紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因及编码的蛋白和应用

摘要

本发明公开了一种由紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因编码的蛋白，其中，该蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有γ-生育酚甲基转移酶活性的氨基酸序列。本发明还涉及该蛋白的编码基因，以及含有该基因的表达载体和细胞，同时还涉及一种培育α-生育酚含量高的紫花苜蓿的方法和它们的应用。本发明提供的紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因(MSTMT)在紫花苜蓿中的表达可以显著提高紫花苜蓿中α-生育酚的含量。该基因的发现为提高主要牧草植物(特别是豆科植物，如紫花苜蓿)中α-生育酚的含量提供了基因资源，在基因工程改良牧草的研究中将发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶相关基因，还涉及由该基 因编码的蛋白，以及含有所述紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因的表达载体 和细胞，同时还涉及一种培育紫花苜蓿的方法，以及紫花苜蓿γ-生育酚甲基 转移酶基因及其编码的蛋白和含有该基因的表达载体及细胞在培育高α-生 育酚含量的植物中的应用。

背景技术

维生素E是一类人体所必需的脂溶性维生素，具有重要的生理功能。它 能够清除脂质过氧化所产生的自由基而稳定保护生物膜的脂双层，使细胞免 受过氧化物的伤害。因而被作为一种有效的抗氧化剂广泛地应用在医药、食 品、饲料等行业中。大量动物实验表明，在饲料中添加维生素E具有提高动 物免疫力、改善肉质、提高动物的繁殖性能、缓解动物应激反应等显著效果。

维生素E的生产主要通过化学合成和天然提取获得。化学方法合成的产 品主要以醋酸酯的形式存在，副产物多且生物活性低。天然维生素E主要存 在于植物中，在生理活性和安全性上明显优于合成维生素E。

天然维生素E由8种生育酚异构体组成。根据侧链饱和度可分为生育酚 和三烯生育酚两大类。根据芳香环上甲基数目和位置的不同又分为α、β、γ、 δ-生育酚和α、β、γ、δ-三烯生育酚。这8种生育酚异构体在植物中的含量 及相对活性均不尽相同，α-生育酚的生物活性最高，并可被人体和动物体优 先吸收和利用，这是由于在肝脏中的运送α-生育酚的转移蛋白优先结合α- 生育酚的特性所决定的。但是α-生育酚在植物中的含量相对较低，因此，大 幅度提高植物(特别是牧草植物)中高活性α-生育酚含量，将具有良好的社 会效益和经济效益。

研究植物维生素E合成途径发现，通过甲基转移作用将γ-生育酚转化为 α-生育酚的γ-生育酚甲基转移酶，可提高植物中α-生育酚的含量和比例。目 前γ-生育酚甲基转移酶基因已经从拟南芥、蓝藻等中克隆得到，但至今未见 从牧草植物(特别是苜蓿)中克隆分离到γ-生育酚甲基转移酶基因，并将其 转化到牧草植物中来提高α-生育酚含量的报道。

紫花苜蓿是我国乃至世界上最重要的豆科牧草，被誉为“牧草之王”。如 果能够克隆得到源自紫花苜蓿的γ-生育酚甲基转移酶基因，并将其转到包括 紫花苜蓿在内的牧草植物中，将能够在提高动物免疫力、改善肉质、提高动 物的繁殖性能等方面具有重要的意义。

发明内容

本发明基于对紫花苜蓿中维生素E合成途径相关的分子生物学机制的 研究，一方面提供了紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因及该基因编码的蛋 白，另一方面还提供了含有所述紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因的表达载 体和细胞，以及培育高α-生育酚含量的紫花苜蓿的方法，还提供了它们的应 用。

本发明提供了一种紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因编码的蛋白，其 中，该蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ  ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加 后仍具有γ-生育酚甲基转移酶活性的氨基酸序列。

本发明还提供了一种紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因，其中，该基因 具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No：2 所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明还提供了一种表达载体，其中，该表达载体含有本发明提供的紫 花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因。

本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有本发明提供 的紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因。

本发明还提供了一种培育紫花苜蓿的方法，其中，该方法包括将本发明 提供的紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因导入到紫花苜蓿细胞中，得到α- 生育酚含量高的紫花苜蓿细胞及转基因植株。

本发明还提供了本发明提供的紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因、及其 编码的蛋白、含有所述基因的表达载体、含有所述基因的转基因细胞在培育 α-生育酚含量高的植物中的应用。

本发明从紫花苜蓿中克隆的γ-生育酚甲基转移酶基因为提高主要牧草 植物(特别是豆科植物，如紫花苜蓿)中α-生育酚的含量提供了基因资源， 在基因工程改良牧草植物的研究中将发挥重要作用。

