家蚕PABP结合蛋白互作因子基因BmPaip1及其重组表达载体和应用

摘要

本发明公开了家蚕PABP结合蛋白互作因子基因BmPaip1，其核酸序列如SEQIDNO.3所示，该基因的编码框长1194bp，由8个外显子构成，编码398个氨基酸，理论蛋白分子量为44kDa，等电点pI=5.02；通过SMART在线软件分析发现家蚕BmPaip1的氨基酸序列中第100至398位与真核生物的eIF4G蛋白高度同源，通过在昆虫细胞中表达检测，发现转家蚕BmPaip1基因的细胞中能显著提高报告基因LUC的表达水平，因此家蚕BmPaip1基因能够与eIF4E和eIF4A结合形成翻译起始复合物，可以用于提高外源基因的翻译效率。

说明书

 

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及家蚕PABP结合蛋白互作因子基因BmPaip1，还涉及含有该基因的重组表达载体和该基因的应用。

背景技术

随着21世纪生物工程以及基因工程的迅速发展，人们对医用、药用、食用、美容、保健等各种用途的功能性蛋白需求量日益增大，依靠天然来源的蛋白质提取已无法满足快速增长的市场需求。建立和完善各种高效的原核和真核表达系统，并利用菌株、细胞和昆虫等作为宿主生物反应器，是实现低成本、规模化生产具有生物学活性的重组外源蛋白的有效和可持续方法，并成为当今世界研究的热点。利用中国仓鼠卵巢细胞作为生物反应器生产外源蛋白是目前最为标准的表达模式，但其运营成本和对环境的要求极为苛刻，严重限制了其大规模推广应用。为了建立低成本、规模化、安全可持续的高效生产外源蛋白的生物工厂，自2000年以来，科研人员开始尝试利用转基因生物，如哺乳动物、鸟类、昆虫以及植物的器官作为生物反应器来生产重组外源蛋白。

家蚕以泌丝著称，是最早被人类所完全驯化利用的经济动物（昆虫）之一。绢丝腺是合成、分泌蚕丝蛋白的唯一器官，为整个蚕丝业的生物学基础。经过数千年的人工驯化，家蚕的绢丝腺具备了超强的蛋白质合成与分泌能力，一头体重5g左右家蚕能合成分泌约0.5g蚕丝蛋白，为目前已知昆虫之最。蚕丝蛋白主要由丝素蛋白（fibroin）和覆被在其外层的丝胶蛋白（sericin）构成：丝素蛋白是蚕丝的主体，约占75%，由蚕的后部丝腺合成，包括fib-H链、fib-L链和P25三种主要组分，均不溶于水；其余为丝胶蛋白，约占25%，由蚕的中部丝腺合成，包括丝胶1(Sericin1）、丝胶2(Sericin2）和丝胶3(Sericin3）三种主要组分，其中又以丝胶1蛋白含量最高，均可溶于水。随着现代分子生物学和转基因技术的发展，家蚕绢丝腺的高效合成与分泌丝蛋白这一特征，以及所具备的糖基化、甲基化等对外源蛋白保持活性极其重要的蛋白质翻译后修饰加工能力，饲养成本低，可工厂化生产，对人畜安全等特点，使其成为理想的生物反应器模型，备受各国研究人员关注并竞相开发利用。

2000年，田村等人利用piggyBac转座子介导显微注射家蚕早期胚胎获得了稳定遗传的转基因蚕；2003年，夏庆友等人完成了家蚕基因组计划，家蚕丝腺中涉及丝蛋白合成的重要编码基因如丝素重链(FibH chain)基因、丝素轻链(FibL chain)基因、丝胶1(Sericin1)基因、丝胶2(Sericin2)基因、丝胶3(Sericin3)基因以及P25基因等的启动子调控元件被鉴定和克隆，这些基础研究结果使得利用转基因技术，在家蚕特异组织如丝腺中大规模生产重组外源蛋白成为可能。近年来，国内外利用piggyBac转座子介导的转基因技术以及家蚕组织特异启动子元件在丝腺中尝试表达了多个外源蛋白，包括：在后部丝腺表达了丝素重链融合的EGFP(Zhao et al. 2010)、猫干扰素（Kurihara et al. 2007)、蜘蛛丝牵引蛋白（Zhu et al. 2010)、人Ⅲ型胶原蛋白的部分肽段(Tomita et al. 2003)、增强型红色荧光蛋白(Tomita et al. 2003)，丝素轻链融合的羟基脯氨酸胶原部分肽段(Adachi et al. 2006)、成纤维细胞生长因子(Hino et al. 2006)、增强型绿色荧光蛋白(Shimizu et al. 2007)、部分胶原蛋白肽段（Yanagisawa et al. 2007)，以及P25融合的红色荧光蛋白(Royer et al. 2005)等；在中部丝腺表达了人血清白蛋白（Ogawa et al. 2007)、增强型绿色荧光蛋白(Tomita et al. (2007)、鼠单克隆抗体(Iizuka et al. 2009)、人胶原蛋白α链基因(Adachi et al. 2010)以及可溶性GM-Csf受体α(Urano et al. 2010)等。但总体上，上述研究成果的产业化推进颇为困难，主要原因在于：在丝素中生产的外源蛋白虽具有较高的含量，但重组蛋白极难纯化且易破坏其生物活性；在丝胶中生产的外源蛋白虽较容易纯化，但利用现有丝胶表达系统获得的重组蛋白含量极低而难以实现规模化生产。因此，针对外源蛋白表达合成的各个关键环节，改造并建立新的高效、稳定的表达系统，并通过转基因技术实现外源蛋白的高效生产，是解决上述瓶颈的根本出路。也是今后家蚕生物反应器开发的核心所在。

