不同浓度50、100、200和 400μg/mL下的溶血性测试结果。通过对上层清液的吸光度进行测量来定量评价样品的溶血 性。如图9右上角紫外图谱显示，在达到400μg/mL条件下，Fe₃O₄/Au和Fe₃O₄/Au-FA纳米 颗粒的溶血率分别为5.05%和3.14%，低的溶血率表明材料具有良好的血液相容性，参考附 图9。

这些结果表明Fe₃O₄/Au-FA纳米材料具有良好的生物相容性和血液相容性，可用于体内 各种生物医学应用。

实施例6

为了测定靶向材料Fe₃O₄/Au-FA的靶向性，我们选用表达叶酸受体的KB细胞作为模型， 首先5×10⁵KB被种在24孔培养板上，过夜培养后，换上含有Fe₃O₄/Au(Au/Fe₃O₄摩尔比1.59) 或Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒(Au/Fe₃O₄摩尔比2.02)的新鲜培养基（Au浓度为4和20μM），在 37℃以及5%CO₂下共培养4小时，之后细胞用PBS缓冲液洗涤三次，然后细胞用胰酶消化 下来，再悬浮在1mL包含10%FBS的RPMI-1640培养基中，计算细胞数目后，1000转离 心5分钟收集细胞，再用0.2mL王水消化1小时后，加入1.8mL PBS缓冲液至2mL，最后 用ICP-AES测定细胞的Au内吞量。

通过ICP-AES测试测定细胞的Au内吞量（参考附图10），结果表明，Fe₃O₄/Au和 Fe₃O₄/Au-FA两种材料内吞量都为浓度依赖型，随着Au浓度增加，内吞量也越高，表明对比 例中非靶向材料能通过内吞作用或自由扩散而进入细胞。但在同样的Au浓度下，与对比例 Fe₃O₄/Au相比较，本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA靶向材料共培养的KB细胞的内吞量更高，表 明材料除通过内吞作用或自由扩散而进入细胞外，具有靶向分子的Fe₃O₄/Au-FA能通过叶酸 受体介导而进入KB细胞。

实施例7

为了研究材料的体内靶向CT/MRI成像，我们购买4至6周的裸鼠作为动物模型（上海 动物实验中心）。腋下注射1×10⁶表达叶酸受体的KB细胞入裸鼠体内，注射约3周左右，肿 瘤长到0.1-1cm³。将肿瘤裸鼠麻醉后，随机抽取作为对照组和实验组，实验组老鼠通过尾静 脉注射189μL对比例材料Fe₃O₄/Au(Au/Fe₃O₄摩尔比为1.59)或本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA (Au/Fe₃O₄摩尔比为2.02)靶向纳米材料的PBS溶液(Au总质量为0.2mg)，然后在不同时间 点（2h，6h，24h）进行Micro-CT扫描。对于MRI靶向成像，首先通过尾静脉注射189μL 对比例材料Fe₃O₄/Au或本发明制备的Fe₃O₄/Au-FA纳米材料的PBS溶液(Fe总质量为0.9 mg)，然后在不同时间点（2h，6h，24h）进行MRI扫描。

通过Micro-CT扫描，参考附图11，a和b分别代表了靶向材料和非靶向材料的Micro-CT 图片，跟对照组比较，我们能够看出，注射2h后，两种材料的CT信号强度都加强了，没有 明显区别，但是从6h到24h靶向材料Fe₃O₄/Au-FA主要集中在肿瘤部位，而非靶向材料则 慢慢被代谢掉。CT信号强度变化图（图11c）进一步定量验证了Micro-CT图片的结果，跟 非靶向材料比较，在24h，注射靶向材料Fe₃O₄/Au-FA的肿瘤的CT信号强度增加到200.16%， 而非靶向材料Fe₃O₄/Au的肿瘤的CT信号强度只有109.31%。

对于MR成像，参考附图12，注射靶向材料Fe₃O₄/Au-FA（图12a）的裸鼠肝脏处的MRI 信号强度明显比注射非靶向材料Fe₃O₄/Au的裸鼠肝脏处的MRI信号强度低得多。跟对照组 相比，注射靶向材料Fe₃O₄/Au-FA的裸鼠肿瘤部位的信号逐渐从亮白色变到灰色，表明靶向 材料降低了肿瘤部位的MRI信号强度；而注射非靶向材料Fe₃O₄/Au的裸鼠肿瘤部位的信号 没发生太大变化，这些结果表明靶向材料Fe₃O₄/Au-FA能特异性靶向裸鼠肿瘤部位用于靶向 MRI成像。MRI信号强度变化图（图12c）进一步定量验证了MRI图片的结果，跟对照组比 较，注射靶向材料Fe₃O₄/Au-FA的裸鼠肿瘤部位的信号强度从2h（79.38%）到24h（56.24 %）逐次降低，而注射非靶向材料Fe₃O₄/Au的裸鼠肿瘤部位的信号强度从2h（82.71%）到 24h（93.43%）逐次升高，信号慢慢恢复到初始强度。

