一种橡胶树水通道蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了橡胶树水通道蛋白及其编码基因与应用。该基因的cDNA序列长为1462 bp，具有序列表中SEQ ID NO: 2的序列，命名为HbPIP2;3，HbPIP2;3编码285个氨基酸，具有序列表中SEQ ID NO: 1的序列，分子量为30.34 kDa，等电点为9.18，带电荷数为-6.81，碱性蛋白。HbPIP2;3具有水孔通道蛋白的功能，将其编码基因或经过一个或几个碱基对的替代和/或插入和/或缺失而获得的功能性衍生基因转入其它动植物中过量表达可提高水分转运效率；通过割胶和乙烯利刺激等措施诱导该基因在橡胶树树皮和胶乳中的表达，可以稀释胶乳、延长排胶时间，进而提高胶乳产量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种水通道蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及来源于橡胶树的水通道蛋白HbPIP2;3及其编码基因与应用。

背景技术

天然橡胶(顺-1,4-聚异戊二烯)是一种重要的工业原料，其主要来源为巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)。橡胶属于一种叫做乳管细胞的细胞质成分，它在细胞受到伤害后以胶乳的形式被排出。生产上，就通过用胶刀周期性地切割橡胶树的树皮而获得。橡胶树原产于南美洲亚马逊河流域的热带雨林，性喜气温较高、湿度较大、降水丰沛且分布均匀的气候环境。橡胶树的枝、叶、根组织的含水量约为全植株的50%左右，幼龄组织的含水量显著高于老化组织，胶乳中的含水量一般为60～75%。只有具有充分的水分条件，才能保证橡胶树正常的生长及产胶与排胶。适宜橡胶树生长和产胶的年降水量以1500 mm以上为宜。然而，随着全球气候变化的影响和橡胶树种植向次适宜区的扩展，干旱和季节性旱害已成为影响天然橡胶生产的重要因素。大面积的严重旱害基本每年均会在中国、泰国及印尼等主要植胶国发生。另外，橡胶树割胶的胶乳产量由它的产胶能力与排胶能力共同决定。排胶能力包括胶乳的排出速度和排胶时间两个方面。在排胶过程中，排胶速度与排胶时间（1）与由胶乳总固形物含量（或相反的水分含量）决定的胶乳的粘度成反比；（2）与包括内部乳管、排水作用区、排胶替换区在内的乳管附近韧皮部组织初始膨压成正比，因此，韧皮部乳管系统的水分运输与平衡在橡胶树排胶过程中具有重要作用。而在产胶过程中，因橡胶树胶乳中含有60-75%的水分，胶乳再生的过程必然涉及到水分的补给。另外，因橡胶树属于典型的热带雨林树种，其生长和光合产物的积累分配过程也对水分非常敏感。因此，系统研究橡胶树体内的水分传输和平衡关系，弄清橡胶树的抗旱机理、选育橡胶树抗旱品种、对天然橡胶的产量提高和产业的可持续发展非常重要。

在植物适应水分胁迫的过程中，水分的跨细胞运输是其主要途径。而这种水分传输必须通过质膜和液泡膜上专一、高效的水分跨膜双向通道——水通道蛋白（Aquaporin）介导。根据其氨基酸序列同源性及蛋白的亚细胞定位，植物的水通道蛋白可以划分质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic protein, PIP)、液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins, TIP)、类Nod26膜内在蛋白(nodulin26-like intrinsic proteins, NIP)、小分子碱性膜内在蛋白(small and basic intrinsic proteins, SIP)、类GlpF膜内在蛋白(GlpF-like intrinsic proteins, GIP)以及HIP (hybrid intrinsic proteins, HIP)和XIP(X intrinsic proteins, XIP) 7类，其中以PIP最受关注。拟南芥、玉米，水稻、烟草等植物中的研究表明，水通道蛋白与细胞膜的透水能力、干旱条件下的植物生理生化反应等密切相关。

