针对在植物中赋予对2,4-二氯苯氧乙酸的抗性的酶的单克隆抗体检测方法

摘要

本文中描述了可用于测定和定量酶芳氧基链烷酸酯双加氧酶的存在的单克隆抗体和方法。

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求2010年6月4日提交的美国临时专利申请61/351,593的权益， 其公开内容在此通过提述完整并入。

发明背景

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)属于苯氧酸类的除草剂，并且已经在许多单子叶 植物作物诸如玉米、小麦、和稻中用于选择性控制阔叶杂草，而对期望的作 物植物没有严重损害。2,4-D是一种合成生长素衍生物，其作用为使正常的细 胞-激素体内稳态脱调节并阻碍平衡的、受控的生长；然而，这类除草剂的确 切作用模式仍未得到完全了解。定草酯(triclopyr)和氟草烟(fluroxypyr)是吡啶 基氧乙酸除草剂，它们也充当合成生长素。

这些除草剂对某些植物具有不同的选择性水平(例如双子叶植物比单子 叶植物更敏感)。不同植物的差异代谢是对选择性水平变化的一种解释。一般 地，植物缓慢代谢2,4-D，因此对2,4-D的植物响应变化可能更有可能通过靶 位置处的不同活性解释(WSSA,2002;Herbicide Handbook第8版;Weed  Science Society of America;Lawrence,KS第492页)。2,4-D的植物代谢通常 经由两阶段机制(通常是羟基化，接着是与氨基酸或葡萄糖缀合)发生(WSSA, 2002)。

随着时间推移，用2,4-D攻击的某些微生物群已经形成一种用于降解此 异生素的替代途径，这导致2,4-D的完全矿化。除草剂的连续应用选择出能 利用该除草剂作为碳源和能源进行生长的微生物，给予它们在土壤中的竞争 优势。出于此原因，目前配制的2,4-D具有相对较短的土壤半衰期，并且对 后续的作物没有显著的遗留影响。

一种已经对其降解2,4-D的能力进行过广泛研究的生物体是真养产碱杆 菌(Ralstonia eutropha)(Streber等；1987;Analysis,cloning,and high-level  expression of 2,4-dichlorophenixyacetic monooxygenase gene tfdA of Alcaligenes  eutrophus JMP134.J.Bacteriol.169:2950-2955)。编码矿化途径起始步骤中的 酶的基因是tfdA。参见美国专利No.6,153,401和GENBANK登录号M16730。 TfdA基因产物经由α-酮戊二酸依赖性双加氧酶反应催化2,4-D到二氯苯酚 (DCP)的转化(Smejkal等；2001.Substrate specificity of chlorophenoxyalkanoic  acid-degrading bacteria is not dependent upon phylogenetically related tfdA gene  types.Biol.Fertil.Sols 33:507-513)。DCP相比于2,4-D具有很少的除草剂活 性。已经在转基因植物中使用TfdA来在对2,4-D天然敏感的双子叶植物诸如 棉和烟草中赋予2,4-D抗性(Streber等；1989.Transgenic tobacco plants  expressing a bacterial detoxifying enzyme are resistant to 2,4-D.Bio/Technology 7:811-816和美国专利No.5,608,147)。

已经从土壤细菌中分离出编码能够降解2,4-D的酶的大量tfdA型基因， 并且将其序列存储于Genbank数据库中。许多tfdA同源物(大于85%氨基酸同 一性)与tfdA具有类似的酶特性。然而，存在许多如下的同源物，其与tfdA 具有显著较低的同一性(25-50%)，但具有与α-酮戊二酸双加氧酶Fe⁺²双加氧 酶有关的特征性残基。因此，这些趋异的双加氧酶的底物特异性是什么并不 明显。

