一种猪性别控制精子及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种猪性别控制精子及其制备方法和应用，首先用含有精浆、染料木黄酮和牛尿酚的原精稀释液对公猪原精液进行稀释，再用流式细胞分离仪对稀释后的公猪原精液进行分离，最后将分离得到的猪性别控制精子回收到含有精浆、染料木黄酮和牛尿酚的冷冻稀释液中。本发明方法操作简单，能够有效避免猪X、Y精子在分离及冻存过程中受到损伤，从而提高精子的品质和受精能力，并延长精子的存活时间，分离的精子可用于低剂量授精，从而降低生产成本，此方法能够广泛应用于商业推广，具有广阔的市场前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种家畜性别控制精子分离技术，特别是涉及一种猪性别控制精子及其制备方法和应用。

背景技术

动物的性别控制(sex control)技术是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术，其在畜牧生产中具有重要意义。首先，通过控制后代的性别比例，可充分发挥受性别限制的生产性状(如泌乳、产蛋)和受性别影响的生产性状(如生长速度、肉质等)，从而获得最大的经济效益；其次，通过控制后代的性别比例可增加选种强度、加快畜禽育种进程，同时也可提高珍稀动物的繁殖、保种进程，从而挽救濒临灭绝的珍稀动物；通过控制胚胎性别可以及时克服牛胚胎移植中出现的异性双生不育的现象，从而排除伴性有害基因的危害；此外，还可以用于防止性连锁遗传疾病，迅速降低伴性有害基因在群体中的频率。

性别控制的途径有两种，一是在受精之前是通过对精子的体外干预，使在受精之时便决定了后代的性别；二是在受精之后则是通过对胚胎性别进行鉴定，从而获得所需性别的后代。前者是动物性别控制最为有效的途径。在哺乳动物中，每一个体的X精子和Y精子的DNA含量是恒定的，相差多在3.6-4.2%之间，流式细胞分离仪就是利用这种差异，借助特异性染色剂染色，然后根据发出的荧光强度，再通过计算机来预测精子类别。目前这种技术已被广泛应用于奶牛、羊、鹿等性别控制精子的分离。

如授权公告号为CN101347458B的中国发明专利公开了一种羊X/Y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用，其应用羊X、Y精子DNA含量的差异，通过流式细胞方式分离X和Y精子，然后制成性别控制冷冻精液，其冷冻保存条件为-90～-120℃处理20-30分钟。此发明得到的冷冻精液在用于以人工授精方式或胚胎移植方式控制羊产羔的性别时分离效率高，性别控制准确率可达90%以上，适用于产业化生产和养殖，从而大幅度提高养殖效应。

又如公开号为CN101411722A的中国发明专利公开了一种奶牛性别控制冷冻混合精液的生产新技术，其以山羊精液作为基础，加入不同比例的分离X/Y精液来生产奶牛X/Y性别控制冷冻精液。此技术可以使奶牛X/Y性别控制冷冻精液的生产效率提高2-4倍，并且提高了冻精解冻后精子的活力、顶体完整率，延长了冻精解冻后具有授精能力的时间，使母牛的平均情期受胎率达到50%以上，性别控制准确率达到90%以上。

猪的X和Y精子之间DNA含量的差异较小，仅为3.6%，因此不容易被分辨；并且，猪精子在进行分离处理过程中极易受损，例如在分离过程中的稀释、染色、挤压、激光照射等处理都会猪精子造成一定的影响，从而降低精子的品质、受精能力及存活时间；此外，猪精子人工授精需要的数量大、分离所需的时间长、冷冻猪精子在解冻后活力不高（实验室一般情况也仅有40%左右）等因素都导致这种性别控制技术在猪的应用上存在一定的难度。

