蝗虫取食偏好性检测的方法及检测试剂盒

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及蝗虫取食偏好性检测的方法及检测试剂盒。方法包括使用针对克氏针茅基因特异性引物序列、羊草基因特异性引物序列、糙隐子草基因特异性引物序列、小叶锦鸡儿基因特异性引物序列、冷蒿基因特异性引物序列、猪毛菜基因特异性引物序列进行荧光定量PCR的步骤。本发明所提供的检测方法可以用于快速而精准的检测蝗虫食性。本发明的检测方法涉及的材料来源广，易购买，操作简单，省时，省力，适于推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及蝗虫取食偏好性检测的方法及检测试剂 盒。

背景技术

植物为昆虫提供食物与栖境，植食性昆虫对寄主植物有明显的选择性。蝗虫是 生态系统中重要的成员，在生物链中发挥重要的作用。同时也是消费者之一，为害 农业生产，与牲畜争食饲用植物。定性定量检测蝗虫的食性食量可以生物防治、生 态治理、多样性调控提供技术指导。

蝗虫食性研究方法有罩笼内蝗虫取食特性研究、蝗虫口器结构适应性测试、蝗 虫粪便形态特征分析、蝗虫消化道形态学研究、直翅目昆虫嗦囊内含物(食糜)显微分 析技术等；最常见的蝗虫食量测定方法包括：叶面积消耗测定食量法、对比称重测 定食量法、粪便量推测食量法罩等。这些方法在同时分析不同种类蝗虫、取食多种 植物时存在一定局限，定量误差较大。高等植物中的ITS序列是18SrDNA-5. 8SrDNA-26SrDNA间隔区序列，所受的选择压力小，进化速率较快，在物种间表现 出较高的差异。因此，ITS序列可以作为植物种类定性遗传标记，应用定量PCR技 术，可以精准而快速的定性定量检测蝗虫取食特性。

发明内容

本发明的目的是提供一种蝗虫取食偏好性检测的方法。

本发明的再一目的是提供蝗虫取食偏好性检测的试剂盒。

根据本发明的方法，首先克隆得到：

1、克氏针茅ITS区基因序列（5’-3’）SEQ ID No.1:

TACGACAACAGACCGCGCACGCGTCACCCATCCCGCCGGCGGTGGCACTGCCC GCCGTCCGGCCAAGTCCCCGACCACCTCCCCTCCCCGGAGGGGGGGCCGGGG CGACAGAACCCACGGCGCCGAAGGCGTCAAGGAACACTATGCCTAACTCGGG GGCGCGGCTGGCCTGCCGGCCGCCCCCTGCGTTGCGATGCTATCTAATCCACAC GACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAAT GCGATACCTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCA AGTTGCGCCCGAGGCCACCCGGCCGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCACGCC AAAACACGCTCCCACCCCCCTCACCGGGGAGCGGGACGCGGCGTCTGGCCCC CCGTGCCGCGAGGCGCGGTGGGCCGAAGATCGGGCTGCCGGCGTACCGTGCC GGGCACAGCGCGTGGTGGATCTCTACTCGGCGCAGTGCACCCGGCGCGTAGCC AGCGCAGTGGCCCCCTAAGGACCCAACGAACGGAGCGCGAGCCGCTCCGACC GCGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAA

2、羊草ITS区基因序列（5’-3’）SEQ ID No.2:

GACGACAAACAGACCGCGCACGCGTCATCCAATCCGCCGGTGGCGGCACC GTCCGTCGCTCGGCCAAGTCCTCGACCGCCTCCCCTCCTCGGAGTGGGGGCTC GGGGTAAAAGAACCCACGGCGCCGAAGGCGTCAAGGAACACTGTGCCTAACC CGGGGGCATGGCTAGCTTGCTAGTCGTCCCCCGTGTTGCAAAGCTATTTAATCC ACACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGC GAAATGCGATACCTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGA ACGCAAGTTGCGCCCAAGGCCACTCGGCCGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTC ACGCCAAAACACGCTCCCAACCCCCCTCATCGGGAATAGGGATGCGGCATATG GTCCCTCGTCTCGCAAGGGGCGGTGGGCCGAAGATCGGGCTGCCGGCGGACC GCGCCGGACACAGCGCATGGTGGGCGTCCTCGCTTTATCAACGCAGTGCATCC GACGCGTAGCCGGCGTGATGGCCTCAAAAGGACCCAGCAAACGAAGCGCACG TCGCTTCGACCGCGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCAT ATCAATAAA

3、糙隐子草ITS区基因序列（5’-3’）SEQ ID No.3:

