一个簇毛麦二硫化物异构酶基因及其应用

摘要

本发明属于基因工程领域，公开了一个簇毛麦二硫化物异构酶基因及其应用。Hv-PDI的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。该基因来自二倍体簇毛麦（Haynaldia villosa,VV,2n=14），在抗白粉病二倍体簇毛麦中受白粉菌诱导表达增强。通过瞬间表达将该基因转化感病小麦品种扬麦158，结果表明Hv-PDI的过量表达可以降低扬麦158的吸器指数。因此，Hv-PDI可望用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，有望提高小麦的白粉病抗性。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，公开了一个簇毛麦二硫化物异构酶基因及其应用。

背景技术

由专性寄生真菌小麦白粉病菌（Blumeria graminis DC f.sp.tritici）引起的小麦白粉病是中 国和世界上许多国家小麦生产中危害日趋严重的病害之一。从一叶期到衰老，植株都能被白粉 菌侵染。早期的侵染可使分蘖减少，上部叶片和穗部晚期的侵染能严重减少籽粒产（20％-33％）。

白粉病虽然能用杀菌剂防治，但必然增加人力、物力投入，而且还会引起环境污染等生态 问题，因此培育和推广抗病品种已被公认为是防治小麦白粉病最为经济、安全和有效的途径， 而抗病遗传背景和抗病机理的研究则是制定抗病育种策略的重要依据。明确其抗病机制，克隆 抗病相关基因，对于防治小麦病害、开展抗病育种改良具有重要理论指导意义。

小麦抗病分子机制是目前小麦白粉病研究的热点课题。白粉病病原菌与寄主小麦之间的互 作关系十分复杂。分析病原菌-寄主互作过程中的基因表达情况，有助于发掘抗病基因和发现 抗病通路，并进一步阐明抗病的分子机制。通过构建受白粉病菌诱导表达的cDNA文库、SSH文 库，利用双向电泳结合质谱技术、芯片技术等，筛选出了可能与白粉病抗性相关的基因或蛋白， 包括各种病程相关蛋白、丝氨酸-苏氨酸激酶、ABC转运蛋白等，也发现了水杨酸途径、双氧水 途径等信号通路与白粉病抗性关。

二倍体簇毛麦是高抗白粉病的小麦远缘物种，其抗病基因Pm21位于6V上，本实验室前期 研究表明Hv-CMPG与簇毛麦的白粉病相关，该基因是一个E3连接酶，参与泛素化过程降解结合 目标底物蛋白。研究像Hv-CMPG这类E3连接酶的底物结合蛋白及信号传导途径是近年来的研究 热点。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种二硫化物异构酶基因Hv-PDI。

本发明的另一目的是提供该基因的表达载体。

本发明的又一目的是提供该基因和表达载体的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

二硫化物异构酶基因Hv-PDI，来自二倍体簇毛麦（Haynaldia villosa，VV，2n=14），可以和白 粉病抗性相关基因Hv-CMPG互作，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

该受体蛋白激酶基因编码的蛋白质Hv-PDI，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

含有所述的二硫化物异构酶基因Hv-PDI的表达载体。

所述的含有权利要求1所述的二硫化物异构酶基因Hv-PDI的表达载体优选以pBI220为出 发载体，将权利要求1所述的HvPDI基因插入pBI220的BamH/和Kpnl酶切位点间所得。

所述的二硫化物异构酶基因Hv-PDI在构建抗白粉病小麦品种中的应用。

所述的含二硫化物异构酶基因Hv-PDI的表达载体在构建抗白粉病小麦品种中的应用。

本发明首次从簇毛麦中克隆得到了一个和白粉病抗性相关基因HvCMPG互作的二硫化物 异构酶基因Hv-PDI及其所编码的蛋白质Hv-PDI，为簇毛麦中首次报道。将其插入表达载体 pBI220，得到的该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可以提高感白粉病小麦品种对白 粉病的抗性。Hv-PDI用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，能够提高小麦的白 粉病抗性。