外源基因在真核细胞、组织中的表达受到转录水平、转录后调控（包括mRNA的转运和稳定性调控）、翻译效率、翻译后调控以及蛋白分泌等一系列调控，这些调控是由启动子调控区、外源基因ORF中的顺式作用元件与宿主体内的反式调控因子协同完成。已有的研究结果表明：对转基因家蚕中部丝腺表达系统的丝胶1(Seicin1)启动子活性进行改进，使其驱动的外源基因的转录水平达到了内源基因转录水平的40-160%，但是外源基因的蛋白合成量却只约占内源基因蛋白合成量的0.8-2.8%，暗示翻译效率是外源重组蛋白表达量的重要限速步骤，因此需要迫切提高外源基因mRNA的翻译效率。真核生物mRNA翻译的起始是由一系列蛋白因子e复合物的形成是整个翻译过程的限速步骤。其中，PABP结合蛋白互作因子（Poly(A)-binding protein (PABP) interacting protein-1，Paip1）是一个关键蛋白因子，在翻译起始复合物的形成中起着桥联作用。有研究发现，在COS-7 细胞中过量表达Paip1基因可以提高荧光素酶（LUC）的mRNA的翻译效率。但是目前未见家蚕Paip1基因的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种家蚕PABP结合蛋白互作因子基因BmPaip1，解决现有技术中转基因家蚕中外源基因转录水平高，但翻译效率低的问题；本发明的目的之二在于提供含有家蚕PABP结合蛋白互作因子基因BmPaip1的重组表达载体，能够高效表达BmPaip1基因；本发明的目的之三在于提供家蚕PABP结合蛋白互作因子基因BmPaip1的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.家蚕PABP结合蛋白互作因子基因BmPaip1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.含有所述家蚕PABP结合蛋白互作因子基因BmPaip1的重组表达载体。

优选的，所述重组表达载体由家蚕PABP结合蛋白互作因子基因BmPaip1经BglⅡ和NotⅠ酶切后，连入经BamHⅠ和NotⅠ酶切后的psl1180[hr3BmAct4-114LUCSer1PA]载体而得。

3.所述家蚕PABP结合蛋白互作因子基因BmPaip1在提高外源基因翻译效率中的应用。

优选的，所述外源基因为荧光素酶基因。

本发明的有益效果在于：本发明从家蚕大造品系的丝腺中克隆获得家蚕PABP结合蛋白互作因子基因BmPaip1，该基因全长1194bp，为一个完整的表达框，由8个外显子构成，编码398个氨基酸，将该序列构建一个重组的表达载体，通过在昆虫细胞中的表达检测，发现BmPaip1能显著提高报告基因LUC的表达水平；因此本发明公开的BmPaip1基因具有提高外源基因翻译效率的功能，该基因可应用于提高外源基因在转基因家蚕中的表达量，促进家蚕转基因生物反应器实用化进程。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1家蚕PABP结合蛋白互作因子基因BmPaip1结构图；（A）为家蚕BmPaip1基因结构示意图，该基因全长1194bp，由8个外显子构成，编码398个氨基酸，白色方框表示外显子，上方数字表示DNA碱基个数；（B）为BmPaip1蛋白功能域。BmPaip1蛋白C端含有一个与eIF4G蛋白高度同源的结构域，与eIF4E和eIF4A结合形成翻译起始复合物。

图2重组表达载体结构图（A为pSL[hA4LUCSer1PA]载体结构图；B为pSL[hA4BmPaip1Ser1PA]载体结构图；hr3CQ为增强子Hr3，BmA4为家蚕肌动蛋白4基因启动子，Ser1PA为丝胶1基因3’UTR序列，AMP为氨苄抗性基因）。