一个与tfdA具有低同源性(31%氨基酸同一性)的独特例子是来自食酸代 尔夫特菌(Delftia acidovorans)的sdpA(Kohler,H.P.E.1999;Delftia acidovorans  MH:a versatile phenoxyalkanoic acid herbicide degrader;J.Ind Microbiol and  Biotech.23:336-340.Westendorf等；2002.The two enantiospecific  dichlorprop/α-ketoglutarate-dioxygenases from Delftia acidovorans MC1-protein  and sequence data of Rdpa and SdpA.Microbiol.Res.157:317-22.)。已经显示了 此酶催化(S)-滴丙酸(dichlorprop)(和其它(S)-苯氧丙酸)以及2,4-D(一种苯氧 乙酸)矿化中的第一步(Westendorfet等；2003.Purification and characterization  of the enantiospecific dioxygenases from Delftia acidovorans MC1 initiating the  degradation of phenoxypropionates and phenoxyacetate herbicides.Acta  Biotechnol.23:3-17)。

经植物密码子优化的芳氧基链烷酸酯双加氧酶基因AAD-12(其编码最初 从食酸代尔夫特菌分离的酶)在WO2007/053482(其通过提述并入本文)中在 作为除草剂抗性性状使用方面第一次描述。该性状赋予对2,4-D及对吡啶基 氧乙酸除草剂的耐受性。携带AAD-12基因的经转化大豆第一次报告于美国 临时专利申请No.61/263950，其通过提述并入本文。

为种植种子产品开发并销售重组DNA性状的公司制定、执行并遵守严格 的产品管理计划。这些管理计划需要对重组性状使用证实的定量和定性蛋白 质检测方法来追踪性状基因渗入(introgression)和种子生产活动，以及对谷粒 收获监测该性状。这些检测方法必须是容易且强力的，使得足以在GLP和非 GLP条件下使用。此外，方法必须是对用户友好的，使得足以田间的农民、 粮仓的粮商和边境的海关行政人员容易地采用。因此，强力的、高质量、用 户友好的蛋白质检测方法和商业试剂盒是有用且必需的。

尽管免疫测定法是本领域公知的，开发可再现地能够在实验室和田间背 景两者中检测一批植物组织中特定转基因产物的强力的、高质量、证实的 ELISA(酶联免疫吸附测定法)方法既不是不重要的，也不是常规的。更具挑战 的是，寻找特别适用于开发用于检测AAD-12转基因事件的侧向流动条ELISA 的抗体对。

发明概述

本发明提供了一组单克隆抗体(单抗)和生成它们的杂交瘤细胞系。所述系 按照布达佩斯条约的条款保藏于美国典型培养物保藏中心。令人惊讶地，这 些单抗完全适用于在多种植物和植物组织中检测AAD-12转基因事件基因产 物。本发明进一步提供了使用本发明的免疫球蛋白的定量和定性免疫测定法。

发明详述

本发明涵盖与AAD-12反应性的抗体和生成单抗的杂交瘤。下表列出了 杂交瘤系名称及其相应的ATCC保藏名称。

本发明还包括使用所述单抗分离或检测AAD-12的方法，包括：a)将所 述抗体固定化到表面上；b)使所述固定化抗体与含有AAD-12的混合物接触； c)自所述混合物分离与AAD-12结合的所述固定化抗体；并d)通过自所述固 定化抗体取出抗体结合的AAD-12来回收AAD-12。

本发明还包括使用要求保护的抗体鉴定生物学样品中AAD-12存在的方 法，包括：a)将所述抗体固定化到测定表面上；b)使所述测定表面与怀疑含有 AAD-12的液体接触，并用合适的溶液清洗所述测定表面；c)使所述测定表面 与用报告基团标记的抗-AAD-12抗体接触，并用合适的溶液清洗所述测定表 面；d)检测所述报告基团的存在。

本发明进一步包括用于定量测定在转基因植物，特别是大豆和棉植物中 表达的AAD-12酶的分析方法。用PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液从大豆样品提 取AAD-12蛋白。将提取物离心；收集水性上清液并稀释。在经抗AAD-12 多克隆或单克隆抗体包被的板的孔中，将稀释样品的等分试样与缀合有酶的 抗AAD-12单克隆抗体以夹心/三明治式ELISA形式一起温育。夹心对中的这 两种抗体都捕捉样品中的AAD-12蛋白。在温育期结束时，通过用PBS清洗 将未结合的试剂自板除去。通过将酶缀合物与酶底物一起温育，生成有色产 物来检测AAD-12的存在。由于AAD-12在抗体夹心物中结合，颜色显现水 平与样品中AAD-12的浓度成比例(即较低的蛋白质浓度导致较低的颜色显 现)。使用读板仪测量450nm处吸光度减去参照波长(诸如650nm)处吸光度。 使用二次回归方程从7个标准浓度估计校正曲线。此AAD-12ELISA对于植 物组织样品提取物中AAD-12的定量是足够特异且灵敏的。另外，使用标准 的Western印迹规程，可以使用本发明的抗体来确认AAD-12的存在。

