鉴别和定量口蹄疫双价苗以及多价苗中抗原的血清型的一种方法

摘要

本发明提供了鉴别和定量口蹄疫双价苗以及多价苗中抗原的血清型的一种方法，通过样品处理提取疫苗破乳后水相中口蹄疫病毒RNA，应用荧光定量PCR检测方法来扩增样品中不同血清型的口蹄疫病毒RNA，进行鉴别和定量检测，其中，O型口蹄疫病毒引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：1~3所示，AsiaI型口蹄疫病毒引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：4~6所示，A型口蹄疫病毒引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：7~9所示。本发明的方法具有灵敏性高、稳定性高、特异性好、可以分别准确定量样品中不同型的抗原等特点；具有检测范围广的特点，在100～1010拷贝范围内具有良好的线性关系，检测范围可以达到10个数量级。

说明书

技术领域

本发明属于检验技术领域，具体是一种鉴别和定量口蹄疫双价苗以及多价苗中抗原的血 清型的检测方法。

背景技术

口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种严重危害偶蹄 动物的疫病，被OIE列为A类传染病之首。口蹄疫病毒培养物中可以分离出不同密度的粒子， 主要有四种：完全病毒(146S)、空衣壳(75S)、12S蛋白质亚单位(12S)、病毒感染相关成分(VIA 抗原4.5S)。在动物免疫中，刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞有关的主要是完全病毒颗粒 146S抗原，该抗原含有口蹄疫病毒所有的中和位点，是口蹄疫病毒的有效抗原成分，能刺激 机体产生坚强的体液免疫和细胞免疫。

口蹄疫疫苗中146S抗原的含量直接决定了疫苗的质量，因此在国外口蹄疫疫苗生产厂家 中，口蹄疫146S抗原的检测是重要的一个环节，这些厂家一般通过层析的方法提纯口蹄疫病 毒，并使用超速离心对146S抗原进行定量，根据定量的结果对病毒液稀释后做成146S的抗 原含量为1μg/mL～10μg/mL成品疫苗，该疫苗可产生良好的免疫效果。用蔗糖密度梯度离心 测量法对146S抗原定量是一种标准的方法，但是操作较为复杂，仪器设备要求较高，不能进 行批量的抗原检测，此外，还可以用蛋白层析分析法、荧光定量PCR和间接夹心Elisa等进 行疫苗中抗原含量的定量。

自PCR技术问世以来，国内外的研究者开始用该方法来检测动物不同组织中的FMDV， 使检测的过程大大缩短，准确性进一步提高。Taqman探针荧光PCR技术于1996年由美国 Applied Biosystems公司推出，该技术在原理上较SYBR GREENⅠ更为严格，所得数据更为 准确。国内外已经有使用荧光RT-PCR检测FMDV的报道，该技术以其特异性强、灵敏度高、 速度快等优点在FMDV定性和定量检测等方面得到广泛应用，并且已经成为当前FMDV快 速检测的主要方法。

由于口蹄疫O型、亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗以及O型、亚洲Ⅰ和A型三价灭活苗含有不 同型的口蹄疫抗原，而蔗糖密度梯度离心测量法只能定量疫苗中各血清型146S抗原的总体含 量，而不能很好的将O型、亚洲Ⅰ型和A型抗原的含量相区分，为了进一步明确成品疫苗中 各型抗原的实际含量情况，需要在现有工作的基础上，建立一种破乳后水相抗原分型定量的 方法，从而完善口蹄疫双价以及多价成品疫苗效力评价标准。

发明内容

本发明的目的是提供鉴别和定量口蹄疫双价苗以及多价苗中抗原的血清型的一种方法， 以克服现有技术不足，实现破乳后水相抗原分型定量，从而完善口蹄疫双价以及多价成品疫 苗效力评价标准。

本发明提供的鉴别和定量口蹄疫双价苗以及多价苗中抗原的血清型的一种方法，通过样 品处理提取疫苗破乳后水相中口蹄疫病毒RNA，应用荧光定量PCR检测方法来扩增样品中 不同血清型的口蹄疫病毒RNA，进行鉴别和定量检测，其中，O型口蹄疫病毒引物和探针的 序列分别如SEQ ID NO：1~3所示，AsiaI型口蹄疫病毒引物和探针的序列分别如SEQ ID NO： 4~6所示，A型口蹄疫病毒引物和探针的序列分别如SEQ ID NO：7~9所示。

