高分子微球的制备方法及根据该方法制备的高分子微球

摘要

本发明涉及高分子微球的制备方法及根据该方法制备的高分子微球，尤其涉及包括：混合水不溶性有机溶剂与分散溶剂的步骤；混合高分子化合物、药物及与所述水不溶性有机溶剂相同的水不溶性有机溶剂制成分散相的步骤；把分散相混合于混合了水不溶性有机溶剂的分散溶剂而制备乳剂的步骤；以及在制备的乳剂中添加碱或酸而从乳剂中去除水不溶性有机溶剂的步骤的高分子微球的制备方法、根据该方法制备的高分子微球及包括所述高分子微球的药物传递用组合物。本发明提供利用碱或酸从乳剂中去除水不溶性有机溶剂的新的高分子微球的制备方法、根据所述制备方法制备的高分子微球及包括所述高分子微球的药物传递用组合物。因此，本发明的制备方法不同于原有的溶剂蒸发或溶剂萃取工序，能够用于使用少量的水便使废水的发生实现最小化，并在短时间内简便地制备目标的含药物高分子微球。

说明书

技术领域

本发明涉及高分子微球的制备方法及根据该方法制备的高分子微球，尤其涉及包括：混 合水不溶性有机溶剂与分散溶剂的步骤；混合高分子化合物、药物及水不溶性有机溶剂制成 分散相的步骤；把分散相混合于混合有水不溶性有机溶剂的分散溶剂而制备乳剂的步骤；以 及在制备的乳剂中添加碱或酸而从乳剂中去除水不溶性有机溶剂的步骤的高分子微球的制备 方法、根据该方法制备的高分子微球以及包含所述微球的药物传递用组合物。

背景技术

诸如输液剂、悬浊剂及乳剂的以往注射剂型在肌肉或皮下给药后很快被从体内清除， 因而在治疗慢性疾病时，必须频繁注射给药。为解决这种问题而研发的微囊化 (microencapsulation)，是指使药物封入由高分子化合物构成的微球(microsphere，在以 下叙述中，微球包括超微球(nanosphere))剂型的制备工序，微球一般具有μm单位的大小， 因而能够通过肌肉或皮下注射对人体或动物给药，可以制备成具有多种多样的药物释放速 度，可以控制药物传递期间。因此，只需一次给药，便能够长时间保持有效的治疗药物浓 度，能够使治疗所需的药物总给药量实现最小化，能够提高患者的药物治疗依从性，目前 全世界屈指可数的制药公司对含药物高分子微球制备报以极大关注。

通过微囊化制备高分子微球时，聚乳酸-羟基乙酸共聚物

(poly-d,l-lactideco-glycolide,PLGA)被广泛用作高分子化合物。PLGA是在生物体内水 解，转换成无毒性的乳酸(lactic acid)与羟基乙酸(glycolic acid)的生物体亲和性高分 子化合物。因此，制药行业为开发使用PLGA的医药品剂型投入大量努力，作为以现在市销 的PLGA制造的微球制品的示例，有利培酮注射剂(Risperdal Consta)、善宁(Sandostatin) LAR、纳曲酮缓释剂(Vivitrol)以及醋酸亮丙瑞林预充注射剂(Lupron Depot)等。这些制品 对患者注射给药1次，把利培酮(risperidone)、醋酸奥曲肽(octreotide acetate)、纳曲 酮(naltrexone)及醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)的释放从2周调节至4个月。

这种含药物高分子微球，通常根据使用诸如二氯甲烷及乙酸乙酯的有机溶剂的溶液蒸 发法或溶剂萃取法制备。

首先，对溶液蒸发法进行简要说明(参照美国专利第6,471,996号、第5,985,309号及 第5,271,945)，把药物分散或溶解于溶解有高分子化合物的有机溶剂相后，使得在诸如水 的分散介质中乳化，制备水包油型(O/W,oil-in-water)乳剂后，使乳剂中的有机溶剂扩散 到分散介质，通过空气/水介面，使有机溶剂蒸发，从而形成含药物高分子微球。此时，为 促进有机溶剂向分散介质的扩散，利用减压、升温、使用过量水的有机溶剂萃取等工艺。 这是因为，为溶解PLGA高分子化合物而一般使用的分散有机溶剂为二氯甲烷，该二氯甲烷 能够良好地溶解具有多种分子量和丙交酯：乙交酯比的PLGA共聚体，水溶解度较低，为1.32 重量%，与水混合不良，因而适合于制备水包油形态的乳剂。而且，由于39.8℃的较低沸点， 从乳剂液珠扩散到水中的少量的二氯甲烷分子通过水与空气界面而良好地蒸发。这种过程 持续反复后，二氯甲烷被从乳剂珠中去除，制成微球。最后，得益于较低的沸点，具有干 燥去除微球中存在的残留二氯甲烷非常容易的优点。

如上所述，尽管二氯甲烷具有强挥发性，与水混合不良，具有远低于水的沸点等，是 制备乳剂的最佳有机溶剂，但却具有如下严重问题：(a)是通过实验确认的致癌物质；(b) 破坏大气的臭氧层，引起环境毒性，结果导致人体皮肤癌发病增加；(c)属于美国福利部下 属的美国毒物和疾病登记署(Agency for Toxic Substances and Disease Registry)规定 的最危险的38种毒性有害物质之一；(d)水溶解度低，约为1.32重量%，二氯甲烷使用总 量中只有极少部分溶解于水并蒸发，因而如要完全去除乳剂珠中的二氯甲烷，需要相当长 的时长。例如，在美国专利第6,884,435号中，为从乳剂中去除二氯甲烷而彻夜搅拌乳剂， 为缩短微球制备时间，使反应器(reactor)的温度上升或导入减压条件(参照美国专利第 3,691,090号、第3,891,570号、第6,270,700号及第6,572,894号)。

另一方面，用于制备含药物高分子微球的溶剂萃取法，是使用大量的增溶剂来有效萃 取乳剂珠中的有机溶剂的方法。有机溶剂被从乳剂珠萃取后，原来溶解的高分子化合物硬 化，乳剂珠转换成微球。一般使用的增溶剂是水，有机溶剂的水溶解度的程度对所需的水 量产生很大影响。例如，就二氯甲烷而言，由于水溶解度为1.32重量%，必须使用大量的 水，才能萃取乳剂中的二氯甲烷，但是在这种情况下，大量生成含有二氯甲烷的废水，这 种废水的处理也是个问题。因此，在溶剂萃取法中，与二氯甲烷相比，主要使用水溶解度 高的乙酸乙酯。乙酸乙酯的水溶解度达到8.7重量%，与二氯甲烷相比，以相对较少量的水 便能够萃取，另外还具有属非卤化有机溶剂的优点。但是，乙酸乙酯的沸点为77℃，远高 于二氯甲烷39.8℃的沸点，在干燥时，存在去除残留溶剂相当费力的缺点。另外，具有特 定分子量和丙交酯：乙交酯比的PLGA高分子化合物，表现出在乙酸乙酯中溶解不良的物性。

因此，美国专利第4,389,840号、第4,530,840号、第6,544,559号、第6,368,632 号及第6,572,894号等提出同时利用溶液蒸发法与溶剂萃取法的技术。即，制备乳剂后， 一部分有机溶剂通过蒸发过程去除，残存的有机溶剂使用溶剂萃取法去除。例如，美国专 利第4,389,840号提出一种方法，把药物与PLGA高分子化合物溶解于二氯甲烷后，使其在 水中乳化，制备水包油型乳剂，然后通过蒸发过程去除40至60重量%的二氯甲烷，利用大 量水萃取残存的二氯甲烷，从而制备微球。

但是，这些现有方法由于其使用的有机溶剂的水溶解度不够高，必须使用极度过量的 水(有机溶剂的水溶解度×10倍以上)。为此需要极大容量的反应器，由于大量生成含有有 机溶剂的废水，面临废水处理所需的附带费用增加的低效率性问题。另外，还具有难以有 效去除微球内残存的有机溶剂的问题。

本发明人在大韩民国注册专利第10-0918092中提出了一种包括添加氨溶液，使水不溶 性有机溶剂转换成水溶性有机溶剂的步骤的含药物高分子微球制备方法。根据所述方法， 能够在使废水的发生实现最小化的同时，简便、迅速地制备高分子微球。但是，即使在使 用这种方法的情况下，依然存在高分子微球内的残存有机溶剂量占1%以上的问题。

当微球内残留显著量的有机溶剂时，干燥过程中发生的微球间的凝集现象突出。因此， 干燥后，微球未能个别地分散，在注射过程中发生问题的隐患增大，药物释放再现性下降， 另外，残留溶剂量超过许可下限值，发生难以从监管当局取得制品许可的问题。