针对感兴趣的蛋白质的抗体的制备是本领域中公知的。参见Galfre和 Milstein,Methods in Enzymology，第73卷，Academic Press,New York(1981); James W.Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic  Press,Orlando,Florida(1986);Current Protocols in Molecular Biolopy,F.M. Ausubel等编,Wiley Interscience,New York,(1987)。

为了制备与感兴趣的蛋白质反应性的抗体，首先必须富集或纯化蛋白质。 出于免疫目的，可以使用相对粗制的抗原性蛋白质制备物。然而，需要高度 纯化的蛋白质来精确测定杂交瘤是否生成寻求的单克隆抗体或者测定免疫血 清的抗体滴度。

一旦分离出AAD-12，可以通过本领域中公知的常规方法生成对AAD-12 特异性的抗体。在数周或数月的时段里对选择的宿主重复注射会引发免疫应 答，并且产生显著的抗AAD-12血清滴度。优选的宿主是哺乳动物物种，并 且更高度优选的物种是家兔、山羊、绵羊和小鼠。可以通过确立的方法加工 从这类经免疫的动物中抽出的血液以获得与AAD-12反应性的抗血清(多克隆 抗体)。然后，可以依照本领域中已知的技术通过吸附至AAD-12来亲和纯化 抗血清。可以使用本领域中已知的规程通过分离抗血清内的免疫球蛋白级分 进一步纯化经亲和纯化的抗血清。所得的物质会是与AAD-12反应性的异质 性免疫球蛋白群。

使用纯化的AAD-12容易制备抗AAD-12单抗。用于生成单抗的方法已 经实施数十年，并且是本领域中普通技术人员公知的。佐剂中AAD-12的重 复腹膜内或皮下注射会在大多数动物，特别是小鼠中引发免疫应答。将经过 超免疫的B淋巴细胞自动物取出，并与能够无限培养的合适的融合配偶细胞 系融合。众多哺乳动物细胞系是适用于生成杂交瘤的融合配偶。许多这类系 可购自ATCC和商业供应商。

一旦融合，将所得的杂交瘤在选择性生长培养基中培养1至2周。两种 公知的选择系统可用于从混合的杂交瘤培养物中消除未融合的骨髓瘤细胞或 骨髓瘤细胞间的融合物。选择系统的选择取决于免疫的小鼠品系和使用的骨 髓瘤融合配偶。可以使用由Taggart和Samloff，Science219,1228(1982)描述 的AAT选择系统；然而，由Littlefield,Science145,709(1964)描述的HAT(次 黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)选择系统由于其与小鼠细胞和上文提及的融合配偶 的相容性而是优选的。

然后，对用过的生长培养基筛选免疫特异性单抗分泌。酶联免疫吸附测 定法规程最好地适合于此目的；尽管，适合于大体积筛选的放射性免疫测定 法也是可接受的。必须实施设计为连续削减相当多数目的无关或不太期望的 培养物的多种筛选，以分离小百分比的本发明的单抗。使用商品化测定法对 分泌与AAD-12反应性的单抗的培养物测定同种型。

分泌寻求的抗AAD-12单抗的杂交瘤培养物应该经过数次亚克隆以建立 单克隆性和稳定性。用于亚克隆真核的、非粘附细胞培养物的公知方法包括 有限稀释、软琼脂糖和荧光激活细胞分选技术。在每次亚克隆后，必须对所 得的培养物再测定抗体分泌和同种型以确保已经建立稳定的抗体分泌培养 物。