优选地，所有探针5’端标记的荧光基团都为FAM，3’端淬灭基团都为TAMAR。

优选地，以所述口蹄疫病毒RNA为模版，在3个PCR反应管中分别加入不同型特异性 引物和探针，进行RT-PCR扩增。

可以使用TAKARA公司的一步法RT-PCR试剂盒进行扩增；

提取所述口蹄疫病毒RNA可以包括以下步骤：

（1）取100体积份ISA206佐剂乳化的口蹄疫疫苗，放入分液漏斗中，加入10～12体 积份分析纯正戊醇，充分振荡1分钟以上混匀；

（2）将分液漏斗放入4°C冰箱，静置30分钟以上，可见油、水分离；分离出下层水相， 其中含有口蹄疫抗原；

（3）取水相，使用Invitrogen公司的TRIzol试剂盒提取RNA。

优选地，所述实时荧光定量RT-PCR反应体系为25μL，每条特异性引物和特异性探针终 浓度为0.2μmol/μL；

优选地，O型和A型口蹄疫病毒实时荧光定量RT-PCR反应条件为，42℃反转录10min， 94℃预变性2min，94℃变性5s，55℃退火30s，40个循环。

优选地，AasiI型口蹄疫病毒实时荧光定量RT-PCR反应条件为，42℃反转录10min，94℃ 预变性2min，94℃变性5s，65℃退火30s，40个循环。

优选地，进行荧光定量PCR时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为定量标准质粒，阴 性对照为灭菌水，若CT值小于35.0，且出现典型的S型扩增曲线，则判定为阳性结果；若 CT值在35.0～40.0之间，则判定为可疑结果，重复检测一次，若仍在此范围内，则判定为阴 性，若无扩增信号，则判定为阴性结果。

优选的计算公式如下：

O型定量PCR计算公式为：Y=10^{(-3.24x+44.82)}；

A型定量PCR计算公式为：Y=10^{(-3.82x+53.35)}；

AsiaI型定量PCR计算公式为：Y=10^{(-3.94x+54.26)}；

Y：样品中抗原拷贝数X：样品扩增CT值。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：与蔗糖密度梯度离心测量法相比，本发 明的方法具有灵敏性高、稳定性高、特异性好、可以分别准确定量样品中不同型的抗原等特 点；本发明的方法可以同时进行大量样品的检测，具有高通量性；与蔗糖密度梯度离心测量 法相比，本发明的方法无需大型贵重的离心设备，节省了人力和物力；本检测方法具有检测 范围广的特点，在100～10¹⁰拷贝范围内具有良好的线性关系，检测范围可以达到10个数量 级。

附图说明

图1O型荧光定量PCR标准曲线；

图2AsiaI型荧光定量PCR标准曲线；

图3A型荧光定量PCR标准曲线；

图4O型荧光定量PCR特异性分析；

图5AsiaI型荧光定量PCR特异性分析；

图6A型荧光定量PCR特异性分析。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式做进一步说明。其中一种实施方式包括如下步骤：

步骤一，检索Genbank上的口蹄疫病毒基因序列，用生物信息学的方法，经过比对分析， 分别找到O型、亚洲Ⅰ和A型的特异性保守区，以保守区为靶目标，用引物设计软件Primer Express2.0，设计不同型的特异性引物和探针，扩增基因片段；

步骤二，利用步骤一所得基因片段构建重组质粒；

步骤三，疫苗样品处理和提取样品的RNA；

步骤四，按照常规荧光定量PCR检测方法检测疫苗样品中的抗原含量。

步骤一和步骤四中，扩增时所使用的引物和探针为：

（1）O型口蹄疫病毒引物和探针

上游引物（SEQ ID NO：1）：5’-AACCCTCGGACGAACATGAC-3’

下游引物（SEQ ID NO：2）：5’-CGATGTTGGCGTACACCTTGAT-3’