因此，迫切需要开发一种能够使高分子微球内的残存有机溶剂实现最小化的新的制备 方法。

发明内容

为此，本发明人针对利用酸或碱去除水不溶性有机溶剂的高分子微球制备方法，在对 减小制备的高分子微球的残留有机溶剂量的方法进行研究的过程中发现，在预先向分散溶 剂中追加用于分散相制备的水不溶性有机溶剂的情况下，制备的高分子微球的残留有机溶 剂的浓度进一步减小，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的在于提供一种高分子微球的制备方法，包括：混合水不溶性有机 溶剂与分散溶剂的步骤；混合高分子化合物、药物及水不溶性有机溶剂而制成分散相的步 骤；把所述分散相混合于混合了所述水不溶性有机溶剂的分散溶剂而制备

O/W(oil-in-water，水包油)型、O/O(oil-in-oil，油包油)型或W/O/W(water-in  oil-in-water，水包油包水)型乳剂的步骤；以及在所述制备的乳剂中添加碱或酸而从乳剂 中去除水不溶性有机溶剂的步骤。

另外，本发明的另一目的在于提供一种高分子微球的制备方法，包括：混合水不溶性 有机溶剂与分散溶剂的步骤；混合高分子化合物、药物及水不溶性有机溶剂而制成分散相 的步骤；把所述分散相混合于混合了所述水不溶性有机溶剂的分散溶剂而制备

O/W(oil-in-water，水包油)型、O/O(oil-in-oil，油包油)型或W/O/W(water-in  oil-in-water，水包油包水)型乳剂的步骤；在所述制备的乳剂中添加碱或酸而从乳剂中去 除水不溶性有机溶剂的步骤；以及收得制备的去除了水不溶性有机溶剂的高分子微球，并 在加温的分散溶剂中进行再分散的步骤。

本发明的另一目的在于提供一种根据所述方法制备的高分子微球。

本发明的另一目的在于提供一种包含根据所述方法制备的高分子微球作为有效成份的药 物传递用组合物。

为达成如上目的，本发明提供一种高分子微球的制备方法，包括：混合水不溶性有机 溶剂与分散溶剂的步骤；混合高分子化合物、药物及水不溶性有机溶剂而制成分散相的步 骤；把所述分散相混合于混合了所述水不溶性有机溶剂的分散溶剂而制备

O/W(oil-in-water，水包油)型、O/O(oil-in-oil，油包油)型或W/O/W(water-in  oil-in-water，水包油包水)型乳剂的步骤；以及在所述制备的乳剂中添加碱或酸而从乳剂 中去除水不溶性有机溶剂的步骤。

为达成本发明的另一目的，本发明提供一种高分子微球的制备方法，包括：混合水不 溶性有机溶剂与分散溶剂的步骤；混合高分子化合物、药物及水不溶性有机溶剂而制成分 散相的步骤；把所述分散相混合于混合了所述水不溶性有机溶剂的分散溶剂而制备

O/W(oil-in-water，水包油)型、O/O(oil-in-oil，油包油)型或W/O/W(water-in  oil-in-water，水包油包水)型乳剂的步骤；在所述制备的乳剂中添加碱或酸而从乳剂中去 除水不溶性有机溶剂的步骤；以及收得制备的去除了水不溶性有机溶剂的高分子微球，并 在加温的分散溶剂中进行再分散的步骤。

为达成本发明的另一目的，本发明提供一种根据所述方法制备的高分子微球。

为达成本发明的另一目的，本发明提供一种包含根据所述方法制备的高分子微球作为 有效成份的药物传递用组合物。

下面进一步详细说明本发明的内容。

本发明的高分子微球制备方法特征在于包括：

步骤(a)，混合水不溶性有机溶剂与分散溶剂；

步骤(b)，混合高分子化合物、药物及水不溶性有机溶剂，制成分散相；

步骤(c)，把所述步骤(b)的分散相混合于混合了所述步骤(a)的水不溶性有机溶剂的分 散溶剂，制备O/W(oil-in-water，水包油)型、O/O(oil-in-oil，油包油)型或W/O/W(water-in  oil-in-water，水包油包水)型乳剂；以及

步骤(d)，在所述步骤(c)制备的乳剂中添加碱或酸，从乳剂中去除水不溶性有机溶剂。

把本发明的高分子微球制备方法按步骤分开具体说明如下。

在步骤(a)中，混合水不溶性有机溶剂与分散溶剂。

本发明的水不溶性有机溶剂可以溶解本行业公知的用于制备高分子微球的高分子化合 物，只要是借助于酸或碱而被水解，水解产物均良好溶于水的成份，可以无限制地使用。 一般而言，具有酰胺(amide)、酯(ester)、酸酐(anhydride)以及氢卤酸(halogen acid)结 构的化合物被认为借助于酸/碱而被水解。具有酸酐结构的化合物经水解反应，生成水溶性 的羧酸，具有酯结构的化合物水解成水溶性的羧酸与乙醇。具有氢卤酸结构的化合物水解 成水溶性的羧酸与氢卤酸(HF、HCl、HBr、HI等)。就具有酰胺结构的化合物而言，由于水 解成羧酸与胺，当此时生成的胺为溶解于水的产物时，所述酰胺包括于本发明的水不溶性 有机溶剂。

本发明中的水不溶性有机溶剂可以是具有氢卤酸(acid halogen)结构的化合物、具有 酸酐(anhydride)结构的化合物、磷酸酐(phosphoric anhydride)化合物、具有酯结构的化 合物、羧酸酯(carboxylic esters)化合物、磷酸酯(phosphoric esters)化合物、硫酸酯 化合物、硝酸酯化合物、硼酸酯化合物、具有酰胺(amide)结构的化合物以及羧酸酰胺 (carboxylic amides)化合物，优选地，可以是乙酸甲酯(methyl acetate)、乙酸乙酯(ethyl  acetate)、乙酸丙酯(propyl acetate)、乙酸异丙酯(isopropyl acetate)、乙酸丁酯(butyl  acetate)、甲酸甲酯(methyl formate)、甲酸乙酯(ethyl formate)、甲酸异丙酯(isopropyl  formate)、甲酸丙酯(propyl formate)、甲酸丁酯(butyl formate)、二氯乙酸甲酯(methyl  dichloroacetate)、氯乙酸甲酯(methyl chloroacetate)、氯乙酸乙酯(ethyl  chloroacetate)、二氯乙酸乙酯(ethyl dichloroacetate)、氟乙酸甲酯(methyl  fluoroacetate)、二氟乙酸甲酯(methyl difluoroacetate)、氟乙酸乙酯(ethyl  fluoroacetate)、二氟乙酸乙酯(ethyl difluoroacetate)、顺丁烯二酸酐(maleic  anhydride)、乙酸酐(acetic anhydride)、丙酸酐(propionic anhydride)、磷酸酐 (phosphoric anhydride)、乙酰胺(acetamide)、丙酰胺(propionamide)、丁酰胺(butylamide) 以及羧基酰胺(carboxyl amide)。

更优选地，可以是乙酸乙酯(ethyl acetate)、乙酸甲酯(methyl acetate)、甲酸甲酯 (methyl formate)、甲酸乙酯(ethyl formate)、甲酸异丙酯(isopropyl formate)、甲酸 丙酯(propyl formate)、乙酸酐(acetic anhydride)或丙酸酐(propionic anhydride)。

本发明中使用的分散溶剂包括含有乳化剂的水性分散溶剂或非水性分散溶剂，在制备 O/W型及W/O/W型乳剂时，可以使用水性分散溶剂，在制备O/O型乳剂时，可以使用非水性 分散溶剂。作为水性分散溶剂，可以使用亲水性乳化剂，例如，可以使用含有诸如聚乙烯 醇及聚山梨酸酯(Polysorbate)系列(例如聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯60、聚山梨酸酯65、 聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯85)的乳化剂的水溶液或其共溶剂。作为非水性分散溶剂，可 以使用亲油性乳化剂，例如，可以使用含有诸如脂肪酸甘油酯(Glycerin Esters of Fatty  Acids)、卵磷脂(lecithin)的乳化剂的硅油、植物油、甲苯或木聚糖。所述分散溶剂中含 有的乳化剂的浓度可以为0.05至15%(w/v)。

混合于所述分散溶剂中的水不溶性有机溶剂量会因用于制备高分子微球的高分子化合 物的种类、封入的药物的种类及分散溶剂的种类而异，优选地，可以添加至水不溶性有机 溶剂的水溶度(water solubility)以下。当混合的量过小时，高分子微球表面结构形成多 孔性，药物的初始释放量增加，当添加超过水溶度时，有机溶剂去除困难，残留有机溶剂 的浓度增加。

