分泌SAMHD1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、由该细胞株分泌的单克隆抗体及应用

摘要

本发明公开了一株分泌人SAMHD1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、由该细胞株分泌的单克隆抗体及应用，属于生物技术领域。本发明将纯化的人SAMHD1作为免疫原，按照常规杂交瘤细胞融合技术将免疫小鼠脾细胞与SP2/0融合，最终获得一株能够稳定分泌SAMHD1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3C3，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.6709。Western blot和间接免疫荧光结果表明此株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能特异性识别真核表达的人重组蛋白SAMHD1，而与His标签蛋白以及真核表达的马、猴重组蛋白SAMHD1均不发生反应。因此说明本发明的单克隆抗体能够用于人SAMHD1蛋白的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体及应用，特别涉及一株能够稳定分泌抗人SAMHD1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，及其分泌产生的单克隆抗体及应用，属于生物技术领域。 

背景技术

SAMHD1蛋白是一种鼠γ干扰素诱导基因Mg11的类似物，最近被鉴定为人免疫缺陷病毒（HIV-1）的限制性因子，具有脱氧核苷三磷酸水解酶的功能，在树突状细胞和其他髓系细胞中能阻碍病毒的早期复制，是慢病毒蛋白Vpx的靶目标，其能解除HIV-1的感染限制作用。SAMHD1同时也与AGS综合征相关，SAMHD1的突变能引起AGS，AGS为一种炎性脑病，以慢性脑脊髓炎流质淋巴细胞增多症为特点，能增高抗病毒因子IFN-a的水平。有研究发现，HIV-2和相关的免疫缺陷病毒（SIVsm/mac）能够通过使用它们编码的Vpx蛋白来降解SAMHD1，从而越过骨髓细胞内的保护机制，使人感染病毒。 

SAMHD1基因组全长约1878kb，它是巨噬细胞里的一个酶蛋白，有研究发现：SAMHD1降解了巨噬细胞内的大部分脱氧核苷酸，而脱氧核苷酸是病毒复制所需的必要原料，从而抑制了病毒的反转录和病毒cDNA的形成，使髓系细胞不感染HIV。如果我们能阻止艾滋病毒在这些细胞内的复制，就可以抑制艾滋病在其他细胞内的复制，这样就能够防止艾滋病的发生。本研究构建了SAMHD1基因的重组质粒，表达并纯化出了具有很好反应原性的可溶性融合蛋白，对于SAMHD1单克隆抗体的制备及其磷酸水解酶实验提供了基础材料。 

发明内容

本发明以人血浆中淋巴细胞提取的RNA为基础，通过RT-PCR方法，扩增出SAMHD1基因并克隆至pMD-18T载体。测序鉴定正确后，通过双酶切将SAMHD1基因亚克隆至原核表达载体pET-30a，构建重组质粒pET30a-SAMHD1并转化 Rosetta（DE3）。通过对表达条件的优化，最终获得分子质量约79kDa、可溶性形式的重组蛋白SAMHD1，并采用镍柱对该蛋白进行纯化。 

Western blot检测结果表明，纯化的SAMHD1蛋白能与Abcam公司的SAMHD1抗体发生特异性反应，表明其具有良好的抗原性。 

将纯化的人SAMHD1作为免疫原，腹腔接种4周龄BALB/c小鼠。按照常规杂交瘤细胞融合技术将免疫小鼠脾细胞与SP2/0融合。用镍柱纯化的SAMHD1为筛选抗原，建立间接ELISA方法，筛选出针对SAMHD1单克隆抗体的杂交瘤细胞，最终获得一株能够稳定分泌SAMHD1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3C3，分类命名为抗人SAMHD1单克隆抗体3C3杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.6709，保藏日期为2012年10月29日。 

Western blot和间接免疫荧光结果表明此株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能特异性识别真核表达的人重组蛋白SAMHD1，而与His标签蛋白以及马、猴真核表达的重组蛋白SAMHD1均不发生反应。 