TCCCGTCTTTAGTCTTGTCGTGACCTGACCAAACAGACCGTGAACATGTCA TCCATGCGGCCGGGTCACGGGACTTGCACCCGTGTCTCGGTACAGGCCGCTGA CCTTCTTTCGGAGGTGAGTAGCCACAAAAGAACCCACGGCGCTGTATGGCGTC AAGGAACACTAATATTGCCTTGCTCGGGGCAGCACCGGCTCGCCGGCCGCACC CTGTGCAGCGATGCTATGATAATCCACATGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCT CTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACCTGGTGTGAATTGCAGAAT CCCGTGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCTTCTGGTTG AGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCCAAAAGACACTCCCCACCCACCCCGGT GCGGACGTGGTGTTTGGCCCCTCGTGCCAAAGGGCGCGGTGAGCCAAAGTTG GGGCTGCCGGCGGTGCCGATCACAGCACAAGGTGGATGACGCATGTTGTTCTC GGTGCTCTGTTATGGACCGCTACCGGTGATATGGCCCTCAGGACCCATGGACCG AAGCGCAAGTTGCTTGGACCGCGACCCCAGGTCAGTCGGGATTACCCGCTGAG TTTAAGTATAATTCAATAAAA

4、小叶锦鸡儿ITS区基因序列（5’-3’）SEQ ID No.4:

CCGTGCGGTAGTCTTGTCGATGCCTTACATGCAGACCGACCTGTGAATCTG TTTGAACACGTAGGGCTGGCTTGAGGTGTTCCACGCCTCGACCTCCCTTGAGGT AGGAGGGGGCCATGAGTGTGTTCCCCTGCTTGCCCAAACACAAACCCCGGCGC TGAATGCGCCAAGGAACTAAATTTCGTTCAGTGCGCCCCCGTTGGCCCGGAGA CGGTGCTCCTACGGGTGGTGTTTTGAAGCATGACACATAATGACTCTCGGCAAC GGATATCTAGGCTCTTGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTG TGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGA AGCCATTAGGTTGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACATATCGTTGCCCGATGC CAATTTCCTCTTGATAAGGAGGTATGCTGTGCAGGGTGAATGATGGCTTCCCGT GAGCACTGCTGCCTCATGGTTGGTTGAAAATTGAGTCCTTGGTAGCGTGTGCCA TGATAGATGGTGGTTGAGTGATGCACGAGACCATATCATGTGAGACTCTACCAA ACTTGGCCTCTGTGACCCACATGCGTCTTTGAACGCTCATGACGAGACCTCAG GTCAGGCGGGGCTACCCGCTGAGTTTAAGATAATTCAAATAAAAA

5、冷蒿ITS区基因序列（5’-3’）SEQ ID No.5:

TCCAGTTTTAGTCTTGTCGACCTGCAAGCAGACGACCCGCGAACACGTAA AAACAACCGAGCGTCGGTCGGATCAGGCGATCGTTTGATCCTCTCGACGCTTT GTCGATGCGCATTCGCTCGGGTTCTTTTGGACCCTGTGAATGCGTCGTTGGCGC ATTAACAACCCCCGGCACAATGTGTGCCAAGGAAAACTAAACTCGAGAAGGCT CGTTTCGTGTTGCACCCGTTCGCGGTGTGCTCACGGGATGCGGCTTCTTTATAAT CACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCACGCATCGATGAAGAACGT AGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTTTT TGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCTTTTGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCG TCACGCATCGCGTCGCCCCCCCCCAGTTCTCCCCAAAGGGAACCTGGGTTTTG GGGGCGGATACTGGTCTCCCGGGCTCATGGCGGGGTTGGCCGAAATAGGAGTC CCTTCGATGGACGCACGAACTAGTGGGGGTCGTAAAAACCCTCGTCTTTTGTTT CGTGCCGTTAGTCGCAAGGGAAACTCTTAAAAAACCCCAACGTGTCGTCTTTT GACGGCGCTTCCACCGCGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAA GATATTTCAATAAAAA

6、猪毛菜ITS区基因序列（5’-3’）SEQ ID No.6:

CCAGCAGATTGACTAGCGAATGCGTTTTACATGCATGGGATGGGTGGTGTC GTGACTTGTCATGCCATCCCCCATCCTGTGGCCTGGGGAATGTGCACTCGTGTG CTTTGTCCAGGCAAATTAACGAAACCCCGACGCGTCATGCGTCAAGGAACATT AATACAGCGTGTGCCCATTCCTTGCTCGGTTATTCGGCGCAAGGATGCGGCACC CACTCTAAAATAAATTAAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCAT CGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTG AACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCTTCTGGCCGAGGGCA CGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCTCCCCCCAACCCACCTAGTTGTAGGT AGGATGTGGGGGAAGGAGGATGGCTTCCCGCGCCTCACCGGGCGTGGATGGCC TAAATTAGGAGCCTCAGGTCACGACTGCTGCGGCGATTGGTGGTCATCATTTCT TTCCGTGCAGTGCGTGACCAAAGTGGACTCGTAGGACCCTGTGTTGTCCCCTTT TGGAGACAAACCGTTGCGACCCCAGGTCAGGCGGGGTTACCCGCTGAGTTTAA GCATATCAATAAA