在步骤(b)中，混合高分子化合物、药物及水不溶性有机溶剂，制成分散相。

本发明的“分散相”，是指高分子化合物及药物溶解混合于水不溶性有机溶剂。

步骤(b)的水不溶性有机溶剂的示例如所述步骤(a)中所述。

步骤(b)的水不溶性有机溶剂，优选地，可以是与所述步骤(a)中使用者相同种类的有 机溶剂，根据需要，水不溶性有机溶剂可以使用由1种以上的不同有机溶剂混合的共溶剂， 从而调节要封入微球的药物的溶解度，或根据需要控制乳剂珠的硬化速度。

本发明的制备方法中使用的高分子化合物只要是本行业公知的高分子化合物，均可无 限制地使用，但优选可以是聚乳酸、聚丙交酯、聚乳酸与羟基乙酸共聚物、聚丙交酯乙交 酯共聚物(PLGA)、聚磷腈、聚亚氨碳酸酯、聚磷酸酯、聚酸酐、聚原酸酯、乳酸与己内酯 的共聚体、聚己内酯、聚羟基戊酸酯、聚羟基丁酸酯、聚氨基酸、乳酸与氨基酸的共聚体 以及它们的混合物，更优选可以是聚丙交酯乙交酯共聚物(PLGA)。

另外，优选地，本发明的制备方法中使用的高分子化合物可以是处理成末端可被酸或 碱水解的高分子化合物，例如，可以是末端被酯化的PLGA、被酯化的PCL(聚己内酯)、被 酯化的聚酸酐。

本发明的制备方法中使用的药物包括全部亲水性药物和水性药物，如果能被封入高分 子微球，则可无限制地使用，优选可以是黄体酮(progesterone)氟哌啶醇(haloperidol)、 甲哌硫丙硫蒽(thiothixene)、奥氮平(olanzapine)、氯氮平(clozapine)、溴哌利多 (bromperidol)、哌迷清(pimozide)、利培酮(risperidone)、齐拉西酮(ziprasidone)、二 氮平(diazepma)、氯氟卓乙酯(ethyl loflazepate)、阿普唑仑(alprazolam)、奈莫必利 (nemonapride)、氟西汀(fluoxetine)、舍曲林(sertraline)、文拉法辛(venlafaxine)、 多奈哌齐(donepezil)、他克林(tacrine)、加兰他敏(galantamine)、利斯的明 (rivastigmine)、司来吉兰(selegiline)、罗匹尼罗(ropinirole)、培高利特(pergolide)、 三己芬迪(trihexyphenidyl)、澳隐亭(bromocriptine)、苯扎托品(benztropine)、秋水仙 碱(colchicine)、去甲西泮(nordazepam)、依替唑仑(etizolam)、溴西泮(bromazepam)、 氯噻西泮(clotiazepam)、美沙唑仑(mexazolum)、丁螺环酮(buspirone)、醋酸戈舍瑞林 (goserelin acetate)、生长激素(somatotropin)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、 奥曲肽(octreotide)、西曲瑞克(cetrorelix)、醋酸善得定(sandostatin acetate)、促性 腺激素(gonadotropin)、氟康唑(fluconazole)、依曲康唑(itraconazole)、咪唑立宾 (mizoribine)、环孢菌素(cyclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、纳洛酮(naloxone)、纳 曲酮(naltrexone)、克拉屈滨(cladribine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、维甲酸 (tretinoin)、卡氮芥(carmusitne)、阿那格雷(anagrelide)、阿霉素(doxorubicin)、阿 那曲唑(anastrozole)、去甲氧柔红霉素(idarubicin)、顺氯氨铂(cisplatin)、更生霉素 (dactinomycin)、多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、雷替曲塞(raltitrexed)、 表柔比星(epirubicin)、来曲唑(letrozole)、甲氟喹(mefloquine)、伯氨喹(primaquine)、 奥昔布宁(oxybutynin)、托特罗定(tolterodine)、烯丙雌醇(allylestrenol)、洛伐他丁 (lovostatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(provastatin)、阿托伐他汀 (atrovastatin)、阿仑磷酸钠(alendronate)、鲑降钙素(salcatonin)、雷洛昔芬 (raloxifene)、氧雄龙(oxadrolone)、结合雌激素(conjugated estrogen)、雌二醇 (estradiol)、戊酸雌二醇(estradiol valerate)、苯甲雌二醇(estradiol benzoate)、炔 雌醇(ethinylestradiol)、依托孕烯(etonogestrel)、左炔诺孕酮(levonorgestrel)、替 勃龙(tibolone)、吡罗昔康(piroxicam)以及炔诺酮(norethisterone)，也可以是诸如蛋白 质、核酸等的高分子物质。

所述高分子化合物以药物1重量份为基准，可以使用1至500重量份，优选可以使用1 至50重量份的量。

在步骤(c)中，把所述步骤(b)的分散相混合于混合了所述步骤(a)的水不溶性有机溶剂 的分散溶剂，制备O/W(oil-in-water，水包油)型、O/O(oil-in-oil，油包油)型或 W/O/W(water-inoil-in-water，水包油包水)型乳剂。

关于乳剂的制备，为制备O/W(oil-in-water，水包油)型乳剂，可以混合高分子化合物、 药物及水不溶性有机溶剂而制成分散相，将其混合于添加了水不溶性有机溶剂的分散溶剂 中进行制备；为制备O/O(oil in oil，油包油)型乳剂，可以混合高分子化合物、药物及有 机溶剂而制成分散相，将其混合于使用了与前面使用的有机溶剂不混合的有机溶剂的分散 溶剂进行制备；为制备W/O/W(water-in-oil-in-water)型乳剂，可以使溶解有药物的水溶 液在溶解有高分子化合物的水不溶性有机溶剂中乳化，制成W/O(water-in-oil，油包水) 型乳剂后，将其再次混合于添加了水不溶性有机溶剂的分散溶剂，制备 W/O/W(water-in-oil-in-water)型乳剂。

在步骤(c)中混合的分散相与混合了水不溶性有机溶剂的分散溶剂的体积比，优选可以 是1：3至100，最优选可以是1：4至20。

如果分散溶剂的比例小于所述范围，则无法良好地发生乳化现象，如果大于所述范围， 则存在废溶液过度增加的问题。

在步骤(d)中，在所述步骤(c)制备的乳剂中添加碱或酸，从乳剂中去除水不溶性有机 溶剂。

在本发明中，添加碱或酸溶液而从乳剂中去除水不溶性有机溶剂的步骤，优选借助于 水解反应实现。水解反应作为添加水而分解成2种物质的反应，是指在具有酯结构的化合 物的情况下，水解成羧酸与乙醇，在具有酸酐结构的化合物的情况下，水解成羧酸，在具 有酰胺结构的化合物的情况下，水解成羧酸与胺，在具有氢卤酸结构的化合物的情况下， 水解成羧酸与氢卤酸(HF、HCl、HBr、HI等)的反应。通过该反应，使少量扩散于（或溶解 于）一层(例如，水层(water phase))的所述水不溶性有机溶剂转换成完全溶解于水的水溶 性有机溶剂，随着这种转换，使水不溶性有机溶剂能够扩散到水层。这种过程继续进行， 水不溶性有机溶剂被从乳剂内去除，使乳剂珠硬化成微球，从而能够制备目标的含药物高 分子微球。上述从乳剂内去除水不溶性有机溶剂，不仅是完全或实质上（达到检测不到水 平）消除水不溶性有机溶剂，而且包括使水不溶性有机溶剂比酸或碱投入前的初始水平减 少。此时，由于乳剂珠的快速硬化，乳剂珠颗粒间的相互作用受到抑制，可以无凝聚地获 得目标的高分子微球。此时，酸催化所述反应，碱在反应中消耗，一旦添加，其量即使比 水不溶性有机溶剂少或多，对所述反应的发生不会有大影响。不过，如果添加过多摩尔数 的酸或碱，药物与高分子化合物的稳定性会存在问题，所以应考虑适宜的量。

优选地，碱溶液可以添加得使水不溶性有机溶剂的摩尔数与碱溶液的摩尔数比达到1： 0.1至10，更优选达到1：0.2至5，更更优选达到1：0.3至3，最优选达到1：0.5至1.5。

所述步骤(c)及步骤(d)的乳剂的温度会因高分子化合物、药物、水不溶性有机溶剂、 碱或酸的种类而异，但优选地可以为0℃至35℃。

当乳剂的温度超过35℃时，根据药物、高分子化合物、碱或酸的种类，可能会出现药 物及高分子化合物的分解，当降低至不足0℃时，水溶性分散溶剂结冻，无法良好地形成乳 剂。

碱优选可以是氢氧化钠(NaOH)、氢氧化锂(LiOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化铵(NH₄OH)、 氢氧化铜(Cu(OH)₂)及氢氧化铁(Fe(OH)₃)，酸优选可以是盐酸(HCl)、硝酸(HNO₃)、硫酸 (H₂SO₄)、乙酸(CH₃COOH)、硼酸(H₃BO₃)及碳酸(H₂CO₃)。