    橡胶树中，最近，Tungngoen等从无性系PB217中克隆到HbTIP1;1、HbPIP1;1和HbPIP2;1三个水通道蛋白基因，研究表明HbPIP2;1、HbTIP1;1在乙烯利刺激橡胶树增产的机理中起着重要作用。由于植物中的水通道蛋白多为多基因家族编码，如拟南芥（Arabidopis thaliana）、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)中分别含有35、36和33个家族成员，进一步分离和鉴定橡胶树中与产排胶关系密切的水通道蛋白显得非常必要。为此，我们通过对橡胶树的胶乳进行全转录组测序，经过深入研究，发现了本发明中涉及到的在胶乳中高丰度表达且显著受乙烯利刺激调控的HbPIP2;3。

发明内容

本发明的目的是提供了一种新的橡胶树水通道蛋白及其编码基因与应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供橡胶树水通道蛋白，最初来自于大戟科橡胶树属巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)，名称为HbPIP2;3，是如下(1)或(2)的蛋白质：

(1) 由序列表中SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成的蛋白质，其分子量为30.34 kDa，等电点约为9.18，带电荷数约为-6.81，碱性蛋白。

(2) 由序列表中SEQ ID NO: 1的序列经过一个或几个氨基酸残基的替代和/或插入和/或缺失且具有水通道蛋白活性的衍生蛋白质。

序列表中SEQ ID NO: 1的序列由285个氨基酸残基组成。

所述一个或几个氨基酸残基的替代和/或插入和/或缺失是指不超过10个氨基酸残基的替代和/或插入和/或缺失。

上述(1)中的HbPIP2;3蛋白可从巴西橡胶树的胶乳、树皮、芽、叶片、根等组织或细胞中分离、纯化，优先推荐割胶获得的胶乳；同时也可从利用HbPIP2;3的编码基因获得的转基因材料中分离、纯化。

上述(2)中的HbPIP2;3可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到；所述的编码基因是指通过一个或几个碱基的替代和/或插入和/或缺失获得的且其编码蛋白质具有水通道蛋白活性的衍生基因。

所述HbPIP2;3的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述HbPIP2;3的编码基因为如下(1)、(2)或(3)的核苷酸序列：

(1) 序列表中SEQ ID NO: 2的核苷酸序列；

(2) 由序列表中SEQ ID NO: 2的核苷酸序列经过一个或几个碱基对的替代和/或插入和/或缺失而获得且其编码蛋白质具有水通道蛋白活性的衍生基因；

(3) 基因编码区序列与序列表中SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的相似性在90%以上且其编码蛋白质具有水通道蛋白活性的基因。

序列表中SEQ ID NO: 2由1462个核苷酸组成。

含有所述水通道蛋白编码基因的表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植株或转基因重组菌均属本发明的保护范围。  

对本发明HbPIP2;3基因编码区序列的进一步研究表明，该基因具有水通道蛋白的功能，其活性可被机械损伤、割胶、外源乙烯、水分胁迫等条件调节。该蛋白至少存在于胶乳、树皮、芽、叶片及根中。该蛋白或经过一个或几个氨基酸残基的替代和/或插入和/或缺失且具有水通道蛋白活性的衍生蛋白至少可用于植物生物工程领域；利用该基因的部分或全部序列反义表达或对其活性进行调节至少可促进橡胶树体内的水分运输，因此能够减小胶乳粘度、增加胶乳的可流动性、延长橡胶树的排胶时间、提高橡胶产量；利用该基因或经过一个或几个碱基对的替代和/或插入和/或缺失而获得的功能性衍生基因过量表达至少可提高橡胶树的抗旱能力。

附图说明

图1： 图1A为本发明的HbPIP2;3与蓖麻、杨树、葡萄、玉米、拟南芥及其它橡胶树水通道蛋白HbPIP1、HbPIP2、HbPIP1;1 HbPIP2;1 HbTIP1;1 HbPIP2;2 HbPIP1;2的蛋白质同源性序列比对， 图1B显示了他们的蛋白质进化关系；