公开号为CN101613677A的中国发明专利公开了一种分离猪X精子和Y精子的方法，将采集的公猪精液在30℃±2℃的温度下暂时保存后，用精液稀释液按适当比例稀释原精液，然后加入适当浓度的荧光染色剂进行染色，再加入食物色素染色后过滤，随后在20℃～25℃下利用流式细胞仪分离X、Y精子，并用装有精子接收液的接收管收集分离后的X、Y精子，经离心浓缩后可用于保存或授精。利用此方法分离猪精子可提高X、Y精子的分辨率和分离准确率，然而其精子活力仍有待提高，此外该专利并未对分离的精子的冷冻保存以及解冻后精子活力作进一步研究。

由于猪精子对外界温度的突变改变相当敏感，特别是在迅速冷却至0-15℃时极易失去活力，此外解冻后的精子易产生活力丧失、精子膜的选择通透性降低、顶体膜损伤等现象，目前在生产上难以像牛的精液冷冻一样得到普遍地推广应用。授权公告号为CN101869101B的中国发明专利公开了一种猪精液冷冻保存方法，该方法要求精液样品新鲜精液活力≥0.7，冷冻时先配制猪精液冷冻稀释液配方与稀释液，在稀释精液后预冷平衡，再将精液滴冻，最后解冻精液和进行冻后活力检查。此发明虽能较好地保证冻后精子的活力、存活率、质膜完整率、顶体完整率及线粒体活性，然而此冻存方法相对繁琐。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种简单、实用、易于操作的猪性别控制精子及其制备方法和应用，本发明方法能够有效避免猪X、Y精子在分离过程中受到损伤，从而提高精子的品质和受精能力，并延长精子的存活时间，此外分离的精子在进行授精时所需剂量低。

为了达到上述目的，本发明一方面提供一种猪性别控制精子的制备方法，包括如下步骤：

A）用含有精浆、染料木黄酮和牛尿酚的原精稀释液对公猪原精液进行稀释；

B）用流式细胞分离仪对稀释后的公猪原精液进行分离；

C）将分离得到的猪性别控制精子回收到含有精浆、染料木黄酮和牛尿酚的冷冻稀释液中，制得猪性别控制精子。

其中，步骤A）中所述精浆在原精稀释液中的质量百分含量为5-10%，优选为5-8%，进一步优选为5-6%；所述染料木黄酮在原精稀释液中的浓度为10-50μM，优选为20-40μM，进一步优选为30μM；所述牛尿酚在原精稀释液中的浓度为80-120μM，优选为90-110μM，进一步优选为100μM。

其中，步骤C）中所述精浆在冷冻稀释液中的质量百分含量为5-10%，优选为5-8%，进一步优选为6%；所述染料木黄酮在冷冻稀释液中的浓度为10-50μM，优选为20-40μM，进一步优选为30μM；所述牛尿酚在冷冻稀释液中的浓度为80-120μM，优选为90-110μM，进一步优选为100μM。

本发明所述的精浆是精液的无形成分，可通过将动物精液离心去除精子后制得，其中含有大量的糖类、脂类、蛋白质、肽类激素、胺类、有机酸、有机碱以及无机离子等，可为分离的精子提供能量和营养物质，调控精子活力、活率、获能和顶体反应，提供精子生存的微环境，从而减少精子中不同成分的丢失，提高精子膜的完整性，提高受胎率和分娩率；其中所述精浆的来源理论上不受限制，可以来源于猪、牛、羊、鹿等动物，优选来源于猪、牛、羊，进一步优选来源为猪。本发明中染料木黄酮和牛尿酚（Equol,又名马雌酚）作为抗氧化剂，用于抵抗分离及冷冻处理过程中过氧化物对细胞的损伤，从而有利于保护精子DNA的完整性，提高精子的活力和功能。

特别是，在猪精子分离及冷冻过程的稀释液中同时添加精浆、染料木黄酮和牛尿酚相对于单独添加精浆或染料木黄酮和牛尿酚具有更好的效果，能够明显提高猪分离精子的活力并延长分离精子的存活时间；此外，冻存后的猪分离精子仍具有较好的质量和活力，在用于人工授精时所需剂量低，从而节约生产成本。

