一种基于单核苷酸多态性标记的互花米草遗传分型方法

摘要

本发明涉及一种基于单核苷酸多态性标记的互花米草遗传分型方法，本方法根据高通量转录组测序筛选得到目标基因，通过PCR反应、PCR产物测序得到多个单核苷酸多态性位点。再由所有有效的单核苷酸多态性位点组成单倍体型用于分子标记以达到遗传分型。本发明操作简便、通量灵活、单核苷酸多态性标记遗传稳定可靠，可在生物学、遗传学研究中推广应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于单核苷酸多态性标记的互花米草遗传 分型方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组 水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。据估计，人类基因组中每1000 个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs。

组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二 态的标记，即二等位基因（biallelic）。由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组 筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技 术筛选或检测SNPs。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，单核苷酸多态性 标记可帮助区分个体间遗传物质的差异。

随着单核苷酸多态性标记技术的成熟及其在分子生态学中的广泛应用，外来物 种入侵机理日益成为国际上研究的重点。大量的研究表明外来入侵种能在如此短的 时间内迅速地做出适应性的进化，可能与其自身的遗传结构密切相关。因而，在外 来入侵物种上，亟需一种能够有效揭示外来入侵物种遗传本质的方法。

互花米草（Spartina alterniflora）是一种原产北美大西洋沿岸的多年生草本 植物。因其促淤造陆和消浪护堤作用显著而被许多国家引种。1979年，南京大学从 美国东南部的北卡罗莱纳、乔治亚和佛罗里达引种了3种不同生态型互花米草至福 建罗源湾，随后扩大分布至我国海岸潮间带辽宁丹东以南的广大区域，并取得了一 定的生态和经济效益。但作为外来物种，其强大的繁殖能力和高大密集的种群特征， 对我国沿海滩涂地区的生态系统、生物多样性和水产养殖产生了较大的负面影响， 2003年被环保总局列入我国第一批16种外来入侵物种名单。因此，对其入侵过程 和扩张机制的研究已刻不容缓。本发明以列入中国首批外来入侵物种的互花米草为 对象，在整个基因组内批量寻找多态性位点，全面评估互花米草的多样性，并揭示 其遗传本质和入侵机制，为进一步研究和控制互花米草等相关物种提供有力的技术 支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于单核苷酸多态性标记的互花米草遗传分型方法， 能够在基因组序列信息较少的情况下，获得大量的核苷酸多态性标记，发现引入的 不同互花米草种群之间存在的遗传变异，为揭示其遗传本质和入侵机制，进一步研 究和控制互花米草提供有力的技术支持。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种鉴定外来入侵物种互花米草种群的DNA分子标记方法，步骤如下：

1)种群调查及取样；

2)DNA提取；

3)测序；

4)筛选目标基因R59；

5)根据目标基因R59设计引物，正向引物如序列表中SEQ ID NO：1所示；反 向引物如序列表中SEQ ID NO：2所示；

6)PCR扩增；

7)测序；

8)序列拼接、比对，鉴定记录单核苷酸多态性位点。

进一步地，所述目标基因R59是通过高通量转录组测序后筛选得到。

进一步地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min，94℃30s、54℃30s、 72℃1.5min，38个循环，72℃延伸10min。

进一步地，所述目标基因R59在互花米草种群中有7个单核苷酸多态性位点， 目标基因R59基因片段如序列表中SEQ ID NO：3所示，其中7个单核苷酸多态性 位点分别位于93、347、436、536、555、683、684。

进一步地，高通量转录组测序的方法：提取样本总RNA，用Oligo(dT)的磁珠 富集分离mRNA，合成双链cDNA，构建转录组测序文库，插入片段长度约为500bp, 在illumina HiSeq2000测序仪上进行高通量测序，使用Trinity软件对测序片段进行 拼接，从而得到基因序列。

本发明的有益效果：包括互花米草在内的许多物种为非模式植物,基因组庞 大，很多物种缺少全基因组数据，在进行传统的各种传统分子标记分析时，如RAPD、 SSR、AFLP，发现实验结果的一致性较差，假阳性率偏高。而且，传统分子标记一次 实验只能找到少量多态性位点信息，如果需要高精度的分辨率，需要多次实验。本 发明在一次实验中，即可得到7个单核苷酸多态性SNP位点，提供丰富的多态性信 息。同时，本发明的实验条件简单，成功率高，可重复性好。在实施过程中，实验 成功率在98%以上，实验结果可重复性更达到100%。本发明采用的7个SNP位点， 单倍体基因型理论上可以达到2的7次方，即128，能够提供非常丰富的多态性信 息，使结果更加准确。SNP标记遗传稳定，可用于不同来源的样本，适宜高通量自 动化分析。

具体实施方式：

下面结合具体样本对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不 是限定。

1.种群调查及取样

选择天津塘沽海河沿岸和山东莱州朱旺海港作为采样点，选取生长良好、无虫 害的叶片，采下后立刻放入事先准备好的装有约半袋硅胶的自封袋里，混匀使叶片 与硅胶充分混合，以便快速脱水。带回实验室后根据实际情况更换已经变色的硅胶， 干燥之后待提取DNA用。每一采样点随机取样30株左右，个体间的间距不小于50 米，以尽可能避免重复采集同一克隆，记录每一样本的编号、生境、地理参数（经 纬度）、样品高度，样品直径等详细信息。

2.DNA提取

使用BioFlux公司的Biospin植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，具体步 骤稍作调整：