图2：显示了本发明的HbPIP2;3在爪蟾卵母细胞中表达后引起的细胞体积随时间的变化（图2A）及卵母细胞水导度（Pf， 图2B）的增加，其中HbPIP2;1为阳性对照，H₂O为阴性对照；

图3：为本发明的HbPIP2;3在橡胶树胶乳和不同组织中的表达量变化

图4：为未开割树割胶前6刀HbPIP2;3的表达差异变化（图4A）及其与胶乳总固形物含量（图4B）和产量（图4C）的变化；

图5：为乙烯利刺激导致的HbPIP2;3表达量变化（图5A）及胶乳总固形物（图5B）和胶乳产量（图5C）的变化；

图6：在PCR仪上用如下扩增程序进行PCR反应图；

具体实施方式

以下实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1   水通道蛋白HbPIP2;3 cDNA序列的克隆

前期我们根据其它植物中水通道蛋白的保守氨基酸序列设计简并引物，利用RT-PCR和RACE技术，从橡胶树无性系热研7-33-97中克隆到4个水通道蛋白基因的全长cDNA，分别命名为：HbPIP1、HbPIP1;2、HbPIP2和HbPIP2;2；同时，泰国学者Tungngoen¹⁰等也从无性系PB217中克隆到HbPIP1;1、HbPIP2;1 和HbTIP1;1 3个橡胶树水通道蛋白基因；最近，印度学者Saha等在NCBI也公布了一个橡胶树水通道蛋白基因HbPIP1（accession no.JQ037842，经比对，其与HbPIP1;1为同一个水通道蛋白基因）。为系统地分离和鉴定乳管表达的水通道蛋白基因，我们对橡胶树的胶乳进行了全转录组测序，从中我们发现一个新的其中水通道蛋白基因的表达丰度特别高，且受乙烯利显著诱导，推测其可能在橡胶树产排胶和水分传输中起着重要作用。为此我们根据序列信息设计引物：

PIP2;3-F: 5ˊ - ATGGTGAAGGACGTGACAG-3ˊPIP2;

3-R: 5ˊ- AACAGTTGGGTTGCTCCTG-3ˊ

利用PR107胶乳cDNA（通过利用Takara 公司的RevertAid^TMM-MuLV Reverse Transcriptase反转录胶乳总RNA获得）为模板，按照如下反应体系配制PCR反应物。

 

   混匀后，在PCR仪上用如下扩增程序进行PCR反应：如图6所示。

然后在反应体系中加入0.5μL dNTPs和0.3μLTaqDNA聚合酶，混匀后于72℃放置30min进行加尾反应。

将得到的PCR产物进行电泳检测和回收，得到一个约850bp的cDNA片段，将其与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，经酶切和PCR鉴定后进行测序，将测序结果在NCBI进行同源搜索，结果显示其与木薯、蓖麻、胡桃、水稻和拟南芥等植物的水通道蛋白基因有着较高的相似性（80%以上），初步确定获得了橡胶树PR107水通道蛋白基因家族的一个新成员的全长cDNA，并命名为HbPIP2;3。

实例二：HbPIP2;3在爪蟾卵母细胞中的功能鉴定

利用如下引物扩增HbPIP2;3编码区序列并在其两端加入Bgl 酶切位点。

PIP2;3-F: GTACAGATCTATGGTGAAGGACGTGACAGAAC

PIP2;3-R: GTACAGATCTTTAAACAGTTGGGTTGCTCCTG

   用Bgl酶切回收后将其连接到以相同酶酶切回收的爪蟾卵母细胞表达载体pXβG-ev1上。对构建好的载体经PCR和测序验证无误后，提取质粒进行线性化，然后利用Ambion公司的mMESSEGEmMACHINE  T3 体外转录试剂盒进行体外转录得到加帽的HbPIP2;3的cRNA（具体操作详见使用说明书）。使用RNase free water将cRNA稀释到1 ug/uL用于显微注射。