然后根据上述ITS区基因序列涉及特异性引物：

1、克氏针茅基因特异性引物序列（5’-3’）：

Forward：GGCACAGCGCGTGGTGGATCTC

Reverse：TGCTTAAACTCAGCGGGTAGTC。

2、羊草基因特异性引物序列（5’-3’）：

Forward：AATCGGGATGCGGCATC

Reverse：CATCCGACGCGTAGCCG

3、糙隐子草基因特异性引物序列（5’-3’）：

Forward：CTGTGCAGCGATGCTATGA

Reverse：TGCGGACGTGGTGTTTG

4、小叶锦鸡儿基因特异性引物序列（5’-3’）：

Forward：CTGTGCAGGGTGAATGA

Reverse：TGAGACTCTACCAAACT

5、冷蒿基因特异性引物序列（5’-3’）：

Forward：CACAATGTGTGCCAAGGA

Reverse：GGGATGCGGCTTCTTTAT

6、猪毛菜基因特异性引物序列（5’-3’）：

Forward：TGCGGCACCCACTCTAAAA

Reverse：GATGTGGGGGAGGAGGA

因此，根据本发明的方法，包括使用一对或多对上述特异性引物对进行定量PCR 检测的步骤。

本发明还提供了蝗虫取食偏好性检测的试剂盒，包括一对或多对上述应该定量 PCR特异性引物对。

本发明所提供的检测方法可以用于快速而精准的检测蝗虫食性。本发明的检测 方法涉及的材料来源广，易购买，操作简单，省时，省力，适于推广应用。

附图说明

图1-1、图1-2显示克氏针茅特异性引物PCR扩增后琼脂糖凝胶检测及荧光定量 PCR结果。

图2-1、图2-2显示羊草特异性引物PCR扩增后琼脂糖凝胶检测及荧光定量PCR 结果。

图3-1、图3-2显示糙隐子草特异性引物PCR扩增后琼脂糖凝胶检测及荧光定量 PCR结果。

图4-1图4-2显示小叶锦鸡儿特异性引物PCR扩增后琼脂糖凝胶检测及荧光定 量PCR结果。

图5-1、图5-2显示冷蒿特异性引物PCR扩增后琼脂糖凝胶检测及荧光定量PCR 结果。

图6-1、图6-2显示猪毛菜特异性引物PCR扩增后琼脂糖凝胶检测及荧光定量 PCR结果。

图7-1、7-2、7-3分别显示喂食克氏针茅、羊草、糙隐子草后荧光定量PCR检 测结果与喂食量的对比。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、

一、采集蝗虫嗉囊

选取地势相对平坦，植被相对均匀的地块，每日15时左右采集蝗虫。采样 时，绕行至上风口处抛出无底样框，吸虫机取样，每草地类型取10个样方。吸 虫器收集蝗蝻和成虫，快速提取其嗉囊，嗉囊和其它虫体分开，标记后车载液氮 罐中速冻保存。

二、蝗虫嗉囊内含物DNA的制备与定量

步骤如下：

DNA的制备

1)取蝗虫嗉囊放入1.5ml离心管，加液氮研磨，至粉末状；

2)加65℃预热的600μl2%CTAB，摇匀后，置65℃水浴中1h。期间，上 下颠转离心管数次，1h后从水浴中拿出，冷却至室温；

3)室温条件下，12000rpm离心5min，取上清；

4)加等体积氯仿/异戊醇（24:1）混匀，室温下，12000rpm离心10min，重 复一次；

5)小心吸取上清，加入到含有2倍体积预冷（-20℃）无水乙醇的1.5ml离 心管中，充分静置至白色絮状沉淀出现；

6)用枪头将白色絮状沉淀挑出，放入1.5ml离心管中，用70%的乙醇（500 μl）冲洗两次，再用无水乙醇冲洗一次，自然干燥；

7)加入100μl0.1×TE溶解DNA；

8)加入1-2μl RNase（1mg/ml），37℃水浴1h后冷却；

9)加入400ulddH2O，再加入500μl氯仿/异戊醇（24:1）充分混匀后， 12000rpm离心10min（4℃）；

10)小心吸取上清，加入到已加入2倍体积预冷（-20℃）无水乙醇和1/10 体积3M乙酸钠（pH5.2）的1.5ml离心管中，充分静置至沉淀出现；

11)12000rpm离心10min（4℃），小心倒去乙醇，用70%的乙醇冲洗沉淀两 次后再用无水乙醇冲洗一次，自然干燥；

12)最后，加入100μl0.1×TE充分溶解，取部分溶液用0.8%的琼脂糖 凝胶电泳和紫外分光光度计法检测DNA的浓度和纯度，最后置于-20℃冰箱中保 存备用。