因此，进一步的本发明还提出了由所述的杂交瘤细胞株分泌的抗人SAMHD1蛋白的单克隆抗体，及所述的单克隆抗体在制备检测人SAMHD1蛋白试剂中的应用。 

附图说明

图1为PCR扩增结果； 

Ｍ：DL2000DNA Marker；1．目的片段的PCR产物;2．阴性对照。 

图2为重组质粒pET30a-SAMHD1的双酶切鉴定； 

Ｍ1：DL2000DNA Marker；2．pET30a－SAMHD1的BamHⅠ和NotⅠ酶切结果；M2：DL15000DNA Marker； 

图3为重组蛋白的SDS-PAGE分析； 

M、蛋白质Marker；1、经IPTG诱导表达17h的全菌；2、裂解后的上清；3、裂解后的沉淀； 

图4为纯化重组蛋白的SDS-PAGE分析； 

M、蛋白质Marker；1、纯化后的上清； 

图5为重组蛋白SAMHD1的western-blot分析； 

Ｍ：蛋白质Marker；1：纯化后的重组蛋白；2：pET32a/Rosetta(OE3)对照 

图6为MAb的western blot鉴定； 

M、蛋白质Marker1、SAMHD1的真核表达蛋白2、pET30a/Rosetta(OE3)对照； 

图7为MAb的间接免疫荧光鉴定结果； 

1、3C3；2、Negative control：SP2/0上清。 

图8为MAb的特异性分析。 

M、蛋白质Marker；1、人SAMHD1的真核表达蛋白；2、猴SAMHD1的真核表达蛋白；3、马SAMHD1的真核表达蛋白；4、293T细胞空白对照；5、马皮细胞；6、兔肾细胞。 

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 

实施例1抗人SAMHD1蛋白单克隆抗体的制备及单抗特异性分析 

1材料与方法 

1.1菌株、载体: 

HB101感受态细胞、Rosetta（DE3）、克隆载体pMD18-T、表达载体pET30a(+)(哈尔滨兽医研究所马病研究组保存)。 

1.2主要试剂 

RNA提取试剂盒、胶回收(小量)试剂盒，购自上海华舜生物工程有限公司;质粒提取试剂盒，购自OMEGA公司;DL－15000、DL－2000Marker、低分子质量蛋白质标准、限制性内切酶(BamHI、Not I)、Ex Taq酶、dNTP mixture、T4DNA连接酶、异丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、氨苄西林、卡那霉素(kan)，均购自宝生物工程(大连)有限公司；羊抗鼠二抗(IRD-IgG)，SAMHD1抗体购自Abcam公司。SAMHD1和骨髓瘤细胞SP2/0由本发明发明人所在实验室保存；BALB/C小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。HAT选择性培养基、HT选择 性培养基、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FICA)、IRD标记的羊抗鼠IgG(IRD-IgG)、羊抗鼠荧光二抗(FITC-IgG)、PEG-4000均购自Sigma公司；DAB显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Hi TrapProteinG HP购自GE公司。SBAClonotyping TM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒购于Southern Biotechnology公司。 

1.3引物的设计与合成 

根据GenBank上发表的SAMHD1基因序列设计一对引物，上游引物引入BamHI酶切位点，下游引物引入Not I酶切位点（下划线部分）。上游引物Homo BamH1sqSAMHD1F：5'－CCA AGGATCCAT GCAGCGAGCCGATTCC－3'；下游引物Homo.Not1.sqSAMHD1.R：5'－CCAAGCGGCCGCCATTGGGTCATCTTTAAAAAGC－3'。引物由上海博士生物工程技术服务有限公司合成。 

1.4目的基因的RT-PCR扩增 

采人血20ml，加入肝素钠抗凝，用0.01M的PBS按1∶1的比例稀释，将其加入预先装有15ml淋巴细胞分离液的离心管内，采用梯度离心法以1000g的转速分离单个核细胞，将中层的单个核细胞按照小量RNA抽提试剂盒说明提取RNA，并反转录合成cDNA。以其为模板，扩增SAMHD1基因片段（95℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃1.5min30s，30个循环后，72℃延伸10min）。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。 

1.5原核表达载体PET-SAMHD1的构建与鉴定 

将SAMHD1基因的PCR产物胶回收后克隆入pET-30a（+）载体，转化HB101感受态细胞，可疑菌落经PCR和双酶切鉴定正确后送往Invitrogen公司测序。测序正确的阳性质粒与pET-30a（+）载体分别用BamHI＋NotI双酶切，再经胶回收、T4DNA连接酶连接、连接产物转化Rosetta感受态。挑取可疑阳性菌落，经PCR、酶切及测序鉴定后，抽提阳性质粒，将其命名为pET30a-SAMHD1。 

