类姜黄素缩芳香胺希夫碱衍生物及其制备方法和在制备抗菌药物的应用

摘要

本发明涉及一种类姜黄素缩芳香胺希夫碱衍生物及其制备方法和在制备抗菌药物的应用，属于合成类姜黄素缩3,5-二芳香胺希夫碱衍生物以及其用途技术领域。技术方案是：将取代芳香胺用无水乙醇溶解，加入催化量的甲酸、无水三氯化铝，搅拌，滴加上述反应制备的姜黄素类似物乙醇溶液，氮气保护；回流，反应物用硅胶层析的方法分离，即得到目标产物。上述姜黄素缩芳香胺希夫碱衍生物制备抗菌药物，用于抗金黄色葡萄球菌、链球菌。本发明的积极效果：本发明化合物对金黄色葡萄球菌、链球菌均有明显的抑制作用，与母体姜黄素比，抑菌效果更好且抑菌有效时间更长，提高生物利用度及抗菌活性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种类姜黄素缩芳香胺希夫碱衍生物及其制备方法和在制备抗菌药物的应用，属于合成类姜黄素缩3, 5-二芳香胺希夫碱衍生物以及其用途技术领域。

背景技术

姜黄来源于姜科植物姜黄( Curcumalonga L ) 的根茎，1842 年首次从中分离到黄色物质姜黄色素，姜黄素[curcumin，化学名称：1, 7-二( 4-羟基-3-甲氧基)苯基-1, 6-庚二烯-3, 5-二酮］是 其 主 要 有 效 成 分。1910年姜黄素的化学结构首次被鉴定。研究发现，姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗凝、降脂、抗动脉粥样硬化、抗衰老、消除自由基及抑制肿瘤生长等生物活性。但是，由于姜黄素水溶性差，尤其在中性至碱性pH值条件下不稳定，同时姜黄素口服吸收后迅速被肝脏代谢，首过消除现象明显，生物利用度低，所以对姜黄素进行适当的结构改造，以提高其生物利用度及药效，因此，对姜黄素进行结构改造或合成姜黄素类似物便成为国内外学者研究关注的重点。其中对姜黄素的结构修饰的有：(1) 对姜黄素的两个羰基进行修饰，合成金属配合物等，例如：公开号为CN101904835A的中国专利“姜黄素-锌化合物在制备抑菌镇痛药物或保健护理品中的应用”，说明姜黄素-锌化合物在镇痛抑菌上有良好的药效，克服了现有的老年性疾病治疗中普遍存在药物适用症单一，疗效不尽理想的问题；(2) 对姜黄素结构中活泼亚甲基的取代合成也是研究热点，如公开号CN101434525A中国专利“4-(4-羟基-3-甲氧基苯甲基)姜黄素及其用于制备抗肿瘤药物的应用”，合成的抗肿瘤药物能够显著抑制多种人肿瘤细胞的增殖；(3) 对苯环取代基的修饰，美国专利：US2007204412(A1) Curcumin and its derivatives for use as silscone colorants，在姜黄素的酚羟基上引入硅烷取代基，用于硅树弹性体等硅材料着色。

另外，希夫碱作为一类重要的有机配位体，可以与许多金属离子通过配位键形成配合物，因此在药学、催化、分析化学、腐蚀以及光致变色领域有广泛的应用。1931年由Peiifer等人首次合成希夫碱，而20世纪60年代才真正开始受到化学工作者的重视，尤其在近年来，由于某些希夫碱具有特殊的生理活性，越来越引起医药界的重视。据报道，氨基酸类、缩氨脲类、缩胺类、杂环类、腙类希夫碱及其应用的配合物具有抑菌、杀菌、抗肿瘤、抗病毒等独特药用效果。因此，如何提高生物利用度及药效，是本领域亟待解决的技术问题之一。

发明内容

本发明目的是提供一种类姜黄素缩芳香胺希夫碱衍生物及其制备方法和在制备抗菌药物的应用，通过合成姜黄素类似物1, 7-二( 4-二甲胺基)苯基-1, 6-庚二烯-3, 5-二酮］，再在分子中的3, 5-二酮位置与两分子的芳香胺进行缩合反应，形成类姜黄素缩3, 5-二芳香胺希夫碱衍生物，并制备抗菌药物，提高生物利用度及抗菌活性，解决背景技术存在的上述问题。