(l)称取0.07-0.1g干叶，用剪刀剪碎；用液氮冷冻研钵、研棒，将材料倒入盛 有液氮的研钵中，用力磨成粉末，在研磨过程中注意不要让材料反复冻融。

(2)将研磨好的粉末用勺小心地转移至预先加入450uL LP Buffer的2.0ml离心 管中，混合均匀。

(3)65℃金属浴中温浴30-60分钟（温浴过程中间隔振荡2-3次），然后移出。

(4)加入150uL DA Buffer，混合均匀后于冰浴中放置5分钟。

(5)于13,000rpm离心10分钟，再将上清液转移至Shredder spin column中， 13,000rpm离心1分钟。

(6)将滤液转移到一个新的1.5ml离心管中。

(7)加入滤液体积1.5倍的P Binding Buffer，轻柔的混合均匀，管中出现絮状 沉淀，13,000rpm离心10分钟。

(8)将上清液转移至Spin column。于7,500rpm离心一分钟，并弃去接液管中 液体。

(9)向Spin column中加入500uL的G Binding Buffer。12,000rpm离心30秒， 并弃去接液管中液体。

(10)向Spin column中加入600uL的Wash Buffer。12,000rpm离心30秒，并弃 去接液管中液体。

(11)重复步骤10，一次。

(12)再次将Spin column于12,000rpm离心1分钟，并将Spin column转移至一 个新的1.5ml离心管。

(13)向Spin column中加入100uL至200uL65℃温浴的去离子水，并于室温温 浴2-3分钟。

(14)于12,000rpm离心1分钟，并弃去Spin column。DNA存在于1.5ml离心管 液体中，-20℃保存备用。

3.高通量转录组测序

包括互花米草在内的许多外来入侵物种为非模式植物,基因组庞大，很多物种 缺少全基因组数据，在进行AFLP分子标记与锚定PCR实验的过程中，发现实验结果 的一致性较差，假阳性率偏高。因此，我们选择使用高通量转录组测序技术，高通 量转录组测序不需要了解物种基因信息，能够对任意物种进行转录组分析，并能测 定每个转录本的片段序列，精确到单核苷酸的分辨率；能够同时鉴定和定量稀有转 录本和正常转录本，以及检测基因家族中相似基因和可变剪接造成的不同转录本的 表达。高通量测序的步骤是：提取样本总RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分离 mRNA，合成双链cDNA，构建转录组测序文库，插入片段长度约为500bp,在illumina HiSeq2000测序仪上进行高通量测序，使用Trinity软件对测序片段进行拼接，从而 得到基因序列。

4.筛选目标基因

对得到的转录组数据进行行筛选，去除多拷贝及重复基因，找到易于扩增的片 段R59。R59基因片段如SEQ ID NO：3所示。

5.根据目标基因设计引物，引物的序列为：

正向引物如SEQ ID NO：1所示：ccactccaat caaccctagt tc

反向引物如SEQ ID NO：2所示：gatcactacc acttctcatg cc

6.PCR扩增

设计50ul PCR扩增体系，具体的组成为：34uldH₂O、5ul10×Buffer(Mg²⁺)、 4ul dNTP Mixture(2.5mM)、0.5ul Trans T-Taq(5U/μl)2.5ul Template DNA （20-40ng/μL）2ul正向引物（10μM）、2ul反向引物（10μM）。

PCR反应条件为：94℃3min预变性，94℃30s、54℃30s、72℃1.5min38个循 环，72℃延伸10min。

7.测序

PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳检测,确定为目的条带且无杂带干扰。使用上海捷 倍思基因技术有限公司的PCR clea-up Kit直接清洁PCR产物，PCR产物浓度达到测序 要求后，R59片段使用引物R59反向测序。

8.序列拼接、比对和分析

所得的序列用Sequencher软件进行拼接并根据峰图进行手工校正，然后利用 Mega软件进行比对排列，经比对，两端切齐后长度752bp，GC含量为48.4%。R59片段 测序质量很高，峰型清晰，无杂峰。可以通过测序峰形清晰鉴定单核苷酸多态性位 点。

9.对天津塘沽海河沿岸和山东莱州朱旺海港的互花米草种群进行鉴定记录单 核苷酸多态性位点。

表1天津塘沽海河沿岸和山东莱州朱旺海港的互花米草种群单核苷酸多态性位点

注：Y、R、W是国际纯粹与应用化学联合会（International Union of Pure and Applied Chemistry， IUPAC)制定的命名规则，Y代表T或C，R代表A或G，W代表A或T

鉴定结果发现，天津塘沽海河沿岸和山东莱州朱旺海港的互花米草种群内具有较 高的多态性。752bp的片段上，共存在7个隔离位点（见表1）。

天津塘沽海河沿岸的互花米草种群群体的8个个体中，3个个体含有2个单核苷 酸多态性位点，3个个体含有1个单核苷酸多态性位点。山东莱州朱旺海港的互花 米草种群群体的8个个体中，3个个体含有3个单核苷酸多态性位点，1个个体含有 1个单核苷酸多态性位点。

对天津塘沽海河沿岸和山东莱州朱旺海港的互花米草两个群体之间进行比较发 现，两个地区的互花米草种群之间遗传分化较小。种群间Fst为0.01057，（Fst=0.05， 群体相似，高的基因流动；Fst=0.25完全不同的亚群体，低的基因流动）。