其中，所述原精稀释液是通过向常规稀释液中添加精浆、染料木黄酮和牛尿酚制得。所述常规稀释液为现有技术，其中大体上包括但不限于选自奶、等渗糖、卵黄、缓冲盐、抗生素中的多种成分，特别是所述常规稀释液选自葡萄糖稀释液、葡萄糖-氨基乙酸稀释液、葡萄糖-柠檬酸钠-乙二胺四乙酸二钠稀释液、葡萄糖-柠檬酸钠-卵黄稀释液中的一种。

其中，所述冷冻稀释液是通过向常规冷冻液中添加精浆、染料木黄酮和牛尿酚制得。所述常规冷冻液为现有技术，其大体上包括但不限于选自糖、蛋白质、脂类、卵黄、缓冲盐、抗生素、冷冻保护剂中的多种成分，如李喜和主编的《家畜性别控制技术》（北京：科学出版社，2009）中公开的冷冻Ⅰ液、冷冻Ⅱ液等。

特别是，所述冷冻稀释液还含有冷冻添加剂，其中所述冷冻添加剂选自甘油、二甲基亚砜（DMSO）、丙二醇、氨基-钠-十二烷基硫酸酯（OEP）、三羟甲基氨基甲烷（TRIS）、安钠咖（CNB）、二丁基羟基甲苯（BHT）中的一种或多种，优选为甘油、OEP、BHT中的一种或多种，进一步优选为甘油。所述冷冻添加剂用于使猪精子抵抗冷冻损伤、提高冻后精子的活力、生存力、质膜与顶体的完整性、存活时间等。

尤其是，所述甘油在冷冻稀释液中的质量百分含量为5-12%，优选为5-8%,进一步优选为5-6%；所述OEP在冷冻稀释液的质量百分含量为0.5-2%，优选为0.8-1.2%,进一步优选为1%；所述BHT在冷冻稀释液的浓度为0.1-1mM，优选为0.2-0.8mM，进一步优选为0.5mM。

本发明的猪性别控制精子采用流式细胞分离仪进行制备，其方法为本领域常规方法，具体包括如下步骤：

a）取公猪原精液，用含有精浆、染料木黄酮和牛尿酚的原精稀释液进行稀释后，加入荧光染色剂进行染色，制得待分离精液；

b）采用流式细胞分离仪对所述待分离精液进行分离；

c）将分离得到的猪性别控制精子回收到含有精浆、染料木黄酮和牛尿酚的冷冻稀释液中，制得猪性别控制精子。

其中，步骤a）中所述公猪原精液的精子活力≥80%；所述缓冲稀释液中精浆的质量百分含量为5-10%，染料木黄酮的浓度为10-50μM，牛尿酚的浓度为80-120μM；所述荧光染色剂为Hoechst33342，其在待分离精液中的浓度为50-120μg/ml，优选为80-100μg/ml；所述染色的温度为25-37℃，染色时间为30-60min；所述待分离精液中精子浓度为100-200×10⁶精子/ml。

特别是，步骤a）中，在制得待分离精液前向染色的公猪原精液中加入食品红，以减弱死精子上的荧光，从而提高分离精子的活力；所述食品红在待分离精液中的浓度为25-50μM。

其中，步骤c）中所述猪性别控制精子是将公猪原精液进行性别分离后得到的单一性别的精子（即X精子和Y精子）。

特别是，还包括步骤D）：对所述猪性别控制精子进行冷冻保存。所述冷冻保存为现有技术中的常规方法，如颗粒法、细管法和塑料袋法，优选为细管法。

尤其是，所述冷冻保存具体包括：

D1）将所述猪性别控制精子离心后，用冷冻稀释液A进行稀释，将稀释后的猪性别控制精子缓慢降温并且平衡一段时间；

D2）在冷冻稀释液A平衡后加入冷冻稀释液B，平衡一段时间后进行分装、冷冻及液氮保存。

其中，所述冷冻稀释液A为无甘油的常规冷冻液，此外额外添加有精浆、染料木黄酮和牛尿酚；特别是，所述冷冻稀释液A中精浆的质量百分含量为5-10%，染料木黄酮的浓度为10-50μM，牛尿酚的浓度为80-120μM。