有益效果：

本发明利用酵母双杂交技术，将Hv-CMPG作为诱饵，利用聚乙二醇-醋酸锂转化法，筛选 受白粉菌诱导的簇毛麦酵母双杂交cDNA文库，得到Hv-CMPG的一个互作基因Hv-PDI，该基 因是一个二硫化物异构酶，在簇毛麦叶片中受白粉菌诱导上调表达；将其插入表达载体pBI220， 得到该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可以提高感小麦白粉病品种对白粉病的抗 性。因此，Hv-PDI可用于基因工程育种，特别是应用于基因工程手段培育抗白粉病的小麦品种。

附图说明

图1利用酵母双杂交克隆Hv-CMPG的互作基因Hv-PDI

上行为：SD-LT培养基

下行为：SD-HLT培养基；从左至右分别为pGADT7+pGBKT7；pGBKT7：CMPG+pGADT7；

pGADT7：PDI+pGBKT7；pGBKT7：CMPG+pGADT7：PDI。

图2Hv-PDI在二倍体簇毛麦白粉菌诱导后的叶片中的QRT-PCR分析

上行：Hv-PDI在簇毛麦叶片受白粉菌诱导的不同时间的表达情况；

中行：看家基因Tubulin在簇毛麦叶片受白粉菌诱导的不同时间的表达情况；

下行：0h、30min、45min、1h、2h、6h、12h、24h、48h、72h分别表示簇毛麦叶片受白粉 菌诱导的不同时间段

图3Hv-PDI过量表达载体构建。

图4与白粉菌互作的表达GUS基因的表皮细胞

a：白粉菌侵入表达GUS的表皮细胞后未形成吸器；

b：白粉菌侵入表达GUS的表皮细胞后形成吸器

co：分生孢子；pp：侵入钉；ha：吸器；hy：菌丝

图5利用单细胞瞬间表达技术研究Hv-PDI在抗白粉病中的效应

具体实施方式

实施例1利用酵母双杂交克隆簇毛麦二硫化物异构酶基因Hv-PDI

二倍体簇毛麦(参考文献：齐莉莉，陈佩度，等，小麦白粉病新抗源—基因Pm21，作物 学报，1995，21(3):257-262)是高抗白粉病的材料。Hv-CMPG是南京农业大学细胞遗传研究所 克隆的一个位于二倍体簇毛麦6V上的白粉病抗性相关基因(刘圆.簇毛麦Hv-CMPG基因克隆 及其功能初步分析[D].南京.南京农业大学，2007)，以Hv-CMPG为诱饵，用聚乙二醇-醋酸锂 转化法筛选酵母双杂交cDNA文库，得到一个Hv-CMPG的互作基因（附图1）。对该互作基 因测序，获得了大小为1615bp的序列，序列如SEQ ID NO.1所示。通过NCBI网站中的ORF  finder搜索该获得序列的开放阅读框，发现其包含一个全长ORF的基因，其中5’-UTR（非翻 译区）81bp、3’-UTR211bp、ORF（开放阅读框）1323bp，编码440个氨基酸，序列如SEQ ID  NO.2所示，将该基因命名为Hv-PDI。

实施例2Hv-PDI基因受白粉菌诱导的表达特征

把抗白粉病的簇毛麦种子(参考文献：齐莉莉，陈佩度，等，小麦白粉病新抗源-基因Pm21， 物学报，1995，21(3)：257-262)播于培养皿中发芽，露白后移栽到盆钵（周围用圆柱状透明塑 料片隔离，顶端用滤纸封闭，形成无白粉菌的环境）。待三叶期，把在感病品种苏麦三号上培 养的南京本地混合白粉菌新鲜孢子轻轻抖落在簇毛麦的幼苗上。接种白粉菌后的簇毛麦叶片保 存在16℃。接种后0h、30min、45min、1h、2h、6h、12h、24h、48h、72h取样，置于－70℃ 冰箱内保存备用。用TRIZOL（Invitrogen）提取受白粉菌诱导的簇毛麦叶片的RNA，利用AMV 酶（Takara）合成反转录第一链，得到反转录产物。