如上所述，根据本发明的方法，不需要原来的溶剂蒸发或溶剂萃取工序，使用少量的 水，使废水的发生实现最小化，并能够在短时间内简便地制备含药物高分子微球。另外， 根据本发明的高分子微球制备方法，能够制备高分子微球内的残留有机溶剂浓度低的高分 子微球。

另一方面，本发明提供一种高分子微球的制备方法，包括：步骤(a)，混合水不溶性有 机溶剂与分散溶剂；

步骤(b)，混合高分子化合物、药物及水不溶性有机溶剂，制成分散相；

步骤(c)，把所述步骤(b)的分散相混合于混合了所述步骤(a)的水不溶性有机溶剂的分 散溶剂，制备O/W(oil-in-water，水包油)型、O/O(oil-in-oil，油包油)型或W/O/W(water-in  oil-in-water，水包油包水)型乳剂；

步骤(d)，在所述步骤(c)制备的乳剂中添加碱或酸，从乳剂中去除水不溶性有机溶剂； 以及

步骤(e)，收得在所述步骤(d)中制备的去除了水不溶性有机溶剂的高分子微球，在加 温的分散溶剂中进行再分散。

把本发明的高分子微球制备方法按步骤分开具体说明如下。

步骤(a)至步骤(d)与前述相同。

在步骤(e)中，收得在所述步骤(d)中制备的去除了水不溶性有机溶剂的高分子微球， 在加温的分散溶剂中进行再分散。

本发明的再分散过程中使用的分散溶剂，包括含有乳化剂的水性分散溶剂或非水性分 散溶剂，在制备O/W型及W/O/W型乳剂时，可以使用水性分散溶剂，在制备O/O型乳剂时， 可以使用非水性再分散溶剂。作为水性分散溶剂，可以使用亲水性乳化剂，例如，含有诸 如聚乙烯醇及聚山梨酸酯(Polysorbate)系列(例如，聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯60、聚山 梨酸酯65、聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯85)的乳化剂的水溶液或其共溶剂。作为非水性分 散溶剂，可以使用亲油性乳化剂，例如，可以使用含有诸如脂肪酸甘油酯(Glycerin Esters  of Fatty Acids)、卵磷脂(lecithin)的乳化剂的硅油、植物油、甲苯或木聚糖。所述分散 溶剂中含有的乳化剂的浓度可以为0.05至15%(w/v)。

加温的分散溶剂的温度会因药物、水不溶性有机溶剂及高分子化合物的种类及量而异， 但优选可以为20℃至80℃，更优选可以为30℃至50℃，最优选可以为30℃至40℃。如果 所述分散溶剂的温度降低到不足20℃，则残留有机溶剂的量会增加，当超过80℃时，会出 现高分子微球的变形。

再分散于加温的分散溶剂的高分子微球，其微球内的有机溶剂浓度进一步减小。

如此一来，根据本发明的方法，无需原来的溶剂蒸发或溶剂萃取工序，使用少量的水， 使废水的发生实现最小化，并能够在短时间内简便地制备含药物高分子微球，可以使制备 的高分子微球内的残留有机溶剂的浓度减小。

另一方面，在本发明中，提供一种根据所述本发明的方法制备的高分子微球。

根据本发明的方法制备的高分子微球，其残留有机溶剂浓度低，能够调节药物的体内 释放速度。

这种根据本发明方法制备的高分子微球具有0.1至1000μm的平均粒径，优选具有10 至100μm的平均粒径，可以根据需要，含有多种重量的药物。

另外，在使用本发明的高分子微球的情况下，由于能够有效传递高分子微球中包含的 药物，因此，本发明提供包含根据本发明的制备方法制备的高分子微球作为有效成份的药 物传递用组合物。

本发明的药物传递用组合物根据包含的药物，其对象疾病会各异，这是所属领域的技 术人员容易理解的。

在本发明的一个实施例中，使用分散溶剂中混合的水不溶性有机溶剂的不同浓度制备 高分子微球后，测量了相应的残留溶剂浓度。结果确认：与是否包含药物无关，在预先在 分散溶剂中添加了有机溶剂的情况下，残留有机溶剂的浓度最高降到25%水平(参照实施例 1)。

在本发明的另一实施例中，比较了再分散步骤的不同分散溶剂温度下的残留溶剂浓度。 把直至在微球制备过程加入碱或酸溶液而使反应终结的时间点定义为步骤1，把反应终结后 直至使通过过滤而分离的高分子微球再分散于PVA溶液并终结搅拌的时间点定义为步骤2， 当制备含有奥氮平60mg的高分子微球时，针对把步骤1、2均加温并保持于33℃而制备的 高分子微球与只把步骤1或步骤2加温并保持于33℃而制备的高分子微球，测量了残留溶 剂。结果确认：与步骤1是否加温无关，对步骤2加温的两组高分子微球与不对步骤2加 温的高分子微球相比，残留溶剂的浓度显著降低(参照实施例2-1)。

这种结果在使用不同PLGA种类反复实验的情况下同样出现(参照实施例2-2)。

在本发明的另一实施例中，增加使用的高分子的用量及药物的量，制备高分子微球后， 测量了残留溶剂的量。结果确认：在对再分散步骤(步骤2)加温的情况下，能够较低地维持 残留溶剂的量(参照实施例2-3)。

在本发明的另一实施例中，比较了分散溶剂中混合的不同水不溶性有机溶剂浓度下的 残留溶剂浓度。把高分子化合物溶解于甲酸乙酯，制成分散相，使其分别在预先添加了0、 1、2或4ml甲酸乙酯的20ml的0.5%PVA水溶液中分别乳化，制成乳剂，添加碱，去除水 不溶性有机溶剂，利用该方法制备高分子微球后，测量了残留溶剂的量，拍摄了高分子微 球。

结果确认：预先在分散溶剂中添加的有机溶剂的浓度越增加，高分子微球中残留的溶 剂的浓度越降低。另外，即使在分散溶剂中预先添加了有机溶剂，也稳定地制备出球形的 高分子微球(参照实施例3)。

在本发明的另一实施例中，不经过在本发明的分散溶剂中预先混合水不溶性有机溶剂 的步骤，使用分散相与分散溶剂的不同比率，制备高分子微球后，测量了相应的残留溶剂 的浓度变化。把分散相与分散溶剂的比率调节为1：10、1：6或1：4，分别制备高分子微 球后，测量了残留溶剂的量。

结果确认：在分散相与分散溶剂的比例为1：4或1：6的情况下，与1：10的情形相 比，使用溶剂(EA或EF)的残留量虽然减小，但乙醇的残留量增加。因此确认了通过调节分 散相与分散溶剂的比率，能够调节高分子微球的残留溶剂的浓度。另外确认了分散相与分 散溶剂的比率调节，在调节分散相的量及分散溶剂的量中哪一者方面没有差异(参照实施例 4)。

在本发明的另一实施例中，使用不同的分散相与分散溶剂比率及在分散溶剂中预先混 合的有机溶剂量，把再分散步骤的温度保持在40℃，制备高分子微球，测量了相应的特性 变化。分散相利用溶解有250mg高分子化合物的4ml甲酸乙酯进行固定，分散溶剂的量为 20ml、30ml以及40ml，相对于分散溶剂，使预先添加于分散溶剂的有机溶剂的量从0%增加 至10%时，分别制备了高分子微球。

测量残留溶剂量的结果，与在分散溶剂中根本不添加乙酸乙酯的情形相比，添加时的 残留溶剂浓度减小，特别是在分散相与分散溶剂的比例为1：10(分散溶剂PVA量为40ml)， 分散溶剂中预先添加了有机溶剂的情况下，残留溶剂的量大幅增加(参照实施例5-1)。

测量制备的高分子微球的收得率的结果，确认了在高分子微球收得方面没有问题(参照 实施例5-2)。

测量用于高分子微球制备的高分子化合物在制备前、后的分子量变化，结果确认：制 备前、后的高分子化合物的分子量方面没有有意义的变化(参照实施例5-3)。

在本发明的另一实施例中，测量了含药物高分子微球制备前、后高分子化合物的分子 量变化。使用不同高分子化合物种类、药物种类、含量及步骤1、步骤2温度，制备高分子 微球后，测量了制备前、后的高分子化合物分子量。

结果确认：所有高分子微球的高分子化合物的分子量均良好保存。从而确认了本发明 的制备方法与药物种类、反应温度等条件无关，高分子化合物的分子量均良好保存(参照实 施例6)。

在本发明的另一实施例中，根据本发明的方法，制备了含奥氮平高分子微球。

测量制备的含奥氮平高分子微球的残留溶剂量、奥氮平封入率及高分子微球收得率， 结果确认：残留溶剂的浓度保持较低，封入率及收得率良好，大部分在70%以上(参照实施 例7-2)。