可以将要求保护的抗AAD-12抗体固定化到表面，从而一些抗体结合位 点保持暴露，并且能够结合AAD-12。在过去的数十年里已经开发出用于固 定化抗体的一大批方案。可以通过直接将抗体与期望的表面共价偶联或者通 过将抗体与表面桥接来实现固定化。

抗体与基于多糖的珠诸如(Pharmacia,Pistcataway,NJ)的 CNBr和碳二亚胺偶联例示了与本发明一致的直接偶联方案。一般地，直接偶 联不以任何特定的方式对抗体定向；然而，一些类型的直接偶联能够在固定 化物质上对抗体可再现地定向。

优选的偶联方案将抗体定向为使其抗原结合区保持暴露。一种这类方案 利用存在于抗体重链上的天然碳水化合物。通过首先将碳水化合物模块氧化 为相应的醛，然后将醛与表面上的伯氨基团起反应，有可能以有利的取向连 接抗体。

许多类型的桥是有可能的，并且包括将抗体共价结合到固定化物质的小 的有机接头。这类间隔物臂是可接受的，并且优选地，在形成桥后不应与蛋 白质相互作用。

上述讨论决不意图限制本发明的范围。众多其它公知的用于将抗体与固 定化物质连接的方案与本发明是一致的。

公知的是，可以使用用报告基团标记的抗体来鉴定多种环境中抗原的存 在。用放射性同位素标记的抗体在放射性免疫测定法中已经使用了数十年， 以便以很大的精确性和灵敏性鉴定多种生物学流体中抗原的存在。新近，已 经在流行的ELISA中使用酶标记的抗体作为放射性标记的抗体的替代。

本发明的抗体可以结合至固定化物质诸如聚苯乙烯孔或颗粒，并在免疫 测定法中使用以测定测试样品中是否存在AAD-12。在本发明的此实施方案 中，使样品与免疫亲和表面接触，并允许温育。在清洗步骤后，通过使所述 表面与用报告基团标记的本发明的另一种抗体接触来检测已经结合至免疫亲 和表面的任何AAD-12。

用要求保护的抗体和测定方法使用侧向流动条或免疫层析条与本发明一 致。侧向流动测定法是本领域中公知的。参见例如US6,485,982。在此模式 中，可以使用侧向流动测试单独或与其它分析物同时定性或半定量检测 AAD-12。侧向流动测试是本文中描述的所有测试形式中使用最简单的，并且 特别可用于田间背景，在那里将植物材料快速提取到溶液中，并在侧向流动 条上测试。在此模式中，仅必需将侧向流动条放置于液体样品中或向侧向流 动条应用该液体样品，并在预定的时间后读出结果。所有侧向流动测试都应 当并入用于验证测试结果的规程性对照线或样品对照线。因此，出现两条线 指示阳性结果，而有效阴性测试仅产生对照线。如果仅出现测试线，或者如 果没有线出现，那么其是无效的。

典型的侧向流动测试条由四个主要构件组成；对其应用测试样品的样品 垫，含有与有色颗粒(通常为胶体金颗粒，或胶乳微球)缀合的本发明抗体的缀 合物垫；反应膜诸如疏水性硝酸纤维素或乙酸纤维素膜，在其上以横跨整个 膜的线形式固定化本发明的不同抗体作为捕捉带或测试线；以及，设计为通 过毛细管作用将样品拉过整个反应膜的废物池。

侧向流动条的各构件通常固定至惰性基底材料，并且可以以简单的浸渍 片形式或者在具有样品口和显示捕捉和对照带的反应窗的塑料铸件内呈现。 在该测定法实施方案的另一种模式中，将怀疑含有AAD-12的测试样品干燥 于表面上，形成固定化测试样品。然后，使经标记的本发明的抗体与该固定 化测试样品接触，并允许温育。如果该样品含有AAD-12，那么该经标记的 抗体将结合固定化的AAD-12。此方法也可以使用未标记的本发明的抗体， 接着是经标记的二抗来完成，所述经标记的二抗结合已经结合AAD-12的本 发明的抗体。在清洗后，测量固定化的测试样品以检测任何报告基团的存在。