这些结果也表明靶向材料Fe₃O₄/Au-FA能特异性靶向表达叶酸受体的裸鼠肿瘤部位用于 MRI/CT双模态成像。

实施例8

为了研究靶向材料Fe₃O₄/Au-FA在体内生物组织分布情况，首先通过尾静脉注射纳米材 料的PBS溶液（Au质量为0.2mg）入肿瘤裸鼠体内，然后用ICP-AES测量Au元素在注射 后不同时间点（12或36h）在各个重要器官中的含量。

从图13中可看出，跟对照组（注射前）相比，Au元素主要分布在肝（在注射12和36 h后，每克器官含Au量分别为19.5μg和56.1μg）和脾脏（在注射12和36h后，每克器 官含Au量分别为59.0μg和190.6μg）处，并且随着时间的增长，聚集量越多；而对于这两 个时间点，在其他的器官，比如：肺、肾和肿瘤，金的聚集明显少得多。这些结果表明，靶 向材料Fe₃O₄/Au-FA能被巨噬细胞吞噬掉，并在小鼠体内正常的代谢清除。同时需要指出的 是，跟对照组肿瘤部位（每克肿瘤含金量为0.1μg）比较，靶向材料能特异性靶向肿瘤部位， 在注射24h后，肿瘤部位含金量最多，达到1.0μg，在注射36h后，肿瘤部位含金量降低到 0.6。这些结果不仅表明靶向材料Fe₃O₄/Au-FA对肿瘤部位具有很好的靶向性，可用于肿瘤靶 向成像，而且表明材料能在小鼠体内能慢慢的正常的代谢清除，且不显示毒性。参考附图13。

对比例

（1）将2.375mL HAuCl₄·4H₂O水溶液（31.75mg/mL）加入到G5.NH₂溶液（100mg溶解 于10mL超纯水中）中，搅拌半小时。然后向其中加入冰浴处理的硼氢化钠溶液（40.50mg 溶于2mL超纯水/甲醇体积比为2:1的混合液），搅拌还原反应2小时，对水透析三天，冷 冻干燥得到产品{(Au⁰)₅₀-G₅.NH₂}DENPs纳米颗粒。

（2）通过静电层层自组装的方法，在0.5mL Fe₃O₄（10mg/mL水溶液）纳米颗粒表面依 次组装聚谷氨酸（PGA,1mg/mL溶于pH7.4的PBS缓冲液，1mL）、聚赖氨酸（PLL,1mg/mL 溶于pH7.4的PBS缓冲液，1mL）和聚谷氨酸（PGA,1mg/mL溶于pH7.4的PBS缓冲液， 1mL）三层膜，在形成的PGA/PLL/PGA多层膜修饰的Fe₃O₄纳米颗粒表面进一步组装过量 的端基为氨基的{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs溶液（1mg/mL溶于pH7.4的PBS缓冲液）。每次 组装吸附持续20min，8000rpm离心10min除掉过量的反应物，离心洗涤3次，再重新分散 于水中。组装结束后，在pH5.5的2-（N-吗啉）乙磺酸（2-(N-morpholino)ethane sulphonic acid， MES）（50mM）缓冲液条件下，进行EDC交联反应20小时后，离心水洗3次得到 Fe₃O₄/PGA/PLL/PGA/{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂}DENPs(Fe₃O₄Au)纳米材料。

（3）可以通过改变控制逐层金种还原反应的次数来调节Fe₃O₄Au纳米材料的Au/Fe₃O₄摩尔比。首先将40μL HAuCl₄·4H₂O溶液（31.74mg/mL）加入到上述合成的Fe₃O₄Au([Fe] =1.22mg/mL，[Au]=0.28mg/mL，2mL)溶液中，超声反应8min，再加入40μL水合肼 （N₂H₄·H₂O）超声反应8min，重复还原反应6-7次。最后将上述制备的材料离心（10000rpm， 8min.）水洗4次，再均匀分散在5mL超纯水中。向上述制备的5mL Fe₃O₄Au水溶液中加 入50μL三乙胺。振荡30分钟充分混合后，再逐滴加入15μL乙酸酐，将玻璃瓶放置在摇床 上，振荡反应20小时，离心（10000rpm，8min.）水洗4次，再均匀分散在2mL超纯水中， 制得表面乙酰化的对照材料Fe₃O₄/Au纳米颗粒。

通过UV-Vis和ICP-AES测试来鉴定对比例中的Fe₃O₄/Au的Au/Fe₃O₄摩尔比（参考附图 1和2）。其中图1代表乙酰化前不同Au/Fe₃O₄摩尔比的Fe₃O₄/Au的UV-Vis图谱，图2代表 乙酰化后的Fe₃O₄/Au和Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒的UV-Vis图谱，从图1和图2中可以看出， 跟没有吸收峰的Fe₃O₄纳米颗粒相比，Fe₃O₄/Au和Fe₃O₄/Au-FA纳米颗粒在520nm处显示出 一个吸收峰，证实了Au元素的存在；随着金种还原反应的次数的增加，在520nm处的吸收 峰越来越明显，且ICP结果也表明Fe₃O₄/Au纳米颗粒的Au/Fe₃O₄摩尔比从0.20:1增加到 1.59:1。