图3 荧光素酶活性检测图（为BmPaip1促进LUC在家蚕胚胎细胞系BmE中的表达检测；为BmPaip1促进LUC在Sf9细胞系中的表达检测；LUC的活性结果表示为萤火虫的荧光素酶酶活性除以海参荧光素酶酶活性（内参）的比值RLU再除以蛋白浓度；每个实验组设置3个平行试验，并进行3次独立重复实验）。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J. 萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中使用的家蚕细胞系为家蚕胚胎细胞系BmE，以及Sf9细胞系均由中国西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室培养和保存。

实施例一、家蚕BmPaip1基因的分子克隆

将从NCBI下载的人类Paip1基因（Homo sapiens poly(A) binding protein interacting protein 1,PAIP1,GI:208022642）序列，在家蚕SilkDB中进行同源比对，检索出一条同源序列BGIBMGA009981-TA，将该序列进行EST拼接发现具有完整的ORF，根据比对结果设计家蚕BmPaip1的编码区引物：上游引物为BmPaip1-F: 5'-aaaaagatctatgaataacggtgatattagtgct-3'（SEQ ID NO.1），下划线为限制性内切酶位点BglⅡ；下游引物为：BmPaip1-R: 5'-aaaagcggccgcttatcgctttatctgattcgatat-3'（SEQ ID NO.2），下划线为限制性内切酶位点NotⅠ。以家蚕大造丝腺cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，55℃退火45秒，72 ℃延伸60秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10分钟，4 ℃保存。将扩增所得PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳回收，然后与pMD18-T载体连接，然后转化DH5α，将筛选获得的阳性克隆进行测序，测序结果如SEQ ID NO.3所示，并命名为家蚕PABP结合蛋白互作因子基因，简称家蚕BmPaip1基因。由SEQ ID NO.3可知，家蚕BmPaip1基因编码框全长1194bp，由8个外显子构成，编码398个氨基酸，理论蛋白分子量为44kDa，等电点pI=5.02，如图1A所示。通过SMART在线软件（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析发现家蚕BmPaip1编码的氨基酸序列中第100至398位与真核生物的eIF4G蛋白结构高度同源的结构域，因此推测家蚕BmPaip1可能与eIF4E和eIF4A结合形成翻译起始复合物，可能具有已报道的Paip1蛋白促进基因翻译效率的功能，其原理如图1B所示。

实施例二、家蚕BmPaip1基因的功能检测

利用BglⅡ和NotⅠ限制性内切酶将BmPaip1从pMD18-T载体上切下，连接至经BamHⅠ和NotⅠ酶切后的psl1180[hr3BmAct4-114LUCSer1PA]骨架载体上（又名pSL[hA4LUCSer1PA]），形成重组载体pSL[hA4BmPaip1Ser1PA]，如图2A所示（psl1180[hr3BmAct4-114LUCSer1PA]载体在公开号为102492692A的中国专利中有记载）。由图2A可知，该重组载体上含有一个Hr3增强子，能够提高下游基因的表达量，家蚕肌动蛋白A4基因启动子驱动家蚕BmPaip1基因表达。

为检测BmPaip1基因是否具有促进转基因基因在昆虫机体内的表达水平的功能，将含荧光素酶报告基因LUC的表达载体pSL[hA4LUCSer1PA]（图2B）与pSL[hA4BmPaip1Ser1PA]表达载体按照1：0，1：1，1：5以及1:10（m：m）混合，然后与脂质体Cellfection（购自Invitrogen公司）按照1：5（m:v）混合后，转染Sf9细胞，72h时检测荧光素酶报告基因LUC的表达，同时以未转染表达载体pSL[hA4LUCSer1PA]的Sf9细胞为对照组（control），LUC的活性测定使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Dual-luciferase reporter assay system, Promega, USA），检测结果如图3所示。由图3可知，对照组中为检测到LUC蛋白表达，在转染pSL[hA4LUCSer1PA]表达的Sf9细胞能检测到LUC蛋白表达，但是与同时转染pSL[hA4LUCSer1PA]和pSL[hA4BmPaip1Ser1PA]载体相比，其表达量较低。由此可知，本发明克隆的BmPaip1基因能够提高LUC蛋白表达量，并随着BmPaip1转染剂量的增加对LUC蛋白表达量的促进效果越明显。因此，家蚕BmPaip1基因具有显著提高基因翻译效率的功能，从而提高蛋白表达量，能够用于促进转基因表达的应用研究。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

<110>  西南大学

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<212>  DNA

<213>  人工序列

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<223>  家蚕BmPaip1基因上游引物

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aaaaagatct atgaataacg gtgatattag tgct   34

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  家蚕BmPaip1基因下游引物

<400>  2

aaaagcggcc gcttatcgct ttatctgatt cgatat  36

 

<210>  3

<211>  1194

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyxmori L.）

<220> 

<223>  家蚕BmPaip1基因

<400>  3

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