报告基团通常是酶诸如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β-D-半乳糖苷酶。 合适的底物在与酶起反应时产生颜色变化。这样做时，可以使用分光光度计 定量颜色强度的测量。如果报告基团是放射性同位素，那么可以使用适当的 γ或β射线检测仪来定量报告基团。报告基团的强度与测试样品中AAD-12 的量正相关。

以下实施例会帮助描述如何实施本发明，并且会例示要求保护的抗 AAD-12抗体和测定法的特征。

实施例1

免疫原制备

在添加有稳定剂的基于PBST(具有0.05%Tween20的磷酸盐缓冲盐水， pH7.4)的缓冲液中自冻干的取自转基因大豆的叶组织提取AAD-12蛋白，并 在离心后在上清液中收集可溶性蛋白质。将上清液过滤，并允许可溶性蛋白 质结合苯基Sepharose^TM(PS)珠(GE Healthcare)。温育1小时后，用PBST清 洗PS珠，并用Milli-Q^TM水洗脱结合的蛋白质。添加氯化钠以提高电导率， 并将经PS纯化的蛋白质加载到已经与AAD-12特异性多克隆抗体缀合的抗 AAD-12免疫亲和柱上，所述AAD-12特异性多克隆抗体针对荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)中生成的重组AAD-12生成。自柱收集未结合的蛋 白质，并将该柱用预冷的PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH7.4)充分清洗。用3.5M NaSCN,50mM Tris^TM,pH8.0缓冲液从该柱洗脱结合的蛋白质。通过 SDS-PAGE和Western印迹检查微生物衍生的AAD-12和大豆衍生的AAD-12。

在微生物衍生的AAD-12中，如在经考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上显 现的，主要的蛋白质条带是约32kDa。正如预期的，相应的植物衍生的AAD-12 蛋白在大小上与微生物衍生的蛋白质相同。可预测地，植物纯化级分在 AAD-12蛋白外还含有少量非免疫反应性杂质。共纯化的蛋白质有可能通过 与柱基质的弱相互作用而保持在柱上。

微生物衍生的AAD-12和植物衍生的提取物在使用抗AAD-12多克隆抗 体的Western印迹上显示期望大小的阳性信号。在AAD-12Western印迹分析 中，没有在阴性对照(天然大豆)提取物中观察到免疫反应性蛋白质，而且在来 自转基因植物的样品中没有看到其它(alternate)大小的蛋白质(聚集体或降解 产物)。

实施例2

杂交瘤制备

用纯化的AAD-12免疫小鼠，并使用标准的融合技术来制备一组表达抗 AAD-12单克隆抗体的杂交瘤。从含有杂交瘤培养物的每个孔中无菌取出用 过的组织培养基样品，并使用下述抗体捕捉ELISA方法测定AAD-12反应性。 将微量滴定孔用纯化的AAD-12的1-10μg/mL溶液包被。清洗孔，将用过的 组织培养基样品置于孔中，并允许温育。清洗孔，添加辣根过氧化物酶标记 的山羊抗小鼠抗血清，并允许温育。清洗板，添加底物以显现颜色反应，并 对板读取OD(光密度)。将具有高OD读数的孔返回定位到含有杂交瘤的培养 孔。对AAD-12抗体阳性培养物连续筛选抗体产生以确保在扩充培养物时的 生长稳定性和抗体生成。实施数轮有限稀释克隆以建立每种培养物的真正单 克隆性。对抗体阳性克隆进行进一步的测定法，以确定每种抗体在目前要求 保护的定量检测方法（植物材料的田间使用）中使用的适合性。

实施例3

定量ELISA

本实施例是一种用于定量测定大豆组织中AAD-12的方法，其使用要求 保护的发明的抗体和方法进行。校正标准曲线定量范围是缓冲液中从 0.25ng/mL至10ng/mL。可以以1.0ng/mg定量限(LOQ)和0.5ng/mg检测限(LOD) 测定大豆种子、叶(V5和V10)、根和R3阶段的草料(forage)中的AAD-12蛋 白水平。