本发明的技术方案是：

一种类姜黄素缩芳香胺希夫碱衍生物，其结构式为：                                                

其中R是氟、氯、溴、碘、羟基、甲氧基、烷基之一，R基在苯环的邻、对、间位；在苯环上存在两个或两个以上不同基团，基团相对位置是连、间、对位。

一种类姜黄素缩芳香胺希夫碱衍生物的制备方法，包含如下步骤：将取代芳香胺用无水乙醇溶解，加入催化量的甲酸、无水三氯化铝，搅拌，滴加上述反应制备的姜黄素类似物乙醇溶液，氮气保护；回流，反应物用硅胶层析的方法分离，即得到目标产物。

更具体的步骤：将三氧化二硼、乙酰丙酮和硼酸三丁酯混合于三颈烧瓶中并用氮气保护，回流反应，得到乙酰丙酮与三氧化二硼络合物，而后加入DMF、4-二甲胺基苯甲醛、正丁胺反应，结束后调pH值为7，洗涤有机相，用薄层层析分离得黄色粉末产物，即为目标产物；其反应过程示意式如下：。

一种类姜黄素缩芳香胺希夫碱衍生物在制备抗菌药物的应用，用上述姜黄素缩芳香胺希夫碱衍生物制备抗菌药物。

制备的抗菌药物用于抗金黄色葡萄球菌、链球菌或其它致病细菌。

本发明的积极效果：通过合成姜黄素类似物1, 7-二( 4-二甲胺基)苯基-1, 6-庚二烯-3, 5-二酮］，再在分子中的3, 5-二酮位置与两分子的芳香胺进行缩合反应，形成类姜黄素缩3, 5-二芳香胺希夫碱衍生物，并制备抗菌药物，提高生物利用度及抗菌活性，本发明化合物对金黄色葡萄球菌、链球菌均有明显的抑制作用，与母体姜黄素比，抑菌效果更好且抑菌有效时间更长。

附图说明

图1  本发明的化合物名称及相应的分子结构；

图2 为本发明实施例反应式。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：类姜黄素衍生物1，7-二(4-二甲胺基苯基)- 3，5-二(4-氟苯亚氨基)-1，6-庚二烯(DAEF)的合成。

在三口烧瓶中加入2mmol的4-氟苯胺，5mL无水乙醇溶解，然后加入催化剂量的甲酸和无水三氯化铝，搅拌下，缓慢滴加1mmol的上述产物姜黄素类似物DAEO和12mL无水乙醇的混合溶液，加热回流反应，氮气保护，反应15小时，薄层层析检测反应，反应结束后，萃取出有机相，浓缩，用硅胶薄层层析分离(石油醚:乙酸乙酯=2:1)，得到黄色固体产物，产率为12.4%。并通过FTIR、MALDI-TOP、¹HNMR等方法证实了该化合物的结构。IR(KBr) ν: 3046， 2982， 2841， 1645， 1633，1500-1600， 1355， 1233cm^-1 质谱MALDI-TOF  m/z: 549(M+H)⁺;  ¹HNMR (CDCl₃， 400 MHz) δ：1.65 (s， 2H， -CH₂-)， 3.14 (s， 12H， N-CH₃)， 5.20-6.20(d， 4H， HC=CH-Ar)， 6.88-7.76(m， 16H， H-Ar)。分子式C₃₅H₃₄F₂N₄元素分析计算值：C 76.62; H 6.25; F 6.93; N 10.21。实测值C 76.50; H 6.37; F 6.81; N 10.32。