其中，所述冷冻稀释液B为添加甘油的常规冷冻液，并且额外添加有精浆、染料木黄酮和牛尿酚；特别是，所述冷冻稀释液B中精浆的质量百分含量为5-10%，染料木黄酮的浓度为10-50μM，牛尿酚的浓度为80-120μM，甘油的质量百分含量为5-12%,优选为6%。

特别是，步骤C1）中所述离心是在10-20℃下于800g离心10-20min，所述降温为降温至4-5℃,并且在4-5℃下平衡30-120min；步骤C2）中所述平衡是在4-5℃下平衡30-120min。

本发明另一方面提供一种上述方法制备得到的猪性别控制精子。

本发明再一方面提供一种猪性别控制精子在人工授精上的应用，特别是所述猪性别控制精子在进行人工授精时的剂量为50-200万精子/只，优选为100万精子/只。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明的方法能够有效避免猪X、Y精子在分离过程中受到损伤，从而提高猪性别控制精子的品质和受精能力，并延长性别控制精子的存活时间；

2、本发明的方法能够有效避免猪性别控制精子在冷冻过程中受到损伤，从而提高猪精子在冻存及解冻后的活力及存活时间；

3、本发明方法操作简单，实用性强，制备的猪性别控制精子可用于低剂量人工授精，从而降低生产成本，具有广阔的市场前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

一、配制溶液

1、原精稀释液

称取葡萄糖5.0g、柠檬酸钠0.3g、乙二胺四乙酸二钠0.1g、染料木黄酮0.81mg（30μM）、牛尿酚2.42mg（100μM）、精浆6.0g（将新鲜的公猪精液于1600r/min离心后的上清液）溶于100毫升蒸馏水中，在使用前加入青霉素12万国际单位，链霉素0.15微克，即制得原精稀释液（即在葡萄糖-柠檬酸钠-乙二胺四乙酸二钠稀释液中添加染料木黄酮、牛尿酚及精浆）；

2、冷冻稀释液A

向原精稀释液中添加20%（体积含量）的卵黄，用磁力搅拌器充分搅拌均匀，经离心、取上清过滤处理后，制得冷冻稀释液A；

3、冷冻稀释液B

向上述冷冻稀释液A中加入甘油至甘油的终质量百分含量为6%，即制得冷冻稀释液B；

二、制备猪性别控制精子

从一只健康的公猪采集新鲜精液2mL，用荧光显微镜检测其活力为90%；用上述制备的室温（28℃）平衡的原精稀释液将上述新鲜精液稀释至200×10⁶精子/ml，然后加入浓度为10mg/mL的荧光染色剂Hoechst33342至终浓度为80μg/ml，混合均匀，在28℃水浴中染色30min；染色结束后，用含有50μM食品红的上述原精稀释液进一步稀释至100×10⁶精子/ml，制得待分离精液；

采用SX-MoFlo流式细胞分离仪对上述待分离精液进行分离和回收，将分离后的猪性别控制精子分别收集于上述冷冻稀释液A中，将收集的猪性别控制精子在800g下离心10min，弃去上清，再用上述冷冻稀释液A重新悬浮沉淀，即制得猪性别控制精子（X精子和Y精子）；