附图说明

图1显示了实施例1中对紫花苜蓿植株进行农杆菌介导的γ-生育酚甲基 转移酶基因转化所用的插入有γ-生育酚甲基转移酶基因的pCAMBIA1302载 体的结构。

具体实施方式

本发明提供了一种由紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因编码的蛋白，其 中，该蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ  ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加 后仍具有γ-生育酚甲基转移酶活性的氨基酸序列。优选情况下，该蛋白具有 SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。

相应地，本发明还提供了一种紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因，其中， 该基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID  No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。优选地，该基因具有SEQ ID No： 1所示的核苷酸序列。

本发明提供的紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因是发明人通过以下方 法筛选得到的：

根据截型苜蓿中已经克隆的γ-生育酚甲基转移酶基因(Genbank登记号 为：BT051703)保守域设计引物(RT-PCR引物为：F：5′-TCTCAGCCCTGTT CAAGC-3′；R：5′-CAAAGGGAGACCAATCTG-3′)，从紫花苜蓿(Medicago  sativa L.cv.Zhongmu No.1，中苜一号，北京中畜东方草业科技有限责任公司) 中进行扩增，回收预期大小为400bp的片段(跑电泳后回收此长度的片段)， 将回收的片段连入PMD18-T Vector(Takara)，测序：测序结果在NCBI的非 冗余蛋白数据库中进行BLASTx分析；将分析结果中与γ-生育酚甲基转移酶 类有关的2条序列用DNAstar进行连续开放阅读框(ORF)分析，发现1条 具有连续的ORF(长度为404bp)；用该序列设计特异引物(MsTMT-RT-F： 5′-ACGGCCAGTTTGATCTAGTGT-3′；MsTMT-RT-R：5′- CTTCATTCGGGGCAAG-3′)，且利用该序列设计5’RACE引物与3’RACE 引物，以紫花苜蓿叶片组织为材料，获得其全长序列，具体步骤为：

利用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，USA)分别对 该EST序列进行5’RACE和3’RACE克隆，最后获得了该基因全长序列(SEQ  ID NO：1)。其中，基因克隆的方法为分子生物学领域的常规实验操作，具 体方法如下：

RACE-ready cDNA的合成

A.准备基本液体：2.0μl 5×第一链缓冲液，1.0μl DTT(20mM)，1.0μl dNTP Mix(10mM)；

B.制备用于5’RACE的cDNA：2.75μl RNA，1.0μl 5′-CDS Primer A；

制备用于3’RACE的cDNA：3.75μl RNA，1.0μl 3′-CDS Primer A；

C.将准备好的液体放于72℃3分钟，再放于42℃冷却2分钟，短暂 离心收集液体；

D.向B中5’RACE的cDNA中加入1μl的SMARTer IIA oligo；

E.制备5’RACE和3’RACE-Ready cDNA反应液：4.0μl的步骤A得到 的缓冲液，0.25μl RNA酶抑制剂(40U/μl)，1.0μl SMARTScribe逆转录酶 (100U)；

F.将步骤E中的液体加入到步骤C中，完成3’RACE-Ready cDNA合成 反应液的制备；将步骤E中的液体加入到步骤D中，完成5’RACE-Ready  cDNA合成反应液的制备；

G.将制备好的反应液放于42℃中90分钟，最后70℃中10分钟，完 成Ready-cDNA的合成。

cDNA末端的快速合成

H.准备基本液体：34.5μl PCR用水，5.0μl 10×Advantage 2PCR缓冲 液，1.0μl dNTP Mix(10mM)，1.0μl 50×Advantage 2聚合酶Mix；

I.制备用于5’RACE的PCR反应：2.5μl 5’RACE-ready cDNA，5.0μl UPM(10×)，1.0μl GSP1 5′-GTTGTAGGGATTCTTCATTCGGGGC-3′；41.5μl 的步骤H中制备的缓冲液。

制备用于3’RACE的PCR反应：2.5μl 3’RACE-ready cDNA，5.0μl UPM(10×)，1.0μl GSP2 5′-TTGTTGGTGAGTTAGCACGGGTAGC-3′；41.5 μl的步骤H中制备的缓冲液。

RACE反应体系为：94℃30秒，72℃3分钟，共5个循环：94℃30秒， 70℃3分钟，72℃3分钟，共5个循环；94℃30秒，68℃30秒，72℃3分 钟，共20个循环。

取PCR产物于1.0重量％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，回收目的条带， 连接回收产物与pEGM T-Easy载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提 取质粒并测序，进行序列拼接，结果显示该基因具有SEQ ID：No：1所示 的核苷酸序列(1306bp)。