测试物质是经遗传修饰以表达AAD-12蛋白的代表性大豆组织样品和品 种Maverick的非转基因对照大豆。自温室收集下文列出的组织。

非转基因大豆样品的表

转基因大豆样品的表

此研究中采用的下述参照物质是在一种ELISA分析中作为校正标准品及 作为强化(fortification)材料使用的纯化的AAD-12蛋白、一种纯化的AAD-12 蛋白、和一种用于测试交叉反应性的纯化的AAD-12蛋白。

将所有测试和参照物质在温度监测型冰箱中贮存，并且仅为了样品制备 和分析而取出。简言之，用具有0.75%卵清蛋白(OVA)的PBST(含有0.05% Tween^TM20的磷酸盐缓冲盐水溶液)缓冲液(PBST/OVA)从大豆样品(V5、V10、 草料、和根)提取AAD-12蛋白。用含有0.1%Triton^TM X-100且含有0.05% Tween^TM20的PBS溶液(PBST)从大豆种子提取AAD-12蛋白。将提取物离心， 并收集水性上清液，稀释，并使用特异性AAD-12ELISA进行测定。将稀释 样品的等分试样在经抗AAD-12多克隆抗体包被的板的孔中以夹心ELISA形 式与缀合有酶的抗AAD-12单克隆539B470.2抗体一起温育。夹心对中的这 两种抗体捕捉样品中的AAD-12。在温育期结束时，通过用PBST清洗将未结 合的试剂从板除去。通过将抗体结合的酶缀合物与酶底物一起温育，生成有 色产物来检测AAD-12的存在。由于AAD-12在抗体夹心物中结合，颜色显 现水平与样品中AAD-12的浓度成比例(即较低的蛋白质浓度导致较低的颜色 显现)。通过添加酸性溶液来终止颜色反应，并使用读板仪测量450nm处吸光 度减去650nm处吸光度。使用二次回归方程从7个标准浓度估计校正曲线， 测定系数大于0.990。此AAD-12ELISA对于AAD-12蛋白的定量是高度特异 性的。

实施例4

测定法验证

在方法开发和预验证研究过程中独立地建立方法的初步定量范围。标准 浓度为给定的浓度点提供最低的均值百分比误差。用于测定每种组织中 AAD-12的检测限(LOD)和定量限(LOQ)基于测定参数(吸光度、背景、和线性 范围)、基质干扰和/或构成标准曲线的剂量凭经验限定。它们也得到遵循Keith 等的方法(Keith,L.H.,Crummett,W.,Deegan,J.,Jr.,Libby,R.A.,Taylor,J.K., Wentler,G.1983.Principles of Environmental Analysis,Anal.Chem.,55, 2210-2218)的统计学办法以及通过测试用5ng/mL(0.5ng/mg)AAD-12蛋白强 化的每种对照样品支持。

在本研究中测试此AAD-12ELISA对非靶蛋白Cry1F、Cry1Ac、 Cry34Ab1、Cry35Ab1、PAT以及AAD-1的交叉反应性。在PBST/OVA中以 1μg/mL和10μg/mL的浓度制备这些蛋白质。在同一块板上，产生AAD-12 标准曲线作为参照。自AAD-12标准曲线插入(interpolate)非靶蛋白的OD响 应，并使用下述公式计算百分比交叉反应性，%交叉反应性=100x(由AAD-12 标准曲线得到的测量浓度/靶蛋白的理论浓度)。

以不同浓度掺加阴性对照的每种大豆组织的样品提取物(基质)(1X、5X 和10X稀释)以创建标准曲线。自在同一块板上运行的未掺加的标准曲线插入 掺加基质的标准曲线。认为每个标准浓度水平的观察的(用于插入掺加基质的 标准浓度的未掺加的标准曲线)与理论的(掺加基质的标准曲线的浓度)均值之 间的差异大于15%指示潜在的基质效应。