将制得的猪性别控制精子（X精子）在28℃下用荧光显微镜检测精子活力，重复测定六次，猪X精子的平均活力为68.2%；

三、冷冻保存

将制备的猪性别控制精子在室温（28℃）下平衡1.5h后，移入15℃条件下降温平衡3h，然后在15℃下于800g离心10min，再加入上述冷冻稀释液A，缓慢降温至5℃，平衡2h后，再加入5℃的上述冷冻稀释液B，并于5℃分装于0.25mL细管中，制成100万精子的猪性别控制精液，随后进行冷冻及液氮保存；

将液氮保存三个月的装有猪X精子的细管取出后进行解冻（37℃,20s），之后平衡至室温（28℃）并测定精子活力，共取出六管进行测定，冻存后猪X精子的平均活力为42.6%；

四、人工授精

取冻存三个月后的猪X精子以常规方法对20头母猪进行人工授精，每只母猪一次使用100万X精子，人工授精结果见表1。

实施例2

一、配制溶液

1、原精稀释液

称取葡萄糖5.0g、柠檬酸钠0.3g、乙二胺四乙酸二钠0.1g、染料木黄酮0.54mg（20μM）、牛尿酚2.66mg（110μM）、精浆7.0g（将新鲜的公猪精液于1600r/min离心后的上清液）溶于100毫升蒸馏水中，在使用前加入青霉素12万国际单位，链霉素0.15微克，即制得原精稀释液；

2、冷冻稀释液

向上述原精稀释液中加入甘油至甘油的终质量百分含量为8%，即制得冷冻稀释液；

二、制备猪性别控制精子

从一只健康的公猪采集新鲜精液2mL，用荧光显微镜检测其活力为90%；用上述制备的室温（25℃）平衡的原精稀释液将上述新鲜精液稀释至400×10⁶精子/ml，然后加入浓度为10mg/mL的荧光染色剂Hoechst33342至终浓度为100μg/ml，混合均匀，在25℃水浴中染色30min；染色结束后，用含有80μM食品红的上述原精稀释液进一步稀释至200×10⁶精子/ml，制得待分离精液；

采用SX-MoFlo流式细胞分离仪对上述待分离精液进行分离和回收，将分离后的猪性别控制精子分别收集于上述冷冻稀释液中，将收集的猪性别控制精子在800g下离心10min，弃去上清，用上述冷冻稀释液重新悬浮沉淀，即制得猪性别控制精子（X精子和Y精子）；

将制得的猪性别控制精子（X精子）在25℃下用荧光显微镜检测精子活力，重复测定六次，猪X精子的平均活力为65.9%；

三、冷冻保存

将制备的猪性别控制精子在4℃条件下分装于0.25mL细管中，制成200万精子的猪性别控制精液，然后置入-90℃的氮蒸汽中处理60分钟，然后投入液氮中保存；

将液氮保存三个月后的细管取出，并进行解冻（37℃,20s），之后平衡至室温（25℃），共取出六管进行测定，冻存后猪X精子的平均活力为41.3%；

四、人工授精

取冻存三个月后的猪X精子以常规方法对20头母猪进行人工授精，每只母猪一次使用100万X精子，人工授精结果见表1。

实施例3

一、配制溶液

1、原精稀释液

称取葡萄糖5.0g、柠檬酸钠0.5g、染料木黄酮1.35mg（50μM）、牛尿酚1.94mg（80μM）、精浆7.5g（将新鲜的公牛精液于1600r/min离心后的上清液）溶于100毫升蒸馏水中，在使用前加入青霉素8万国际单位，卵黄5毫升，即制得原精稀释液；（即在葡萄糖-柠檬酸钠-卵黄稀释液中添加染料木黄酮、牛尿酚及精浆）

2、冷冻稀释液

向上述原精稀释液中加入甘油和BHT，至甘油的终质量百分含量为8%、BHT的终浓度为0.5mM，即制得冷冻稀释液；

二、制备猪性别控制精子

从一只健康的公猪采集新鲜精液2mL，用荧光显微镜检测其活力为85%；用上述制备的室温（32℃）平衡的原精稀释液将上述新鲜精液稀释至300×10⁶精子/ml，然后加入浓度为10mg/mL的荧光染色剂Hoechst33342至终浓度为100μg/ml，混合均匀，在32℃水浴中染色30min；染色结束后，用含有100μM食品红的上述原精稀释液进一步稀释至150×10⁶精子/ml，制得待分离精液；