在本发明的另一实施例中，使用与实施例1至7中使用者不同的水不溶性有机溶剂制 备了高分子微球。

把乙酸乙酯作为水不溶性有机溶剂，制备高分子微球，测量残留溶剂量、奥氮平封入 率及高分子微球收得率的结果，确认了残留溶剂量保持较低，封入率大部分在85%以上，收 得率良好，大部分在70%以上(参照实施例8-2)。

在本发明的另一实施例中，制备含奥氮平高分子微球，试验分散性与注射性后，对小 鼠(rat)进行注射，然后测量血液中奥氮平的浓度，以该方法进行药物动力学试验。

结果确认：包含本发明的含奥氮平高分子微球的组合物的分散性及注射性良好，能作 为注射剂使用，对小鼠注射时，血液中奥氮平持续释放80天(参照实施例9)。

在本发明的另一实施例中，制备了并非含有奥氮平，而是含有阿那曲唑的高分子微球。

确认了制备的高分子微球的收得率及封入率几乎为80%以上，与PLGA种类无关，均适 合，平均颗粒大小适合，为30至60um水平。确认了残留溶剂的浓度也为很低数值，与试 验种类无关，适合。另外，电子显微镜拍摄结果确认：与PLGA的种类无关，很好地制备成 全面圆滑的球形，特别是在把药物含量提高到40%的情况下，表面未观察到药物的结晶，确 认了封入良好(参照实施例10-2)。

通过制备的高分子微球的凝胶渗透分析(GPC)，测量了分子量变化，结构确认了大部分 情况下无分子量的变化。

为分析制备的高分子微球内的杂质，以所述制备的含阿那曲唑高分子微球为对象，实 施了超高效液相色谱(Ultra PerformanceLiquid Chromatography,UPLC)分析。结果确认： 本发明的高分子微球的平均杂质为0.17%，相当低。

另外，在苛刻条件下进行为期2个月的稳定性试验，结果为杂质含量不足0.23%，药物 含量变化不足10%，确认了根据本发明的制备方法制备的高分子微球的稳定性优秀(参照实 施例10-3)。

在本发明的另一实施例中，所述制备的高分子微球的持续性试验是把本发明的高分子 微球置于透析膜(Dialysis membrane)，以每隔既定时间更换缓冲液的方法进行了测量。

结果确认：在所有剂型的高分子微球中，几乎不释放残留药物。另外确认：根据使用 的高分子化合物的种类，丙交酯的比率越高，药物越缓慢释放，药物含量越高，释放速度 越快。从而确认了可以调节高分子微球制备所使用的高分子化合物的种类及封入的药物量， 调节释放速度(参照实施例10-4)。

在本发明的另一实施例中，通过动物试验测量了所述制备的高分子微球的持续性试验。

把所述制备的含阿那曲唑高分子微球按20mg/kg对小鼠进行肌肉注射后，测量了血液 中的阿那曲唑浓度。

结果确认：对根据本发明的方法制备的高分子微球进行给药时，根据制备的高分子微球 的种类，最高持续释放药物120天(参照实施例10-5)。

综上所述，本发明提供一种包括混合水不溶性有机溶剂与分散溶剂的步骤以及利用碱或 酸把水不溶性有机溶剂从乳剂中去除的步骤的新的高分子微球的制备方法、根据所述制备方 法制备的高分子微球以及包含所述高分子微球的药物传递用组合物。本发明的制备方法不需 要原来的溶剂蒸发或溶剂萃取工序，使用少量水，使废水的产生实现最小化，并能够在短时 间内简便地制备目标的含药物高分子微球，能够把制备的高分子微球内的残留溶剂浓度保持 较低，对制备持续释放型医药品具有效果。

附图说明

图1是未预先在分散溶剂中添加水不溶性有机溶剂而制备的高分子微球的残留溶剂测 量结果图表。

图2是含有奥氮平的高分子微球的电子显微镜照片。图2A是在制备过程中将温度保持 在33℃而制备的高分子微球的照片，图2B是未经加温步骤而制备的高分子微球的照片。两 种情形均确认了高分子微球良好制备成球形，奥氮平被良好封入高分子微球内。

图3是把步骤2的温度保持在40℃，使药物及高分子化合物的量增加而制备的高分子 微球的电子显微镜照片。图3A是药物量为60mg的情形的高分子微球照片，图3B是药物量 为80mg的情形的高分子微球照片。

图4是显示在预先添加于分散溶剂中的有机溶剂不同浓度下的高分子微球内的残留溶 剂浓度的图表。

图5是使用不同的预先添加于分散溶剂的有机溶剂浓度而制备的高分子微球的电子显 微镜照片(Add：预先添加于分散溶剂的水不溶性有机溶剂(甲酸乙酯)量(ml))。

图6是为测量高分子微球制备前、后的高分子化合物的分子量而制作的标准检量曲线。

图7是含有奥氮平的高分子微球的电子显微镜照片(制备编号为实施例的含奥氮平高分 子微球的制备编号)。

图8是把包含含奥氮平高分子微球的组合物对小鼠(rat)注射后测量血液中奥氮平浓度 变化的结果图表(制备编号是实施例9的含奥氮平高分子微球的制备编号)。

图9是含有阿那曲唑的高分子微球的电子显微镜照片(照片的编号是指实施例10的制 备编号，拍摄了以相应制备编号的组成成份制备的含阿那曲唑高分子微球)。

图10是根据本发明方法制备的含有阿那曲唑的高分子微球的试管内(in vitro)释放试 验结果图表。

图11是根据本发明方法制备的含有阿那曲唑的高分子微球的持续性动物实验结果图 表。把各组成成份的根据本发明方法制备的含阿那曲唑高分子微球肌肉注射于小鼠后测量 血液中阿那曲唑浓度的结果图表(全部按20mg/kg用量注射)。

具体实施方式

下面根据实施例对本发明进行详细说明。

不过，下述实施例只是对本发明的示例，本发明的内容并非限定于下述实施例。

<实施例1>

分散溶剂中混合的不同水不溶性有机溶剂浓度下的残留溶剂浓度对比实验

<1-1>根据原有方法制备高分子微球时的残留溶剂测量

把75252.5E PLGA高分子0.25g溶解于甲酸乙酯(EF)4ml后，使得在0.5%聚乙烯醇 (PVA)40ml中乳化，制成了乳剂。然后，把28%NH3溶液3.4ml添加于乳剂，反应30分钟， 添加蒸馏水后进行了过滤。对微球进行分离，重新再分散于0.1%PVA80ml并进行搅拌。 为进行本实验而使用的7525 2.5E PLGA高分子信息如下。

【表1】

75252.5E PLGA高分子信息

微球残留溶剂分析使用了如下气相色谱分析(GC)方法。GC设备使用了岛津公司(日本)的 GC-2010，管柱使用了菲罗门公司(美国)的ZB-624。SPL的温度保持200℃，样品的分流比为 15。载气使用了高纯度氮气。压力在54.3kPa(流速1.3ml/min)下保持2分钟，以-50℃的 rate，在40kPa下保持3分钟。然后，以rate80，把压力升高至100kPa，保持2分钟时间。 管柱的温度在80℃下保持5.1分钟，以每分钟200℃的速度升高至180℃，保持2分钟。检 测仪使用火焰离子化检测器(FID,flame ionization detector)，温度为220℃。取高分子 微球样品50mg左右，准确称量重量后，完全溶解于2ml四氢呋喃(tetrahydrofuran)。利用 戊醇(pentanol)将其稀释4倍后，利用过滤器过滤沉淀的高分子后注入GC。

结果如[图1]所示，确认了残留溶剂为1.5%以上。

<1-2>分散溶剂中混合的不同水不溶性有机溶剂浓度下的残留溶剂浓度

根据是否预先在分散溶剂中混合水不溶性有机溶剂，测量了高分子微球中留有的残留 有机溶剂浓度。

根据如以下[表2]所示的高分子微球制备条件制备了高分子微球。

【表2】

高分子微球制备条件

首先，把75252.5E聚丙交酯乙交酯共聚物(PLGA)高分子0.35g及[表1]的奥氮平溶解 于甲酸乙酯(ethyl formate,EF)4ml后，使得在预先添加了[表1]的EF有机溶剂的0.5%聚 (乙烯醇)(Poly(vinyl Alcohol)、PVA)20ml中乳化，制成乳剂。把10N NaOH添加于乳剂， 反应30分钟，添加蒸馏水后进行了过滤。对微球进行分离，重新再分散于0.1%PVA80ml并 进行搅拌。