对已知表达AAD-12的转基因大豆组织实施一系列5次提取。简言之， 向组织样品(15mg)添加1.5mL缓冲液，并提取，如上文描述的。在提取和离 心后，通过移液管取出提取的溶液。在第一次提取后，添加200μL缓冲液的 等分试样，并与样品混合，离心，取出上清液，并添加到第一次提取溶液。 向组织再加入1.5mL缓冲液，并重复提取过程。将此过程再重复3次以获得 5次连续提取。使用AAD-12ELISA测定每次提取中的AAD-12浓度。对每 种组织样品研究至少5个重复。通过相对于所有5份提取物中总AAD-12蛋 白比较第一次提取物中AAD-12蛋白来测定组织提取过程的表观效率。

通过测量AAD-12蛋白自掺有低(0.5ng/mg DW)、中点(1和4ng/mg DW) 和高(8ng/mg DW)水平AAD-12蛋白的阴性对照基质的回收来测定方法的准 确性。对每种浓度分析最少5个重复。该测定法的准确性以回收百分比指示。 认为67-120%的回收率是可接受的。

使用由两位分析人员在多天分析的强化大豆对照样品的结果来测定方法 的精确性。用三种AAD-12标准品水平(0.25ng/mg、0.5ng/mg、4ng/mg和8ng/mg) 强化对照样品提取物。在每块ELISA板上一式三份运行每种水平的强化提取 物。对每种样品计算均值回收浓度、标准差(stdev)和百分比变异系数(%CV)。

也对阳性样品(V5叶和草料(全植物))测试精确性。对每种样品计算均值 预测浓度、标准差(stdev)和百分比变异系数(%CV)。计算一天内和各天间的精 确性。

本实验的目的是验证AAD-12蛋白标准品和植物提取物中AAD-12蛋白 在ELISA中展现出类似的总体响应。这通过如下方式对所有转基因组织完成， 即评估来自从标准曲线的定量范围插入的单一提取物稀释液的结果的一致 性。对每种组织类型计算来自所有可量化稀释度的插入结果的变异系数。

对种子、叶、草料(全植物)和根组织测试假阳性和假阴性发生。对每种组 织分析15份未强化的对照样品和15份以0.25ng/mg强化的样品来测定假阳 性和假阴性率。当在已知无分析物的样品中发现处于或高于建立的LOD的残 留时，发生假阳性结果。当在以LOD强化的样品中没有检测到残留时，发生 假阴性。

使用SOFTmax PRO软件程序记录来自Molecular Dynamics微板阅读器 的ELISA读数。将浓度数据转移到SAS、JMP或Microsoft Excel以计算均值、 百分比误差、统计学均值、标准差、和%CV。

免疫测定法的检测限(LOD)定义为给出与零分析物样品的响应具有统计 学显著差异的响应的分析物浓度。测定法的定量限(LOQ)或工作范围一般定 义为可以以可接受的精确性程度测定的最高和最低浓度。在本研究中，用于 测定每种组织中AAD-12的靶LOD和LOQ基于测定参数(诸如吸光度、背景、 信噪比、和线性范围)、基质干扰、和标准曲线浓度凭经验限定。也通过标准 统计学方法来测定LOD和LOQ。遵循已建立的准则，使用来自0.5ng/mg回 收结果的标准差计算LOD和LOQ。LOQ以每种基质最少5份样品的分析结 果的标准差的10倍(10s)计算，而LOD以标准差的3倍(3s)计算。在下表中汇 总了每种组织的计算结果以及靶LOD和LOQ。

大豆组织中AAD-12ELISA的LOD和LOQ计算的汇总

对于所有大豆基质，靶LOD是0.5ng/mg。对于所有大豆基质，靶标LOQ 是1.0ng/mg。

对数种相关蛋白诸如Cry1F、Cry1Ac、Cry34Ab1、Cry35Ab1、PAT和 AAD-1测试交叉反应性。在对这些蛋白质测试的浓度(10,000ng/mL)没有观察 到交叉反应性。

在下表中汇总了基质测试的结果。

基质效应的汇总

“是”代表当所有7个标准浓度水平的观察值和理论值之间的均值百分 比误差大于15%时，标准曲线受到基质影响。“否”代表无基质效应或所有7 个标准浓度水平的观察值和理论值之间的均值百分比误差小于15%。