1.6SAMHD1基因的原核表达的最优表达条件摸索与SDS-PAGE分析 

将重组质粒pET30a-SAMHD1转化表达感受态Rosetta（DE3），挑取卡那抗性LB平板上的白色单菌落，接种于5ml含Kana^＋的LB培养液中37℃过夜培养。次日，将菌液按1：100比例接种于含K⁺的LB培养液中，37℃摇床振荡培养至OD_600nm达到0.4-0.6时，进行如下条件的摸索以确定蛋白的最优表达条件。 

1.6.1诱导温度和时间的确定 

当转化菌液的OD_600nm达到0.4-0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，分别置于16℃、30℃和37℃摇床振荡培养，培养时间分别为17h、8h和6h。取样，4000rpm离心10min，弃上清，用原体积1/10的PBS重悬沉淀后超声破碎。12000rpm离心 20min，分别收集上清和沉淀，经SDS-PAGE进行重组蛋白SAMHD1可溶性分析。 

1.6.2IPTG诱导浓度的确定 

当转化菌液的OD600nm达到0.4-0.6时，分别以终浓度0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1mM的IPTG于16℃诱导表达16h。取样，4000rpm离心10min，弃上清，同样用原体积1/10的PBS重悬沉淀。进行SDS-PAGE电泳以确定IPTG的最佳诱导浓度。 

1.7原核表达重组SAMHD1的纯化 

根据Ni-NTA His Bind Resin说明书进行蛋白样品、Ni-NTA柱处理及蛋白样品的纯化，蛋白纯化的整个操作过程中过柱溶液均靠重力自然沉降。 

1.8原核表达重组蛋白SAMHD1的抗原性鉴定 

将纯化的SAMHD1做SDS-PAGE电泳后进行电转印（15V电压1h）。转印后将硝酸纤维素膜用含5％脱脂奶粉的PBS封闭液4℃封闭过夜。PBST洗膜3遍，10min/次。以1：10000稀释的Abcam的SAMHD1抗体作为一抗，室温作用2h。PBST洗涤3次，再与1：10000倍稀释的IRD标记的羊抗鼠-IgG为二抗室温作用1h，PBST洗涤3次，用成像仪扫描记录结果。 

1.9动物免疫 

SAMHD1蛋白经镍柱纯化后作为免疫原，与等体积的弗氏完全佐剂乳化，经腹腔接种4周龄BALB/C小鼠，100μｇ／只。以后每间隔2周将免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化进行免疫，共免疫3次。在三免后第7～10天尾部静脉采血测抗体效价，当抗体效价达到1∶10⁴以上时，用不加佐剂的抗原于腹腔加强免疫，100μg／只。按制备单抗的常规方法，3ｄ后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。 

2.0间接ELISA检测方法的建立 

以纯化的SAMHD1原核表达蛋白作为包被抗原，采用棋盘滴定法建立检测杂交瘤细胞的间接ELISA方法，通过酶标仪读取OD_450nm值。取阳性孔OD_450nm值接近1.0，P/N值最大的抗原、抗体稀释度作为二者的最佳工作浓度。 

2.1细胞融合及杂交瘤细胞的筛选 

将免疫鼠的脾细胞与SP2/0用PEG4000进行融合，用建立的ELISA方法进行筛选。经4次亚克隆后，选择D_450nm值高且能稳定分泌抗体的细胞扩大培养。每次亚克隆前都要及时进行细胞冻存。 

2.2MAb的鉴定 

2.2.1腹水的制备及效价的测定 

按照“2.0”中建立的间接ELISA方法对3C3杂交瘤细胞上清及腹水效价的测定，即将所得的细胞上清和腹水分别从1：20开始做一系列梯度稀释，稀释倍数为2。同时设置空白、标准阴、阳性血清对照。判定标准为阳性值接近1.0，阴性值小于0.2，且检测样品值是阴性值的2.1倍，此时的最大稀释倍数为腹水和杂交瘤上清的ELISA效价。 