其结果如所述[表2]所示，确认了在分散溶剂中添加有机溶剂时，残留有机溶剂的浓度 降低。

<实施例2>

再分散步骤的不同分散溶剂温度下的残留溶剂浓度对比实验

制备高分子微球时，通过用于去除水不溶性有机溶剂的酸或碱的反应，导致水相的温 度变化，预计这将对残留溶剂量产生影响。因此，把高分子微球制备过程分开，把直至加 入碱或酸溶液而使反应终结的时间点定义为步骤1，把反应终结后直至使通过过滤而分离的 高分子微球再分散于PVA溶液并终结搅拌的时间点定义为步骤2。获知了其中任何步骤中的 温度对减少残留溶剂都发挥了重要作用。

<2-1>利用75252.5E PLGA制备高分子微球时的再分散步骤的不同分散溶剂温度下的 残留溶剂浓度对比实验

高分子微球制备过程如下。把60mg奥氮平与250mg的75252.5E PLGA溶解于4ml的 甲酸乙酯。使该分散相在预先溶解了1ml甲酸乙酯的20ml的0.5%PVA水溶液中乳化，制成 了乳剂。然后，添加10N NaOH6.2ml，诱导反应30分钟，制备了高分子微球。对高分子微 球进行分离，在0.1%PVA80ml中进行再分散并搅拌后，对高分子微球进行分离、真空干 燥。

在所述过程中，分别在下述[表3]的温度条件下执行步骤1和步骤2后，以<实施例1> 中所示的方法测量了残留溶剂。

【表3】

利用75252.5E PLGA制备高分子微球时，不同制备条件下的残留溶剂浓度

其结果如[表3]所示，确认了在不对步骤2进行加热的情况下，高分子微球内的乙醇的 残留量上升0.5%，但在步骤2中，在把水相温度保持于33℃的情况下，乙醇的残留量减少至 0.5%以下。另外，在把步骤1的温度保持于33℃的情形与并非如此的情形下，只要把步骤2 的水相温度保持在33℃，在残留溶剂的浓度方面没有大的差异。

从而确认：步骤2的水相温度调节对去除残留溶剂发挥重要作用。

<2-2>利用65354.5A PLGA制备高分子微球时的再分散步骤的不同分散溶剂温度下的 残留溶剂浓度对比实验

一般而言，PLGA分子量越大，高分子微球中残留的有机溶剂量越增加。因此，对本发 明的方法即使使用分子量大的65354.5A PLGA，是否也能够克服残留有机溶剂问题进行了 试验。

使用的PLGA高分子信息如[表4]所示。

【表4】

65354.5A PLGA高分子信息

高分子微球制备过程与<实施例2-1>相同，只有使用的高分子从75252.5E PLGA变更为 65354.5A PLGA。

在所述过程中，在下述[表5]的温度条件下分别执行步骤1和步骤2后，以如<实施例 1>所示方法测量了残留溶剂。

另外，通过电子显微镜(SEM,日立S-3000N,日本,HV20kv,焦距15mm,射束电流40) 拍摄，确认了制备的高分子微球的状态。

【表5】

利用65354.5A PLGA制备高分子微球时的不同制备条件下的残留溶剂浓度

其结果如[表5]所示，确认了即使在使用65354.5A的情况下，把步骤2的水相温度保 持在33℃时，甲酸乙酯及乙醇的残留量显著减小。

另外，以电子显微镜拍摄高分子微球的结果确认：制备了60mg奥氮平被良好封入高分 子微球内的高分子微球(参照[图2])。

<2-3>高分子使用量增加时的再分散步骤的不同分散溶剂温度下的残留溶剂浓度对比 实验

获知了即使在使分散相的PLGA浓度增加的情况下，是否能够使高分子微球内的残留溶 剂浓度随着分散溶剂温度变化而减小。

把60mg或80mg的奥氮平与400mg的65354.5A PLGA溶解于4ml的甲酸乙酯，制成分 散相。然后，以与<实施例2-1>相同的方法制备高分子微球，以如<实施例1>所示的方法测 量了残留溶剂浓度。

在所述过程中，步骤2的温度如[表6]记载所示。

【表6】

利用65354.5A PLGA制备高分子微球时的不同制备条件下的残留溶剂浓度

批次名 步骤2温度(℃) 药物量(mg) 甲酸乙酯残留量% 乙醇残留量% 1 33 60 0.91 0.13 2 33 80 1.43 0.1以下 3 40 60 0.1以下 0.1以下 4 40 80 0.1以下 0.1以下 5 50 60 0.1以下 0.1以下 6 50 80 0.1以下 0.1以下

其结果如[表6]所示，确认了在使PLGA量增加到400mg的情况下，当把步骤2的温度保 持在40℃以上时，能够较低地保持残留溶剂的浓度。

另外，利用电子显微镜(SEM,日立S-3000N,日本,HV20kv,焦距15mm,射束电流40) 拍摄，确认了所述[表6]的3号4号批次的高分子微球的状态。

结果确认：制备了投入的奥氮平被封入的高分子微球(参照[图3])。

<实施例3>

分散溶剂中混合的不同水不溶性有机溶剂浓度下的残留溶剂浓度对比实验1

在所述<实施例1>中确认：当在分散溶剂预先添加了有机溶剂时，残留有机溶剂的浓度 降低。因此，在较高地保持再分散步骤的分散溶剂温度的同时，使用分散溶剂中混合的水 不溶性有机溶剂的不同量，测量对比了相应的残留溶剂量。

把500mg的4.5A PLGA(丙交酯：乙交酯=85：15,0.45dL/g,SurModics制药公司,美 国)溶解于4ml的甲酸乙酯，制成分散相，使该分散相分别在预先添加了0、1、2或4ml的 甲酸乙酯的20ml的0.5%PVA水溶液中乳化，制成了乳剂。然后，添加10N NaOH6.2ml， 诱导反应30分钟，制备了高分子微球。对高分子微球进行分离，在40℃的0.1%PVA80ml 中进行再分散并搅拌后，对高分子微球进行分离、真空干燥。

高分子微球制备后，以与<实施例1>相同的方法测量残留溶剂，以与<实施例2-2>相同 的方法拍摄了制备的高分子微球。

其结果如[图4]所示，确认了预先在分散溶剂中添加的有机溶剂的浓度越增加，高分子 微球中残留的溶剂的浓度越降低。另外，如[图5]所示，确认了即使在分散溶剂中预先添加 了有机溶剂，球形的高分子微球仍然稳定制备，在分散溶剂中预先添加的有机溶剂的浓度 越增加，制备的高分子微球的大小也越减小。

<实施例4>

分散相与分散溶剂不同比率下的残留溶剂浓度对比实验

<4-1>使用分散相与分散溶剂的不同比率，制备高分子微球

为了变化分散相与分散溶剂的比率，了解相应的残留溶剂量变化，如[表7]所示，把分 散相(O)与分散溶剂(W)的比率调节为1：10、1：6或1：4，分别制备了高分子微球。分散 相与分散溶剂的比率调节分别调节了分散相的量或分散溶剂的量。另外，构成分散相的有 机溶剂的种类也分别使用乙酸乙酯与甲酸乙酯进行了试验，溶剂分解试剂分别使用NaOH与 氨进行了试验。

【表7】

实验中使用的O/W比率及溶剂分解法

加入高分子化合物混合物1g(4A：2A=6：4)与奥氮平0.333g，加入乙酸乙酯或甲酸 乙酯相应量后，使得完全溶解，然后加入0.5%PVA相应量，在常温下搅拌。加入当量的10M 的NaOH或氨溶液，搅拌30分钟，制备了高分子微球。制备的高分子微球经过滤收得，将 其在0.1%PVA中进行再分散并搅拌后，用蒸馏水清洗，进行冻结干燥。

<4-2>制备的高分子微球的收率及残留溶剂测量

利用与<实施例1>中相同的方法测量了在所述<实施例4-1>中制备的高分子微球的残留 溶剂。

高分子微球的收率是在预先测量了重量的碟子中放入回收的高分子微球，在真空干燥 后测量重量，求出回收的高分子微球重量后，按以下公式求出。

收率(%)=(回收的高分子微球的重量)/(制备时使用的高分子与药物的重量和)X100

【表8】

制备的高分子微球的收率及残留溶剂量

其结果如[表8]所示，确认了在分散相与分散溶剂的比率为1：4或1：6的情况下，与1： 10的情形相比，使用溶剂(EA或EF)的残留量虽然减少，但乙醇的残留量增加。确认了分散 相与分散溶剂的比率调节在调节分散相的量及分散溶剂量中哪一者方面没有差异。

<实施例5>

与分散相和分散溶剂比率、预先添加的有机溶剂浓度及再分散步骤的温度变化相应的 高分子微球变化

<5-1>高分子微球制备及残留溶剂测量

在所述<实施例1>至<实施例4>中，测量了与在分散溶剂中混合的水不溶性有机溶剂浓 度变化、再分散步骤(第2步骤)的分散溶剂温度变化及分散相和分散溶剂比率变化相应的 残留溶剂的浓度。