实施例2：类姜黄素衍生物1，7-二(4-二甲胺基苯基)- 3，5-二(4-氯苯亚氨基)-1，6-庚二烯(DAECl)的合成。

在三口烧瓶中加入2mmol的4-氯苯胺，5mL无水乙醇溶解，然后加入催化剂量的甲酸和无水三氯化铝，搅拌下，缓慢滴加1mmol的上述产物姜黄素类似物DAEO和15mL无水乙醇的混合溶液，加热回流反应，氮气保护，反应8小时，薄层层析检测反应，反应结束后，萃取出有机相，浓缩，用硅胶薄层层析分离(石油醚:乙酸乙酯=3:1)，得到黄色固体产物，产率为22.7%。并通过FTIR、MALDI-TOP、¹HNMR等方法证实了该化合物的结构。IR(KBr) ν: 3036，2979，2839，1642，1631，1490-1580，1350，733cm^-1 质谱MALDI -TOF  m/z: 581(M+H)⁺;  ¹HNMR (CDCl₃，400 MHz) δ：1.60 (s，2H，-CH₂-)，3.12 (s， 12H，N-CH₃)，5.09- 6.14(d，4H，HC=CH-Ar)，6.54- 7.56(m，16H，H-Ar)。分子式C₃₅H₃₄Cl₂N₄元素分析计算值：C 72.28; H 5.89; Cl 12.19; N 9.63。实测值C 72.03; H 5.94; Cl 12.32; N 9.71。

实施例3： 类姜黄素衍生物1, 7-二(4-二甲胺基苯基)- 3, 5-二(4-溴苯亚氨基)-1, 6-庚二烯(DAEBr)的合成。

在三口烧瓶中加入2mmol的4-溴苯胺，5mL无水乙醇溶解，然后加入催化剂量的甲酸和无水三氯化铝，搅拌下，缓慢滴加1mmol的上述产物姜黄素类似物DAEO和15mL无水乙醇的混合溶液，加热回流反应，氮气保护，反应3小时，薄层层析检测反应，反应结束后，萃取出有机相，用硅胶薄层层析分离(石油醚:乙酸乙酯=4:1)，得到黄褐色固体产物，产率为34.7%。并通过FTIR、MALDI-TOP、¹HNMR等方法证实了该化合物的结构。IR(KBr) ν: 3032，2966， 2834，1640，1627，1488-1575，1346，623cm^-1 质谱MALDI-TOF m/z: 669(M+H)⁺;  ¹HNMR (CDCl₃， 400 MHz) δ：1.56 (s，2H，-CH₂-)，3.07 (s，12H，N-CH₃)， 5.02- 6.12(d， 4H， HC=CH-Ar)， 6.45- 7.53(m， 16H， H-Ar)。分子式C₃₅H₃₄Br₂N₄元素分析计算值：C 62.70; H 5.11; Br 23.83; N 8.36。实测值 C 62.43; H 5.18; Br 23.97; N 8.42。

实施例4：类姜黄素衍生物1，7-二(4-二甲胺基苯基)- 3，5-二(4-碘苯亚氨基)-1，6-庚二烯(DAEI)的合成。

在三口烧瓶中加入2mmol的4-碘苯胺，5mL无水乙醇溶解，然后加入催化剂量的甲酸和无水三氯化铝，搅拌下，缓慢滴加1mmol的上述产物姜黄素类似物DAEO和15mL无水乙醇的混合溶液，加热回流反应，氮气保护，反应7小时，薄层层析检测反应，反应结束后，萃取出有机相，浓缩，用硅胶薄层层析分离(石油醚:乙酸乙酯=5:1)，得到淡褐色固体产物，产率为31.8%。并通过FTIR、MALDI-TOP、¹HNMR等方法证实了该化合物的结构。IR(KBr) ν: 3029，2962，2831，1637，1625，1485-1572，1343，587cm^-1 质谱MALDI-TOF  m/z: 765(M+H)⁺;  ¹HNMR (CDCl₃，400 MHz) δ：1.55 (s，2H，-CH₂-)，3.04 (s， 12H，N-CH₃)， 5.00-6.11(d，4H，HC=CH-Ar)，6.43- 7.55(m，16H，H-Ar)。分子式C₃₅H₃₄I₂N₄元素分析计算值：C 54.99; H 4.48; I 33.20; N 7.33。实测值 C 54.73; H 4.55; I 33.31; N 7.41。

本发明个实施例类姜黄素衍生物DAEF（实施例1）、DAECl（实施例2）、DAEBr（实施例3）、DAEI（实施例4）抑制金黄色葡萄球菌(细菌号ATCC29213)、草绿色链球菌的体外生长活性实验。

6.1 培养基制备：牛肉膏0.3克 ，蛋白胨1.0克，氯化钠 0.5克，琼脂 1.5克，水 100毫升在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，加热溶解后，加入琼脂，搅拌，等琼脂完全溶解后补足失水，调pH值到7.2～7.6，分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌30分钟。