     抓取成年爪蟾一只，用碎冰冰冻使其失去知觉后，在下腹部开一约1cm的小口，用镊子取足量的卵母细胞于含有2mg/mL胶原酶的改良Bath溶液(NaCl 88mM，KCl 1mM，CaCl₂  0.41 mM，Ca(NO₃)₂ 0.33mM， MgSO₄  0.83mM，NaHCO₃ 2.4mM，HEPES 10mM，青霉素 10ug/mL, 链霉素 10ug/mL，pH 7.4)中， 20℃下在振荡器上酶解2~4h以除去卵母细胞外的滤泡膜，然后用Bath溶液清洗3-4次后分离出V期和Ⅵ卵母细胞用于显微注射试验。

按照显微注射仪(PV820，WPI，USA)的操作步骤，用毛细管针头为每个细胞注射等量的50nL溶液（即50ng的cRNA或RNase free water），然后将其在20℃下温育24h。温育完成后将温育过的卵母细胞去除坏死细胞，从全Barth溶液（≈200mOSM， OSMin）培养皿移置于装有稀释5倍的Barth溶液（≈40mOSM，OSMout）的细胞培养板中，立即在摄影显微镜（SZX16，Olympus，Japan）下拍照，测定时的环境温度为20℃，每20秒捕捉一张细胞体积变化的图片，测定5min或直至细胞胀裂。同样实验重复至少三次。拍摄的照片在图像处理软件ImageJ2X中处理，以获得细胞体积的大小，然后以照片拍摄时间为横轴、卵母细胞体积为纵轴作图，根据曲线获得卵母细胞的膨胀率并代入如下公式计算注射后的细胞水导度(Pf)。 

Pf=V0×[d(V/V0)/dt]/[S×Vw×(Osmin –Osmout)

其中Pf为水分传输导度，V0是细胞初始体积，V为细胞膨胀后的体积，S为细胞初始表面积，Vw是水的摩尔体积（18cm³/mol），Osmin 和Osmout分别是细胞内外的渗透势约为200 Osm和40 Osm。

结果如图2所示，可见本发明的橡胶树水通道蛋白在爪蟾卵母细胞中表达后可引起卵母细胞导水性的增强，细胞水导度(Pf)与阳性对照HbPIP2;1相当，为阴性对照H₂O的5倍。这表明，本发明的基因所编码的蛋白确实具有水通道蛋白的功能。

实例三：HbPIP2;3基因在橡胶树不同组织中的表达分析

采集1年龄热研7-33-97袋装组培苗胶乳、树皮、木质部、根、芽、不同时期（古铜期、变色期、稳定期、衰老期）叶片和叶柄，提取RNA，利用荧光定量RT-PCR法分析HbPIP2;3在不同组织中的表达，所用引物为:

正向:5'-CGTTGGATTGGGTGCCGAGAT-3';

反向:5'-CCAGGGCTTGTCCTGATTGTA-3'。

反应体系为10 μL, 其中包含 1 μL cDNA模板、 5 μL 5×SYBR Premix 、0.3 μL (正向反向个0.15 μL) 引物和3.7 μL ddH₂O。反应条件为95℃变性30 s, 40 个循环的95℃下5 s 和60 ℃下30 s 的扩增，及60℃下延伸30 s。所用的内参基因为YLS8，正反向引物序列为:

5’- GGGCTCTCAAGGACAAGCAA-3’;

5’-GGAGCAATAACCAAACCACGA-3’。

    检测结果如图3，可见本发明的基因在检测的组织中均有表达，相对而言，该基因在胶乳中的表达丰度特别高，是树皮等其它组织中的200多倍，说明该基因可能与橡胶树乳管系统的水分平衡密切相关。