全部反映这些要素，制备高分子微球，测量了残留溶剂的浓度。

分散相使用把250mg的4.5A PLGA溶解于4ml甲酸乙酯的溶液。分散溶剂使用20、30、 40ml的0.5%PVA，在分散溶剂中预先添加的水不溶性有机溶剂(甲酸乙酯)根据分散溶剂量， 添加0ml至4ml。溶剂分解使用10N NaOH，这是考虑到添加的总甲酸乙酯量而计算添加的， 以便达到1：1当量。制备高分子微球时，直至添加碱或酸溶液而使反应终结的步骤(步骤 1)在室温下进行，反应终结后直至使通过过滤而分离的高分子微球在PVA溶液中再分散并 终结搅拌的步骤(步骤2)保持40℃。

制备的高分子微球的残留溶剂分析以如<实施例1>所示的方法进行了测量。反复进行2 次相同的制备工序及残留溶剂分析，全部显示出其数值。

【表9】

制备的高分子微球的残留溶剂量

其结果如[表9]所示，确认了与分散溶剂中完全不添加甲酸乙酯的情形相比，添加时的 残留溶剂浓度减小，特别是分散相与分散溶剂的比率为1：10(分散溶剂PVA量为40ml)，未 在分散溶剂中预先添加EF时，残留溶剂量增加。

<5-2>高分子微球的收得率测量

测量在所述<实施例5-1>中制备的高分子微球的收得率。测量以如<实施例4-2>所示方 法进行。

其结果如[表10]所示，确认了就全部条件而言，在高分子微球的收得率方面没有问题。

【表10】

制备的高分子微球的收得率

<5-3>高分子微球制备前、后4.5A PLGA分子量变化测量(GPC)

在所述<实施例5-1>实施的高分子微球制备过程中，为测量PLGA的分子量是否变化， 通过凝胶渗透分析(gel permeation chromatography,GPC)测量了高分子微球制备前、后 4.5A PLGA的分子量。

GPC使用了安捷伦1100(安捷伦科技公司，美国)，作为移动相，使用了四氢呋喃 (tetrahydrofuran)。分析管柱使用了安捷伦公司的PLgel5um79911GP-504，流速保 持在1ml/min。为制作标准检量曲线，使用了聚合物实验室(Polymer Laboratories)公司的 标准品(分子量：3390000,1290000,426600,151700,72200,28500,9860,4950,1300)。 分析样品是把高分子微球8mg溶解于四氢呋喃2ml中并过滤使用。GPC注入量为50ul。

利用标准品求出如[图6]所示的标准检量曲线。以此为基础，求出制备前4.5A PLGA与 制备的高分子微球的4.5A PLGA的分子量。其结果如[表11]所示，确认了根据本发明方法 制备的高分子微球的4.5A PLGA的分子量为55421至58409，与制备前4.5A分子量57542 相比，未出现有意义的变化。

从而确认了本发明的高分子微球制备方法不分解4.5A PLGA高分子。

【表11】

4.5A PLGA的分子量比较

<实施例6>

含药物高分子微球的高分子化合物的分子量变化测量

<实施例5-3>确认了在含有药物时，高分子微球的分子量无变化。以多种条件制备含有 药物的高分子微球，测量了高分子化合物的分子量。

【表12】

高分子微球的制备条件

根据所述[表12]制成分散相后，加入0.5%PVA进行乳化，制成乳剂。然后添加10N NaOH 溶液，诱发反应30分钟后，加入蒸馏水，然后对高分子微球进行过滤、分离。使分离的高分 子微球在0.1%PVA溶液中再分散后，进行真空干燥。在高分子微球制备时，把添加碱或酸溶 液而使反应终结的步骤定义为步骤1，把使反应终结后通过过滤而分离的高分子微球在PVA 溶液中再分散并终结搅拌的步骤定义为步骤2，按照所述[表12]保持各步骤的温度。

以与<实施例5-3>中测量方法相同的方法测量了所述制备的高分子微球的高分子化合 物分子量。

其结果如[表13]所示，确认了所有高分子微球的高分子化合物的分子量均保存良好。 从而确认：本发明的制备方法与药物的种类、反应温度等条件无关，高分子化合物的分子 量保存良好。

【表13】

高分子微球制备前、后高分子化合物的分子量测量结果

实验编号 微球制备前分子量 微球制备后分子量 1 15000 15709 2 29013 27737 3 56694 54116

<实施例7>

含奥氮平高分子微球制备

<7-1>含奥氮平高分子微球制备

根据本发明的高分子微球制备方法，以[表14]的条件制备了含奥氮平高分子微球。

把60mg的奥氮平和250mg的65354.5A PLGA溶解于4ml的甲酸乙酯后，把该分散相 加入[表14]所示的预先添加了甲酸乙酯的分散溶剂(0.5%PVA)使之乳化，制成了乳剂。然 后，添加10N NaOH溶液，诱发反应30分钟，加入蒸馏水后，对高分子微球进行过滤、分 离。使分离的高分子微球在0.1%PVA溶液中再分散后，进行真空干燥。在高分子微球制备 时，直至添加碱或酸溶液而使反应终结的步骤(步骤1)在室温下进行，反应终结后直至使通 过过滤而分离的高分子微球在PVA溶液中再分散并终结搅拌的步骤(步骤2)保持40℃。

【表14】

含奥氮平高分子微球制备条件

<7-2>残留溶剂量、奥氮平封入率及高分子微球收得率测量

利用与<实施例1>中相同的方法测量了<实施例7-1>中制备的高分子微球的残留溶剂 量。

制备的高分子微球的收得率，是在干燥容器中加入制备的高分子微球进行冻结干燥， 测量重量后，按以下公式计算得出。

收得率(%)=(高分子微球重量)/(制备时使用的高分子与药物的重量和)X100

在奥氮平封入率中，制备的高分子微球的封入量与封入率，按如下测量。

把干燥的高分子微球10mg溶解于乙腈：水=50：50(v/v)溶液后，稀释成适当倍数。把 该溶液过滤后，利用UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography)进行分析，计算封 入量及封入率。UPLC分析设备使用了Waters公司(德国)的ACQUITY，管柱使用了HSS C18(Waters ACQUITY UPLC,德国)。移动相的条件是使用乙酸铵缓冲液与乙腈按50：50混 合者，稀释液使用乙腈与水按50：50混合者。

封入量(%)=(检测出的药物重量/微球重量)X100

封入率(%)=封入量/(理论封入量)X100

理论封入量(%)=(制备时使用的药物的重量)/(制备时使用的高分子与药物的重量和) X100

其结果如[表15]所示，确认了残留溶剂量保持较低，封入率及收得率如[表16]所示， 大部分为70%以上，良好。

【表15】

制备的高分子微球的残留溶剂量

【表16】

制备的高分子微球的封入率及收得率

<实施例8>

以乙酸乙酯为水不溶性有机溶剂的含奥氮平高分子微球制备

<8-1>含奥氮平高分子微球制备

利用与所述<实施例7>中使用的水不溶性有机溶剂(甲酸乙酯)不同的水不溶性有机溶 剂，制备了含奥氮平高分子微球。

使用的水不溶性有机溶剂为乙酸乙酯(EA)，制备条件按[表17]中所示条件进行了制备。

把60mg的奥氮平与250mg的4.5A PLGA溶解于4ml的乙酸乙酯后，把该分散相加入[表 17]所示的预先加入了乙酸乙酯的分散溶剂(0.5%PVA)使之乳化，制成乳剂。然后，添加10N NaOH溶液，诱发反应30分钟，加入蒸馏水后，对高分子微球进行过滤、分离。使分离的高 分子微球在0.1%PVA溶液中再分散后进行真空干燥。在高分子微球制备时，直至添加碱或 酸溶液而使反应终结的步骤(步骤1)在4℃下进行，反应终结后直至使通过过滤而分离的高 分子微球在PVA溶液中再分散并终结搅拌的步骤(步骤2)保持40℃。

【表17】

含奥氮平高分子微球制备条件

<8-2>残留溶剂量、奥氮平封入率及高分子微球收得率测量

以与<实施例1>中相同的方法测量了<实施例8-1>中制备的高分子微球的残留溶剂量。

其结果确认：残留溶剂的量如[表18]所示，保持较低，封入率、收得率如[表19]所示， 封入率大部分为85%以上，收得率大部分为70%以上，良好。

【表18】

制备的高分子微球的残留溶剂量

【表19】

制备的高分子微球的封入率及收得率

<实施例9>

含奥氮平高分子微球的药物动力学试验

<9-1>含奥氮平高分子微球制备

按照[表20]的组成成份，利用多种PLGA制备了含奥氮平高分子微球。

把PLGA及奥氮平溶解于有机溶剂(甲酸乙酯)，制备了分散相。使分散相与分散溶剂之 比达到1：5，分散溶剂是在0.5%PVA中按10：1比率混合甲酸乙酯加以使用。把分散相加 入冷却至4℃的分散溶剂中进行乳化，制备了乳剂后，按[表20]投入10M NaOH，诱导反应 30分钟，制备了高分子微球。利用蒸馏水清洗生成的高分子微球后，在40℃的0.1%PVA 溶液进行再分散并搅拌后，对高分子微球进行分离、真空干燥。