应用能特异扩增Hv-PDI的特异引物P1（CAAGTGGCAAAACCTCTGGT（SEQ I D NO.3））和P2 （TACAAAGCAAATGGCAGCAG（SEQ ID NO.4）），对该基因在受白粉菌诱导样品中进行半定量PCR （sQ-RT-PCR）分析。PCR反应在PCR仪（PTC-200，Bio-Rad，USA）上扩增。10μl PCR反应体 系中含1μl1×Buffer，1.5mmol/L MgCl2，200mmol/L dNTP，0.2nmol/μl引物P1和P2，0.5UTaqDNA 聚合酶（rTaq TakaRa），上述获得的反转录产物1μl。扩增参数为：95℃3min，然后95℃30s、 56℃45s，72℃1min，共26个循环。反应结束后，反应产物加2μl loading buffer后用1％的 琼脂糖凝胶电泳。结果表明，和看家基因（Tubulin）相比较，在簇毛麦叶片中Hv-PDI受白粉 菌诱导上调表达，24h后表达水平达到峰值，之后开始下调。sQ-RT-PCR的结果表明，Hv-PDI 可能与白粉病抗性相关（附图2）。

实施例3Hv-PDI正义表达载体构建

利用上述经白粉菌诱导后的簇毛麦cDNA为模板，以可扩增Hv-PDI基因蛋白编码区的引物 对P3（CGGGATCCATGCGTCCGGCCATCC（SEQ ID NO.5））和P4（GGGGTACCTCACAACTCGTCGTTGGGC （SEQ ID NO.6））进行PCR扩增，回收大小为1323bp扩增片段。将扩增片段插入pMD18-T(Takara) 中，经测序后和原序列比对，为Hv-PDI基因，用BamHI和Kpnl双酶切将扩增目标片断插入到 载体pBI220（Jefferson RA，Kavanagh TA，Bevan MW.GUS fusions：beta-glucuronidase as a sensitive  and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J.1987，6：3901-3907.）的35S启动子后面 的多克隆位点BamHI和Kpnl之间。由此将目标基因Hv-PDI克隆到强启动子35S的下游，经测 序后，和原序列比对无点突变，获得表达载体pBI220：PDI（附图3）。

实施例4利用瞬间表达方法将Hv-PDI基因转入小麦叶片

白粉菌侵染感白粉病小麦叶片后大约24小时左右会在叶片表皮中形成吸器，吸器是吸收 寄主养分供白粉菌菌丝生长的重要结构。白粉菌侵染后如果能在叶片表皮细胞中形成吸器一般 认为是寄主-病原菌发生了亲和反应，即叶片产生的是感病反应；如果不能在叶片表皮细胞中 形成吸器一般认为是寄主-病原菌发生了非亲和反应，即叶片产生了抗病反应。吸器指数，即 与病原菌互作的细胞中有吸器形成的细胞比例，是衡量寄主抗病性的一个重要指标。

瞬间表达方法是一种可靠且快速鉴定基因功能的方法（参考文献：Schweizer，Pokorny et al. A Transient Assay System for the Functional Assessment of Defense-Related Genes in Wheat. Molecular Plant-Microbe Interactions.1999，12：647-654.），可将质粒DNA包裹到金属微粒外层， 借助基因枪将金属微粒轰击到小麦叶片的表皮细胞，载体上携带的目的基因在叶片细胞中超量 表达。

本研究将Hv-PDI构建到超量表达载体中pBI220：PDI，通过瞬间表达方法将pBI220：PDI和 GUS基因所在载体pAHC25（Christensen A H，Quail P H.Ubiquitin promoter-based vectors for  high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Research，1996，5：213-218.）进行共转化，以GUS基因标记Hv-PDI基因表达的细胞， 通过比较轰击Hv-PDI细胞的白粉菌吸器指数与未轰击Hv-PDI细胞的白粉菌吸器指数，明确目 标基因是否具有白粉病抗病功能。具体操作步骤如下：