采用SX-MoFlo流式细胞分离仪对上述待分离精液进行分离和回收，将分离后的猪性别控制精子分别收集于上述冷冻稀释液中，将收集的猪性别控制精子在800g下离心10min，弃去上清，用上述冷冻稀释液重新悬浮沉淀，即制得猪性别控制精子（X精子和Y精子）；

将制得的猪性别控制精子（Y精子）在32℃下用荧光显微镜检测精子活力，重复测定六次，猪Y精子的平均活力为63.8%；

三、冷冻保存

将制备的猪性别控制精子在5℃条件下分装于0.25mL细管中，制成100万精子的猪性别控制精液；

准备好程序冷冻仪，注入液氮并将起始温度设在5℃，移入装有猪性别控制精子的细管，开启程序降温冷冻，先以6℃/分钟的速度降温至-10℃,恒温停留2分钟，然后以6℃/分钟的速度降温，至达到-80℃时终止，将细管投入液氮中进行保存；

将液氮保存三个月后的细管取出，并进行解冻（37℃,20s），之后平衡至室温（32℃），共取出六管进行测定，冻存后猪Y精子的平均活力为40.2%；

四、人工授精

取冻存三个月后的猪Y精子以常规方法对20头母猪进行人工授精，每只母猪一次使用200万Y精子，人工授精结果见表1。

实施例4

原精稀释液和冷冻稀释液A同实施例1；

向冷冻稀释液A中加入甘油和OEP，其中甘油在冷冻稀释液A中的终质量百分含量为6%，OEP在冷冻稀释液A中的终质量百分含量为1%，即制得冷冻稀释液B；

制备猪性别控制精子及冷冻保存方法同实施例1，分离后的猪X精子的平均活力为68.5%，冷冻保存的猪X精子的平均活力为42.8%；

取冻存三个月后的猪X精子以常规方法对20头母猪进行人工授精，每只母猪一次使用50万X精子，人工授精结果见表1。

对照例1

除配制溶液步骤中，在配制原精稀释液及冷冻稀释液A时不额外添加精浆、染料木黄酮和牛尿酚外，其余均与实施例1相同，分离后的猪X精子的平均活力为49.6%，冻存三个月后猪X精子的平均活力为30.8%，冻存三个月后猪X精子人工授精结果见表1。

对照例2

除配制溶液步骤中，在配制原精稀释液及冷冻稀释液A时仅额外添加精浆6.0g外，其余均与实施例1相同，分离后的猪X精子的平均活力为55.4%，冻存三个月后猪X精子的平均活力为34.0%，冻存三个月后猪X精子人工授精结果见表1。

对照例3

除配制溶液步骤中，在配制原精稀释液及冷冻稀释液A时仅额外添加染料木黄酮（30μM）和牛尿酚（100μM）外，其余均与实施例1相同，分离后的猪X精子的平均活力为53.1%，冻存三个月猪X精子的平均活力为32.7%，冻存三个月后猪X精子人工授精结果见表1。

表1冻存三个月后的猪性别控制精子进行人工授精的结果

在本发明猪性别控制精子制备过程中的原精稀释液和冷冻稀释液中同时添加精浆、染料木黄酮和牛尿酚，能够有效避免猪X、Y精子在分离及冻存过程中受到损伤，猪分离精子活力高、品质好、保存时间长、受精能力强，此外在用于人工授精时所需剂量低，特别是相对于仅添加精浆或染料木黄酮和牛尿酚具有更高的分离活力、冻存活力、受胎率，平均窝产仔数高，性别控制准确率好，能够较为广泛应用于商业推广，具有广阔的市场前景。