2.2.2MAb免疫球蛋白亚类鉴定 

利用SBA Clono-typing TM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒对MAb进行亚类鉴定。 

2.2.3MAb的western blot鉴定 

将SAMHD1-PCDNA3.1重组质粒转染293T细胞，37℃培养48小时后收集细胞并将其裂解，裂解物经SDS-PAGE转印硝酸纤维素膜，用纯化的浓度为1mg/ml的SAMHD1抗体按1∶10000稀释作为一抗，羊抗鼠IRD-IgG作为二抗（1∶10000）,进行western blot分析。 

2.2.4间接免疫荧光和Western blot鉴定MAb 

采用Western blot分析单抗与重组His－SAMHD1和His蛋白的反应活性，以及单抗与真核表达SAMHD1、pcDNA3.1空载体反应。 

2.3单抗特异性分析 

采用Western blot分析单抗与真核表达人、猴、马SAMHD1-HA重组蛋白及未转染的马皮细胞、兔肾细胞、293T细胞的反应活性，分析其特异性。 

2结果 

2.1PCR扩增结果 

以提取的血液中的单个核细胞中的RNA为模板进行RT-PCR，经琼脂糖凝胶电泳检测，得到约1878kb的片段(见图1)，与预期大小相符。 

2.2重组表达载体的鉴定结果 

将获得的重组表达载体pET30a-SAMHD1用BamH I和Not I进行酶切鉴定，得到5400bp和1878bp左右的片段(见图2)，与预期相符。 

2.3重组SAMHD1蛋白SDS-PAGE电泳分析 

通过对表达条件的优化，确定最佳诱导温度为16℃、最佳诱导时间为17h、IPTG浓度为0.2mmol/L时，目的蛋白的表达量最大且主要以可溶形式存在。菌液经超声波破碎和SDS-PAGE电泳分析，出现1条约79ｋa的蛋白条带(见图3)，与预期相符。 

2.4原核表达重组SAMHD1的纯化 

纯化的SAMHD1蛋白分子在约79kDa处出现一条蛋白带，与预期相符(图4)。 

2.5SAMHD1蛋白的Western-blot检测结果 

将纯化的SAMHD1蛋白进行Western-blot检测分析，结果表明，重组SAMHD1蛋白可与Abcam公司的SAMHD1抗体发生特异性反应，而pET30a(+)/Rosetta(DE3)与此抗体不反应(见图5)。 

2.6MAb的western blot鉴定 

用镍柱纯化的SAMHD1为筛选抗原，建立间接ELISA方法，筛选出针对SAMHD1单克隆抗体的杂交瘤细胞，最终获得一株能够稳定分泌SAMHD1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3C3，分类命名为抗人SAMHD1单克隆抗体3C3杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.6709。 

用上述的杂交瘤细胞株分泌产生的3C3MAb检测真核表达蛋白人SAMHD1和pcDNA3.1空白对照。检测结果表明，此株MAb作用后产生的条带大小均与SAMHD1蛋白大小(79KDa)一致且与空载体对照无反应（图6）。 

2.7MAb的间接免疫荧光鉴定 

结果显示，3C3单抗与人SAMHD1真核表达的蛋白呈阳性反应，并产生绿色荧光信号，对照（一抗为SP2/0上清）无绿色荧光信号（图7）。 

2.8腹水的制备及效价的测定 

采用间接ELISA方法测定杂交瘤细胞3C3腹水的效价为1：409600，明显高于对应细胞上清液的效价1：640。采用Protein G成功对3C3腹水进行纯化，纯化后的浓度为1mg/ml的SAMHD1MAb用于western blot鉴定时的稀释倍数为5000～10000倍。 

2.9单抗特异性分析 

本实验用SAMHD1的全蛋白作为免疫原，制备了效价较高的MAb，抽取的2.5ml腹水纯化后可得到高产量的MAb，而且与人的SAMHD1真核表达蛋白反应性特异，可以用于实验室检测，此单抗不与猴、马SAMHD1的真核表达蛋白反应，且与未转染的293T细胞、马皮细胞、兔肾细胞均无反应，表明其具有良好的特异性。与Abcam公司的SAMHD1抗体相比，本实验室制备的SAMHD1抗体具有高产量的优点，且反应特异，可以用于人SAMHD1的实验室检测（图8）。