探针（SEQ ID NO：3）：FAM-5'-TACGACCAGTACAAGGTWCACAA-3'-TAMAR

（2）AsiaI型口蹄疫病毒引物和探针

上游引物（SEQ ID NO：4）：5’-CTGCCCACTTCCTTCAACTACG-3’

下游引物（SEQ IDNO：5）：5’-AGTATGTTTCCGCACGCTTCA-3’

探针（SEQ ID NO：6）：FAM-5'-TGAAGGCCGACACCATCACGGAGCT-3'-TAMAR

（3）A型口蹄疫病毒引物和探针

上游引物（SEQ ID NO：7）：5’-CTTCAACTACGGCGCGATTC-3’

下游引物（SEQ ID NO：8）：5’-AGAGCTCGGCACGCTTCATG-3’

探针（SEQ ID NO：9）：FAM-5'-GCCACGGAGATCCAAGAGCTCCTC-3'-TAMAR

步骤二中，所述重组质粒使用的载体是pGEM-Teasy。

步骤三中，所述的RNA提取方法是使用Invitrogen公司的TRIzol试剂提取,操作步骤按 试剂盒说明书进行。

步骤四中，所述荧光定量PCR检测方法中，O型和A型口蹄疫病毒实时荧光定量RT-PCR 反应条件为，42℃反转录10min，94℃预变性2min，94℃变性5s，55℃退火30s，40个循环; AsiaI型口蹄疫病毒实时荧光定量RT-PCR反应条件为，42℃反转录10min，94℃预变性2min， 94℃变性5s，65℃退火30s，40个循环。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例 如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中 所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

步骤一，设计引物和Taqman探针

检索Genbank上的口蹄疫病毒基因序列，用生物信息学的方法，经过比对分析，分别找 到O型、亚洲Ⅰ和A型的特异性保守区，以保守区为靶目标，用引物设计软件Primer Express2.0，设计不同型的特异性引物和探针；探针5′端荧光报告基团是FAM，3′端的荧光淬 灭基团为TAMRA。序列如下：

（1）O型口蹄疫病毒引物和探针

上游引物（SEQ ID NO：1）：5’-AACCCTCGGACGAACATGAC-3’

下游引物（SEQ ID NO：2）：5’-CGATGTTGGCGTACACCTTGAT-3’

探针（SEQ ID NO：3）：FAM-5'-TACGACCAGTACAAGGTWCACAA-3'-TAMAR

（2）AsiaI型口蹄疫病毒引物和探针

上游引物（SEQ ID NO：4）：5’-CTGCCCACTTCCTTCAACTACG-3’

下游引物（SEQ IDNO：5）：5’-AGTATGTTTCCGCACGCTTCA-3’

探针（SEQ ID NO：6）：FAM-5'-TGAAGGCCGACACCATCACGGAGCT-3′-TAMAR

（3）A型口蹄疫病毒引物和探针

上游引物（SEQ ID NO：7）：5’-CTTCAACTACGGCGCGATTC-3’

下游引物（SEQ ID NO：8）：5’-AGAGCTCGGCACGCTTCATG-3’

探针（SEQ ID NO：9）：FAM-5'-GCCACGGAGATCCAAGAGCTCCTC-3′-TAMAR

步骤二，定量标准质粒的构建与制备

定量标准质粒的构建

以提取的口蹄疫病毒RNA（O型、A型和AsiaI型三种血清型）为模板，分别应用O型、 A型和AsiaI型特异性引物和TAKARA公司的一步法RT-PCR试剂盒进行扩增，RT-PCR反 应体系为25μL，每条特异性引物终浓度为0.2μmol/L，模板4μL；反应条件为42℃,10min， 94℃2min，94℃5s，55℃30s，40个循环。PCR反应结束后，取20μLPCR产物于2%琼脂糖 凝胶中进行电泳鉴定。PCR产物经电泳鉴定后，通过胶回收纯化目的片段，然后将目的片段 与pGEM-Teasy载体连接，将其转化JM109感受态细胞，进行测序验证。