实例四：HbPIP2;3与橡胶树胶乳含水量及产量关系的验证

1、  割胶对HbPIP2;3表达的影响及其与胶乳总固形物含量和干胶产量的关系

    一般橡胶树刚开割前几刀胶乳产量会随割次逐步增加，并在此后基本稳定。这种胶乳产量的提高可能与水通道蛋白基因的表达调控有关。

选取7年生未开割热研7-33-97橡胶树为研究对象，采集割胶前6刀割下的树皮及0-45 min流出的胶乳（弃前10滴）于液氮中带回实验室，按照实例三相同的步骤提取RNA并进行HbPIP2;3的表达分析。结果表明，本发明的基因HbPIP2;3与胶乳产量的提高和总固形物的降低有一定关联，割胶可以使HbPIP2;3在胶乳和树皮中的表达上调（图4A），促进水分向乳管系统的运输和胶乳的稀释（即总固形物的降低，图4B），进而提高胶乳产量（图4C）。

 

2、         乙烯利刺激对HbPIP2;3基因表达的影响及其与胶乳总固形物和干胶产量的关系

因施用乙烯利能增加单次胶乳产量、减小割胶频率、提高劳动生产效益，乙烯利刺激已作为一种常规技术在天然橡胶生产中广泛使用。乙烯利刺激增产的同时常伴随着胶乳的稀释，这可能与植物体内水分的专一运输通道——AQP基因的表达变化有关。为了探讨乙烯利刺激对本发明的水通道蛋白基因表达的影响，选取直径相当、产胶正常的4割龄成年PR107橡胶树24株，分成6组分别在拟割胶采样的前3 h、6 h、12 h、24 h和48 h在不同处理橡胶树割线上的2 cm范围内施用约1 g的2.5%乙烯利（溶于1%的羧甲基纤维素钠）、0 h对照树则是按同样方法在割胶24 h前施用约1 g的1%羧甲基纤维素钠。然后收集割胶时割下的树皮和前45 min的胶乳（弃前10滴），保存于液氮中立即带回实验室提取总RNA，并按与实例三相同的方法分析乙烯利刺激（ET）不同时间后HbPIP2;3的表达量变化。结果表明，乙烯利刺激能够显著促进橡胶树HbPIP2;3在胶乳和树皮中的表达（图5A），进而降低胶乳总固形物含量（图5B）、提高胶乳产量（图5C）。然而，乙烯利刺激后HbPIP2;3在胶乳和树皮中的表达峰值并非与胶乳产量和总固形物含量的最值同步，这主要由于植物在基因表达水平上的变化一般优先于生理生化变化，水分进入乳管系统也会调动渗透调节及胶乳代谢合成等生理过程引起。这并不与“本发明的水通道蛋白HbPIP2;3基因的表达可以促进水分进入橡胶树乳管系统、降低胶乳总固形物含量（或相反的提高胶乳含水量），进而提高胶乳的可流动性、增加胶乳产量”这一结论相悖。

图1A为本发明的HbPIP2;3与蓖麻、杨树、葡萄、玉米、拟南芥及其它橡胶树水通道蛋白HbPIP1、HbPIP2、HbPIP1;1 HbPIP2;1 HbTIP1;1 HbPIP2;2 HbPIP1;2的蛋白质同源性序列比对， 图1B显示了他们的蛋白质进化关系；

图2A显示了本发明的HbPIP2;3在爪蟾卵母细胞中表达后引起的细胞体积随时间的变化及卵母细胞水导度（Pf， 图2B）的增加，其中HbPIP2;1为阳性对照，H₂O为阴性对照；

图3为本发明的HbPIP2;3在橡胶树胶乳和不同组织中的表达量变化

图4A为未开割树割胶前6刀HbPIP2;3的表达差异变化，其与胶乳总固形物含量（图4B）和产量（图4C）的变化；

图5A为乙烯利刺激导致的HbPIP2;3表达量变化，及胶乳总固形物（图5B）和胶乳产量（图5C）的变化；

 以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。