本发明还提供了一种表达载体，其中，该表达载体含有具有以下核苷酸 序列的基因：SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID No：2所 示的氨基酸序列的核苷酸序列。本发明提供的基因可以通过现有的方法构建 到表达载体中，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型 启动子。

本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有具有以下核 苷酸序列的基因：SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID No： 2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。所述细胞可以为单子叶植物的细胞，也 可以为双子叶植物的细胞，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄或苜蓿等的细 胞。优选为苜蓿细胞，更优选为紫花苜蓿细胞。

本发明还提供了一种培育α-生育酚含量高的紫花苜蓿的方法，其中，该 方法包括将具有SEQ ID No：1所示的核苷酸的基因导入到紫花苜蓿细胞中， 得到α-生育酚含量提高的紫花苜蓿细胞及转基因植株。

根据本发明所述将有本发明提供的基因导入到紫花苜蓿细胞中的方法 为基因工程领域常规的方法，例如可以通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载 体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化 植物细胞或组织，之后将转化的植物细胞培育成植株。

本发明还提供了本发明提供的紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因、及其 编码的蛋白、含有所述基因的表达载体、含有所述基因的转基因细胞在培育 α-生育酚含量高的植物中的应用。优选地，所述植物为紫花苜蓿。

实施例1

农杆菌介导的γ-生育酚甲基转移酶(MsTMT)基因转化紫花苜蓿植株

一、材料与试剂

1、植物材料

供试苜蓿品种为紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu No.1，中苜 一号，北京中畜东方草业科技有限责任公司)。

发芽7天的无菌苗子叶为遗传转化的受体材料。

2、农杆菌菌株和质粒载体

所用的农杆菌菌株为根癌农杆菌：LBA4404(北京天恩泽基因科技有限 公司)

农杆菌培养基：

质粒载体：pCAMBIA1302(购自上海希匹吉生物技术有限公司)。将 MsTMT基因插入到pCAMBIA1302中，具体步骤为：设计5’端包含NcoI酶 切位点的上游引物和SpeI酶切位点的下游引物(F：5′-CATGCCATGGATG GCGGCGGTGAAAGAAGC-3′，R：5′-GGACTAGTTCATTGACCCTCTGCA TTTTCAGGC-3′，用该引物从cDNA模板中扩增MsTMT的全长阅读框，1302 载体和全长片段经NcoI和SpeI双酶切后回收产物，经T4 DNA连接酶连接， 得到插入有MSTMT基因的pCAMBIA1302载体，其含有CaMV35s启动子、 MSTMT基因(SEQ ID NO：1)以及一个潮霉素抗性筛选标记，进行遗传转 化的时候可通过潮霉素筛选初步鉴定获得的转基因植株。含有目的片段的质 粒载体的结构图1所示。

将插入有MSTMT基因的pCAMBIA1302载体导入到根癌农杆菌 LBA4404中，具体步骤如下：

A.向100μl农杆菌感受态细胞LBA4404中加入约1μg质粒DNA，轻轻 混匀，冰浴30min；

B.于液氮中速冻1min，立即置于37℃水浴中温育5min；

C.加入800μl YEB液体培养基，28℃150rpm培养4-6h；

D.菌体涂布于含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin Sulfate)和100mg/L 链霉素(streptomycin)的YEB选择平板上，28℃倒置培养两天。

E.挑取单菌落，接种于YEB液体培养基中(含50mg/L Kan和100mg/L Str)，28℃震荡培养过夜。

提取导入有MSTMT基因的农杆菌的质粒并测序，结果显示导入基因的 核苷酸序列与SEQ ID NO：1一致，表明含有目的基因MSTMT的表达载体 没有发生丢失现象。

二、实验方法

1、农杆菌的培养

将导入有MSTMT基因的农杆菌于含有50mg/LKan和100mg/L Str的固 体培养基上划平板，放于培养箱内，28℃培养。两天后，从平板上挑取单菌 落，接种于含有50mg/L Kan和100mg/L Str的20ml YEB液体培养基中， 180rpm，28℃培养。用摇好的菌液划平板，28℃培养，待长出单菌落后，将 平板放于4℃保存。

2、MSTMT基因的转化

在平板上挑取单菌落，接种于20ml含有50mg/L Kan和100mg/L Str的 YEB液体培养基内，在恒温摇床上于28℃，180rpm培养。两天以后取少量 菌液，以1∶50-1∶100的比例稀释到含50μg/ml Kan和100μg/ml Str的YEB液 体培养基中，28℃培养6-12h至对数生长期。将菌体收集到离心管中，4,000 rpm离心10min富集菌体，弃上清，再用约20ml不含抗生素的改良的SH液 体培养基重悬菌体，使菌液的OD₆₀₀值为0.6-0.8，待用。