通过电子显微镜(SEM,日立S-3000N,日本,HV20kv,焦距15mm,射束电流40)拍摄 确认了制备的高分子微球的状态。

【表20】

含奥氮平高分子微球的组成

电子显微镜观察结果确认：奥氮平被良好封入高分子微球内，所有高分子微球良好地制 备成球形(参照[图7])。

<9-2>注射性及分散性试验

把<实施例9-1>中制备的含奥氮平高分子微球在含有羧甲基纤维素(CMC)及吐温20的生 理盐水中按30%(w/v)浓度悬浊后，使用19G针头的注射器，把1ml吸入注射器再重新喷出， 了解能否注射。

结果如[表21]所示，确认了本发明的含奥氮平高分子微球的注射性及分散性良好。

【表21】

注射性及分散性试验结果

制备编号 评价结果 1 + 2 + 3 +

<9-3>含奥氮平高分子微球的持续性评价

把<实施例9-1>中制备的含奥氮平高分子微球悬浊于赋形剂溶液(包含羧甲基纤维素及 吐温20的生理盐水(saline))，按40mg/kg对9周龄雌SD小鼠进行肌肉注射给药。之后每 隔既定时间采血，测量血液中奥氮平的浓度。

其结果如[图8]所示，确认了本发明的含奥氮平高分子微球释放奥氮平最高80天。

<实施例10>

含阿那曲唑高分子微球制备

根据本发明的高分子微球制备方法，使用不同于所述实施例中的高分子种类、药物及 封入量，制备了高分子微球。

<10-1>含阿那曲唑高分子微球制备

按[表22]的组合，制备了多种条件的含阿那曲唑高分子微球。

【表22】

含阿那曲唑高分子微球组成

把阿那曲唑与PLGA1000mg加入19ml的甲酸乙酯，完全溶解制成分散相后，添加8ml的 甲酸乙酯，加入冷却到4℃的0.5%PVA(分散溶剂)并搅拌，制备了乳剂。添加10M NaOH34ml， 搅拌30分钟。利用蒸馏水清洗生成的高分子微球后，在33℃的0.1%PVA中再分散并搅拌后， 进行过滤、冻结干燥，制备了高分子微球。

<10-2>制备的含阿那曲唑高分子微球的基本特性评价

制备的高分子微球的收率，是在干燥容器中加入制备的高分子微球，进行冻结干燥并 测量重量后，按以下公式计算得出。

收率(%)=(高分子微球重量)/(制备时使用的高分子与药物的重量和)X100

制备的高分子微球的封入量与封入率按如下测量。

把干燥的高分子微球10mg溶解于乙腈：水=50：50(v/v)溶液后，稀释成适当的倍数。 对该溶液进行过滤后，利用UPLC进行分析，计算封入量及封入率。UPLC(Ultra Performance  Liquid Chromatography)分析设备使用了Waters公司(德国)的ACQUITY，管柱使用了HSS C18(Waters ACQUITY UPLC,德国)。移动相的条件使用乙酸铵缓冲液与乙腈按50：50混合 者，稀释液使用乙腈与水按50：50混合者。

封入量(%)=(检测出的药物重量/微球重量)X100

封入率(%)=封入量/(理论封入量)X100

理论封入量(%)=(制备时使用的药物的重量)/(制备时使用的高分子与药物的重量和) X100

粒度分析使用马尔文粒度分析仪(马尔文仪器公司,英国)进行了测量。

残留溶剂量以与<实施例1>相同的方法进行了测量，高分子微球的形状以与<实施例 2-2>相同的方法进行了拍摄。

【表23】

制备的高分子微球的收得率、封入量及残留溶剂浓度

其结果如[表23]所示，确认了收得率及封入率几乎都在80%以上，与PLGA种类无关，均 适合，平均颗粒大小为30至60um水平，适合。水分含量为0.5%水平，残留溶剂为很低数值， 与试料种类无关，均适合。

另外，电子显微镜拍摄结果如[图9]所示，确认了高分子微球与使用的PLGA种类无关， 均良好地全面制备成圆滑球形，特别是在把药物含量提高到40%的情况下，表面未观察到药 物结晶，封入良好。

<10-3>制备的含阿那曲唑高分子微球的稳定性评价

制备的高分子微球内的杂质分析以制备编号8号为对象进行。以高分子微球中封入的 封入量为基准，称量高分子微球，使API(Active Pharmaceutical Ingredients，有效药物 成份)阿那曲唑达到250ug/ml，在乙腈：DW=50：50溶液中稀释，利用UPLC进行分析。

为进行GPC分析，把制备的高分子微球30mg溶解于3ml(o-CP：三氯甲烷=1：3)，利 用PLgel5μmMixed-D*2ea管柱，在40℃条件下，以0.7ml/min，用射率检测器(RIDetector) 进行GPC分析。

为进行试管内稳定性模拟试验，在干燥器底面加入水，使湿度达到100%，在其中把高 分子微球(制备编号8号)盛装于管中，放入40℃稳定性试验器。按既定间隔(4周，2个月)， 按n=3进行取样，利用乙腈进行溶解，用甲醇进行稀释，分析药物含量与杂质的变化。

其结果如[表24]所示，确认了本发明的高分子微球具有平均0.17%的杂质。相对于药 物原料的杂质标准一般是管理在总杂质1%以下，个别杂质0.1%以下，与此相比，本发明的 高分子微球制备过程确保了稳定性。

【表24】

高分子微球的杂质分析结果

另外，通过GPC分析，测量制备前、后的PLGA分子量，结果如[表25]所示，确认了大 部分分子量无变化。

【表25】

制备中使用的高分子的分子量测量结果

试管内稳定性模拟结果如[表26]所示，确认了在全期间内，不同时间的平均总杂质含量 (%)为0.23以下，药物含量的变化不足10%，本发明的制备方法稳定性优秀。

【表26】

试管内稳定性模拟结果

期间 总杂质(%) 药物含量% 对象含量% 开始 0.17 33.34±1.19 100.0 4周 0.12 33.95±1.31 101.8 2个月 0.23 30.22±0.14 90.6

<10-4>制备的含阿那曲唑高分子微球的持续性评价1-试管内(in vitro)释放实验

为了解根据本发明的方法制备的高分子微球的药物释放持续性，执行了试管内药物释 放实验。

把高分子微球放于透析膜(Dialysis membrane,MWCO=12~14KD)上，把透析膜填满PBS 后，放入预先调节好温度平衡的PBS，在37℃恒温器中持续搅拌，每隔预定的时间间隔， 测量释放的药物量。药物释放结束后，对剩余高分子微球进行真空干燥，测量留有的药物 量。

其结果如[图10]所示，确认了在所有剂型的高分子微球中，几乎无残留药物地进行释 放。另外确认：根据使用的高分子化合物的种类，丙交酯的比率越高，药物越缓慢释放， 药物含量越高，释放速度越快。从而确认：调节在高分子微球制备中使用的高分子化合物 的种类及封入的药物量，能够调节释放速度。

<10-5>制备的含阿那曲唑高分子微球的持续性评价2-动物实验

为判断分散性及注射性，在制备的高分子微球中添加含有羧甲基纤维素(CMC)及吐温20 的生理盐水，制成悬浊液。利用19G或20G针头把该悬浊液吸入1ml注射器再喷出，观察 是否能够注射。在高分子微球/悬浊液(w/v)的10%浓度下对结果进行判别。

在以注射方式对小鼠(rat)给药的情况下，把各制剂在赋形剂溶液(包含CMC、Tween20 的生理盐水(saline))中进行悬浊并给药。使用雌9周龄SD小鼠，按20mg/kg进行肌肉注 射。之后每隔既定时间采血，测量血液中阿那曲唑浓度。

其结果如[图11]所示，确认了根据本发明方法制备的高分子微球最高释放药物120天。

【工业利用可能性】

因此，本发明提供一种包括：混合水不溶性有机溶剂与分散溶剂的步骤及利用碱或酸从 乳剂中去除水不溶性有机溶剂的步骤的新的高分子微球的制备方法、根据所述制备方法制备 的高分子微球及包含所述高分子微球的药物传递用组合物。本发明的制备方法不需要原来的 溶剂蒸发或溶剂萃取工序，使用少量水，使废水的产生实现最小化，并能够在短时间内简便 地制备目标的含药物高分子微球，能够较低地维持制备的高分子微球内的残留溶剂浓度，对 制备持续释放型医药品极具效果，工业上的利用可能性高。