载体DNA与金属微粒包裹的程序：1、制备钨粉：（1）称取30mg的钨粉于1.5ml eppendorf 管中，加入1ml70％酒精，涡旋3-5min后静置15min，使钨粉完全沉淀。（2）12000rpm离心 1min后弃上清。（3）向沉淀中加入1ml ddH₂O水，涡旋混匀后，12000rpm离心弃上清（重复 三次）。（4）向沉淀中加入500μl甘油(V/V，50％)涡旋混匀，以备用。2、包裹子弹：（1）吸取 5μl涡旋均匀的钨粉于1.5ml的eppendorf管中，加入5μl质粒DNA（0.2μg/μl的浓度），边 涡旋边向eppendorf管内滴加50μl CaCl₂（2.5M），然后加入20μl亚精氨（0.1M，现配先用）， 涡旋3min。（2）静置1min后离心2s，弃上清，向沉淀中加入140μl酒精（V/V，70％），充 分涡旋，离心2s，弃上清。（2）加入140μl无水酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。向沉淀 中加入15μl无水酒精，充分涡旋，以备使用。

基因枪轰击程序如下：

剪下长约6cm的小麦幼苗叶片端部，平行贴在载玻片上，每张玻片贴6片叶片左右。基 因枪使用PDS1000/He系统，采用1350psi的可裂膜片，真空度为28inHg。轰击后将叶片置于 垫有润湿滤纸的瓷盘内，罩以打有小孔的保鲜膜，保湿并透气，18-20℃恢复培养4h后，高 密度接种白粉菌分生孢子。接种48h后用GUS染液[配方为：0.1M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液 (pH7.0)，含10mM EDTA，5mM铁氰化钾和亚铁氰化钾，0.1mg/ml X-Gluc，0.1％Triton X-100， 20％甲醇]真空渗透10min，37℃染色12h，然后用70％酒精脱色2天直至叶片漂白后，用考马 斯亮蓝（W/V，0.6％）对白粉菌孢子染色。

实施GUS基因单转化时，将含有GUS基因表达载体pAHC25的质粒DNA与钨粉包裹；当 实施Hv-PDI与GUS基因共转化时，将含有Hv-PDI基因表达载体pBI220：PDI的质粒DNA与含 有GUS基因表达载体pAHC25的质粒DNA按摩尔浓度1∶1的比例混合包裹钨粉。当GUS基因 与Hv-PDI基因进行共转化时，标记基因GUS转入的染色呈现蓝色的细胞即为Hv-PDI转入的细 胞。

实施例5Hv-PDI的抗病功能分析

在GUS表达的细胞中，指状吸器会被GUS染色液染成蓝色，在显微镜下容易辨认。在GUS 基因转化细胞后，通过统计与白粉菌互作的GUS表达细胞中，吸器形成的细胞所占的比例（％）， 即为“吸器指数”(参考文献：Schweizer，Pokorny et al.A Transient Assay System for the Functional  Assessment of Defense-Related Genes in Wheat Molecular Plant-Microbe Interactions.1999， 12：647-654)。吸器指数越小，表明形成吸器的细胞比例越低，叶片的抗病性越强。本研究利用 “吸器指数”作为抗病强弱的衡量指标。

当单转化GUS基因时，感白粉病小麦品种扬麦158中的吸器指数为63.28％（统计了897 个细胞）。

当GUS基因与Hv-PDI共转化感白粉病小麦品种扬麦158后，统计了GUS基因表达（即 Hv-PDI表达）且有白粉菌互作的细胞的吸器指数，结果表明当Hv-PDI转入后，扬麦158的吸 器指数从63.28％降到37.55％（统计了1055个细胞）。该结果说明，Hv-PDI能显著的降低吸器 指数，其瞬间表达可以提高对白粉菌的抗性。