3、外植体的准备：

将4-5天大小的紫花苜蓿子叶用手术刀从无菌苗上切下，切成3-4mm长 的小块，放于改良的SH液体培养基内，防止干枯，待用。外植体准备完成 后，将浸泡于改良的SH液体培养基内的外植体，倒于灭好菌的滤头里，回 收外植体。将回收的外植体放于步骤2中准备好的菌液中，进行农杆菌浸染。 每隔一会，摇动几下，有助于农杆菌吸附到外植体上。浸染15分钟后，倒 于无菌的滤头上，回收外植体。将外植体放于无菌的滤纸上，吸去多余菌液， 于空白的共培养培养基上28℃暗培养4天。

经共培养4天后的外植体，转移到含有2mg/L 2，4-D、0.2mg/L KT、40 mg/L潮霉素和300mg/L Cef的改良的SH固体培养基上，诱导产生愈伤组织； 待培养20天后，将诱导产生的愈伤组织转移到含有0.2mg/L KT、2g/L水解 酪蛋白，50mg/L潮霉素和300mg/L Cef的UM培养基上，诱导产生胚状体； 当胚状体成熟以后(大约培养30天)，将胚状体移植到1/2MS培养基上，诱 导生根，从而完成植株的再生。

再生过程中各步培养基的组成如下：

共培养培养基：改良的SH培养基；

诱导愈伤培养基：改良的SH培养基+2mg/L 2，4-D+0.2mg/L KT；

胚状体诱导培养基：UM培养基+0.2mg/L KT+2g/L水解酪蛋白+50 mg/L Hyg+300mg/L Cef。

对比例1

转空载体对照植物的获得

用质粒pCAMBIA1302转化农杆菌，获得重组农杆菌，用重组农杆菌转 化紫花苜蓿，得到转空载体的对照植株，方法如实施例1。

实施例2

检测10株的对比例1中得到的转空载体的紫花苜蓿和10株的实施例1 中得到的转插入有MSTMT基因的pCAMBIA1302载体的紫花苜蓿中的α-生 育酚含量，具体方法如下：

A.样品的制备：供紫花苜蓿烘干并粉碎后，过40目网筛，准确称取0.5 g于水解管中，加入10mL 6％乙醇焦棓酚溶液，超声波提取10min，加入2 mL 60％氢氧化钾溶液，并加入100μL 1mg/ml的母育酚溶液，作为内标， 最终样品测定液中的母育酚含量为10μg/ml。置于70℃水浴中皂化30min， 取出后至于冰浴中冷却。将冷却后的样品皂化液全部转移到分液漏斗中，加 入20mL 2％氯化钠溶液，然后用10mL正己烷/乙酸乙酯(85/15，V/V)溶 液萃取两次。在有机相中加入少量的无水硫酸钠。吸取有机相1ml于离心 管中，14000rpm/min离心15min，取上清液100μl于HPLC小瓶中上机测 定。

B.绘制标准曲线：精确称取α-生育酚标准品0.0500g，用正己烷溶解 定容到50mL容量瓶中，制成标准贮备液。将α-生育酚标准溶液用正己烷逐 级稀释后配成质量浓度为0.10、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、20.00 μg/mL的α-生育酚标准工作液，进样20μL进行测定，以生育酚绝对含量为 横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

C.测定：取20μL步骤A中制备的样品试液在以下的色谱条件下进行 测定，每个材料测3次重复。

色谱条件：色谱柱：Hypersil SI 200硅胶柱(200mm×2.1mm.i.d.，5μm) 流动相：正己烷∶异丙醇＝98∶2(V/V)；柱温：25℃；流速：0.3ml/min； 荧光检测器波长：Ex＝195nm，Em＝330nm；进样量：20μL。

结果显示，转pCAMBIA1302空载体的紫花苜蓿中的α-生育酚含量为 0.10mg/100g以下，而转插入有MSTMT基因的pCAMBIA1302载体的紫花 苜蓿中的α-生育酚含量平均达到3.08mg/100g以上。

由此可以看出，本发明提供的紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因 (MSTMT)在紫花苜蓿中的表达可以显著提高紫花苜蓿中α-生育酚的含量。 该基因的发现为提高主要牧草植物(特别是豆科植物，如紫花苜蓿)中的α- 生育酚的含量提供了基因资源，在基因工程改良牧草植物的研究中将发挥重 要作用。