6.2 细菌的分离纯化：以无菌的接种环分别挑取金黄色葡萄球菌和链球菌培养物，先在血琼脂平板上端琼脂表面涂一菌膜(约占平板总面积的1/10)，将接种环经火焰灭菌后再以“四段分区划线法”：共划4区，将混杂的细菌分散开来。随后将平板倒置于(37±0.5)℃条件下培养18-24h。

6.3 细菌的纯种扩增：以灭菌已冷却的接种环在上述培养的细菌平板上分别挑取典型的细菌菌落，伸入待接种的血琼脂斜面培养基，自下而上地蜿蜒划线涂布；将接种好的试管放于(37±0.5)℃条件下培养18-24h。

6.4 细菌的分组：提取物的抑菌实验分别用无菌移液管吸取上述制备的2种供试菌悬液0.1 ml 添加到平板培养基上，将培养皿倒置在培养箱中37 ℃培养 24～48 h，取出测定滤纸片抑菌圈的直径大小，比较抑菌效果。分4个不同药物组，同时用正常空白、乙酸乙脂、姜黄素做对照，每个药物做两种细菌株实验，共计14个培养皿。

6.5 测试方法

6.5.1 各新合成物质称中4mg备用，避光40℃冰箱保存。

6.5.2 固体培养基的制备  称取营养琼脂置于三角烧瓶中，用去离子水将其充分溶解，封口，放入高压灭菌锅中，121℃灭菌15 min，待冷却到 60 ℃后取出，倒入一次性培养皿中，待冷却凝固后放入冰箱中，4℃保存备用。

6.5.3 菌悬液的制备  直接分别取纯种扩增后的菌苔少许用液体培养基调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。然后再用培养基进行1∶100稀释后备用。取3 只试管，分别倒入等量生理盐水至试管的1/3 处，于紫外灯下灭菌20 min，然后用无菌棉签蘸取新鲜菌种少量 4～5个菌落放入生理盐水充分搅动使细菌分散均匀。所有步骤均在无菌操作台上完成。

6.5.4  姜黄素及其衍生物的抑菌实验

     准备好14个无菌的5ml EP管，分别做好标记，金葡菌分为7组，编号Ⅰ~Ⅳ号为药物组；姜黄素对照组；乙酸乙酯对照组；正常空白对照组，链球菌分组同金黄色葡萄球菌。取4mg的药物溶于20μL的乙酸乙酯中，在加入2ml的无菌细菌培养基，将各组药物配置成浓度为2mg/ml的储液。乙酸乙酯对照组只加入20μL的乙酸乙酯，再加入2ml无菌培养基。将固体培养基中的菌落(金黄色葡萄球菌和链球菌)分别取出放入盛有30ml的无菌培养基的50ml无菌离心管中，用移液器将菌液吹打成单细菌悬液，之后将吹打均匀的菌液吸出放入准备好的无菌5ml EP管中，每个EP管中加菌液1ml，待加完菌液后把之前配置好的药物吸取1ml放入金葡菌组，1ml放入链球菌组，使药物的最终浓度为1mg/ml，充分吹打混匀后置于37℃ CO₂培养箱中培养24h、36h后进行细菌计数。

6.5.5细菌计数：将20μL的菌液加入3980μL的PBS液中，稀释菌液200倍后于倒置显微镜下进行细菌计数，肉眼计数计数板4个角的菌落数，共计三次，取平均数。计算公式：细菌总数=(四个大格细菌数之和/4)×200×10⁴。

6.5.6 抗菌活性标准：根据人民卫生出版社第六版《药理学》教材。能够抑制培养基内细菌生长的最低浓度为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration， MIC)。以抑制50%细菌生长为药物疗效标准。

6.6 抑菌效果

6.6.1 与正常对照组比较：

(1) 四个新化合物对24小时、36小时金黄色葡萄球菌有持续抑制能力；                                                                                                                                                       (2) 四个新化合物对24小时、36小时肺炎链球菌有持续抑制能力；                                          

(3) 其中新化合物DAEF对24小时金黄色葡萄球菌抑制能力最强达95%；                                  

6.6.2与姜黄素比较：                                                                                                              

(1) 四个新化合物对24小时肺炎链球菌抑制能力比姜黄素强(>79%)；                                               

(2) 四个新化合物对36小时肺炎链球菌有持续抑制能力，比姜黄素强(>72%)；    

(3) 四个新化合物对36小时对金黄色葡萄球菌抑制能力比姜黄素强(>64%)。