认为7个标准浓度水平中任一个的观察均值和理论均值之间大于15%的 差异指示基质效应。在1X掺加基质的水平在根中未观察到基质效应。对于 V5叶、V10叶、草料(全植物)，在5X掺加基质的水平，没有发现基质效应。 然而，在5X水平在种子中发现基质效应。对于大豆组织中的AAD-12量化， 对根推荐至少2X稀释；对V5叶、V10叶和草料推荐至少5X稀释；而对种 子推荐至少10X稀释。

测定样品中总AAD-12蛋白水平对于检查提取效率是至关重要的。用提 取缓冲液将阳性样品提取连续5次，并通过ELISA测定每份提取物中的 AAD-12蛋白浓度。表观提取效率基于相对于所有5次提取中AAD-12总量 的第一次提取中的AAD-12蛋白量。在下表中显示了自大豆组织提取AAD-12 蛋白的效率。

自大豆组织提取AAD-12的效率的汇总

草料(全植物)、根、种子、V5叶和V10叶的提取效率在85.8-97.2%的范 围内。

在下表中显示了当以等于LOQ、标准曲线的中点和高点的水平强化时， 自所有组织回收AAD-12的均值水平。

准确性结果的汇总

以LOQ水平或之上掺加，V5叶、V10叶和种子为均值回收67-100%(在 67-120%的规定内)，百分比变异系数(%CV)处于或低于16%。

使用含有4种水平的AAD-12蛋白的V5叶和草料(全植物)提取物来检查 测定法精确性和效能(ruggedness)。所述水平为8ng/mg、4ng/mg、0.5ng/mg和 0.25ng/mg。测定法的一天内精确性对于以8、4、0.05和0.25ng/mg强化的 V5叶提取物分别为小于或等于6.3%、10.8%、9.6%和15.0%。测定法的一天 内精确性对于以8、4、0.5和0.25ng/mg强化的草料(全植物)提取物分别为小 于或等于3.5%、13.1%、10.1%和10.9%。还对阳性V5叶和草料样品测试测 定法耐用性。测定法的一天内精确性对于V5叶和全植物分别为小于或等于 9.7%和19.7%。

所有天数和分析者间的测定法间精确性对于以8、4、0.5和0.25ng/mg强 化的V5叶提取物分别为4.6%、10.1%、6.4%和12.9%。所有天数和分析者间 的测定法间精确性对于以8、4、0.5和0.25ng/mg强化的草料提取物分别为 6.0%、10.5%、6.4%和10.1%。所有天数和分析者间的测定法间耐用性对于阳 性V5叶和草料分别为11.3%和14.1%。

使用来自AAD-12阳性组织的提取物的多至8次连续稀释证明AAD-12 ELISA中标准品和测试物质响应的等效性。对于每种组织提取物，5次或更 多次稀释落入标准曲线的定量范围内，并且量化结果的%CV小于20%。

分析未强化的对照样品(基质空白)和以0.25ng/mg(LOD=0.5ng/mg)强化 的样品来测定假阳性和假阴性率。没有来自未强化的对照样品的假阳性，并 且没有自此研究中分析的LOD强化样品报告的假阴性。

总之，所述方法在1.0至8.0ng/mg干重(DW)的浓度范围里得到验证，并 且具有经过验证的在所有大豆组织中1.0ng/mg DW定量限(LOQ)和在所有大 豆组织中0.5ng/mg DW检测限(LOD)。从所有组织中以可接受水平回收 AAD-12蛋白。在与先前研究中测试的非靶蛋白相比时，经过验证的测定法 对AAD-12蛋白是特异性的。对于大豆组织中的AAD-12蛋白定量，对根推 荐2X或更大的稀释，对V5叶、V10叶和草料推荐5X或更大的稀释，而对 种子推荐10X或更大的稀释。另外，从所有大豆组织中有效提取AAD-12蛋 白。显示该测定法具有可接受的准确性和精确性，并且低于靶标LOD没有看 到假阳性或假阴性结果。已经证明了此AAD-12ELISA方法适用于大豆组织 中AAD-12蛋白的定量测量。