定量标准质粒的制备

定量重组标准质粒用碱裂解法进行提纯，根据紫外分光光度计测定OD260和OD280值 计算质粒浓度，并换算为质粒拷贝数。

质粒浓度（μg/μL）=OD260×稀释倍数×50/1000；

质粒拷贝数=质粒浓度×6.02×10²³mol/1000M，M：代表质粒分子量；

步骤三，疫苗样品的处理以及病毒RNA的提取

疫苗样品破乳处理：取100ml ISA206佐剂乳化的商品牛口蹄疫（O型、A型和AsiaI型） 三价疫苗，放入250ml分液漏斗中，加入10～12ml分析纯正戊醇，充分振荡1分钟以上混匀； 将分液漏斗放入4°C冰箱，静置30分钟以上，可见油、水分离；分离出下层水相约34ml， 其中含有口蹄疫抗原。

抗原水相中口蹄疫病毒RNA的提取：取200μL抗原水相，使用Invitrogen公司的TRIzol 试剂提取RNA,操作步骤按试剂盒说明书进行；

步骤四，荧光定量PCR方法的建立和优化

（1）荧光定量PCR反应条件的优化

通过对反应体系中不同的引物浓度、Taqman探针浓度、反应条件中不同的退火温度等试 验结果进行比较，最后选择反应灵敏度高、本底荧光信号低、具有典型S型扩增荧光信号曲 线、扩增效率接近于1的最佳反应体系。

O型口蹄疫病毒定量PCR最佳反应体系和反应条件为：

反应条件采用一步法，42℃反转录10min，94℃预变性2min，94℃变性5s，55℃退火 30s，40个循环。

经优化后确定的25μL最佳反应体系为：

AsiaI型口蹄疫病毒定量PCR最佳反应体系和反应条件为：

反应条件采用一步法，42℃反转录10min，94℃预变性2min，94℃变性5s，65℃退火 30s，40个循环。

经优化后确定的25μL最佳反应体系为：

A型口蹄疫病毒定量PCR最佳反应体系和反应条件为：

反应条件采用一步法，42℃反转录10min，94℃预变性2min，94℃变性5s，55℃退火 30s，40个循环。

经优化后确定的25μL最佳反应体系为：

（2）荧光定量PCR标准曲线的建立

用RNase dH₂O将三种血清型的定量标准质粒稀释至1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、 1×10⁴、1×10³copies/μL，分别用最佳体系和最佳反应条件进行扩增反应，检测结束后荧光PCR 仪自动绘制标准曲线（图1、图2、图3）。

（3）特异性分析

以O型、A型和AsiaI型三种血清型口蹄疫病毒RNA为模板，分别进行O型定量PCR、 A型定量PCR、AsiaI型定量PCR特异性分析，反应按照最佳反应体系和条件进行。结果显 示该检测体系特异性良好，非目标病毒核酸没有扩增曲线而目标病毒有良好的扩增曲线（图 4、图5、图6）。

（4）稳定性分析

选取4个不同浓度的定量标准质粒，分别进行批间重复检测和批内重复检测，通过检测 其CT值的变异系数进行稳定性的评价，变异系数在1%范围内认为是可靠的，结果显示批内 和批间变异系数均小于1%，所以可以判断本检测方法稳定性良好。

（5）结果判定及病毒的定量

进行荧光定量PCR时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为定量标准质粒，阴性对照为 灭菌水，若CT值小于35.0，且出现典型的S型扩增曲线，则判定为阳性结果；若CT值在 35.0～40.0之间，则判定为可疑结果，重复检测一次，若仍在此范围内，则判定为阴性。若 无扩增信号，则判定为阴性结果；

样品病毒定量，根据建立的定量标准曲线计算其病毒含量。

O型定量PCR计算公式为：Y=10^{(-3.24x+44.82)}；

A型定量PCR计算公式为：Y=10^{(-3.82x+53.35)}；

AsiaI型定量PCR计算公式为：Y=10^{(-3.94x+54.26)}；

Y：样品中抗原拷贝数X：样品扩增CT值。

通过计算公式可以得出疫苗样品中O型抗原含量为2.53×10¹³个拷贝/ml，A型抗原含量 为5.68×10¹²个拷贝/ml，AsiaI型抗原含量为1.26×10¹³个拷贝/ml。