DNA的定量

用紫外分光光度计测量DNA溶液在260nm和280nm的OD值。根据双链 DNA1OD260＝50ng/ml，OD260/OD280的比值应在1.8，计算DNA的浓度，检 测DNA提取的质量。

三、引物设计及PCR条件优化

用通用引物扩增各种植物ITS区序列，通用引物为：

Forward：CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC

Reverse：TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG

PCR体系为：

10×Ex Taq Buffer 2.5μl dNTP Mixture(各2.5mM) 4μl 上游引物(20μM) 1μl 下游引物(20μM) 1μl TaKaRa Ex Taq(5U/μl) 0.25μl 模板DNA 10ng 总体积 25μl

PCR程序：

温度 时间 循环 95℃ 3min   94℃ 30s   55℃ 30s 35 72℃ 30s   72℃ 5min  

2%的琼脂糖凝胶电泳，割胶后，用凝胶试剂回收盒纯化该DNA片段。然 后用北京全式金生物技术有限公司的pEASY-T3克隆试剂盒在微量离心管中依 次加入溶液（总量5ul），轻轻混合，室温（20℃-37℃）反应5分钟。反应结束 后，将离心管置于冰上。

用冰冷的无菌枪头加连接产物于50μl Trans1-T1感受态细胞中（在感受态 细胞刚刚解冻时加入连接产物），轻弹混匀，冰浴30min。42℃热激30s，立即放 于冰上2min。每管加250μl平衡至室温的LB培养基，37℃，200rpm，轻摇1h， 使细菌复苏。将菌液涂布于含X-gal、IPTG、Amp的LB平板培养基上，室温放 置，使液体被充分吸收。(每100ml LB培养基中加入氨苄青霉素50μl，每9cm 平板加入20%IPTG4μl，以及避光保存的20%X-gal40μl)，37℃，倒置平板过 夜培养，约12-16h出现菌落。

挑选白色单菌落，用通用引物对重组子进行PCR快速筛选鉴定，以蓝色菌落为 阴性对照。将含pEASY-T3Cloning Vector的大肠杆菌接入2-5ml含Amp的LB 液体培养基的试管中，37℃，250rpm振荡培养过夜，将菌液送到上海英俊公司 测序，得到：

（1）克氏针茅ITS区基因序列（5’-3’）SEQ ID No.1:

（2）羊草ITS区基因序列（5’-3’）SEQ ID No.2:

（3）糙隐子草ITS区基因序列（5’-3’）SEQ ID No.3:

（4）小叶锦鸡儿ITS区基因序列（5’-3’）SEQ ID No.4:

（5）冷蒿ITS区基因序列（5’-3’）SEQ ID No.5:

（6）猪毛菜ITS区基因序列（5’-3’）SEQ ID No.6:

设计各种植物的特异性引物对。

（1）克氏针茅基因特异性引物序列（5’-3’）：

Forward：GGCACAGCGCGTGGTGGATCTC

Reverse：TGCTTAAACTCAGCGGGTAGTC。

（2）羊草基因特异性引物序列（5’-3’）：

Forward：AATCGGGATGCGGCATC

Reverse：CATCCGACGCGTAGCCG

（3）糙隐子草基因特异性引物序列（5’-3’）：

Forward：CTGTGCAGCGATGCTATGA

Reverse：TGCGGACGTGGTGTTTG

（4）小叶锦鸡儿基因特异性引物序列（5’-3’）：

Forward：CTGTGCAGGGTGAATGA

Reverse：TGAGACTCTACCAAACT

（5）冷蒿基因特异性引物序列（5’-3’）：

Forward：CACAATGTGTGCCAAGGA

Reverse：GGGATGCGGCTTCTTTAT

（6）猪毛菜基因特异性引物序列（5’-3’）：

Forward：TGCGGCACCCACTCTAAAA

Reverse：GATGTGGGGGAGGAGGA

主要对PCR退火温度进行优化。

克氏针茅基因特异性引物序列退火温度为55℃、羊草基因特异性引物序列退火 温度为57℃、糙隐子草基因特异性引物序列退火温度为60℃、小叶锦鸡儿基因特 异性引物序列退火温度为62℃、冷蒿基因特异性引物序列退火温度为65℃、猪毛 菜基因特异性引物序列退火温度为55℃，同时以琼脂糖凝胶电泳检验待测植物引 物对的特异性。

实验结果：

克氏针茅特异性引物PCR扩增后琼脂糖凝胶检测及荧光定量PCR结果，如图1 所示，琼脂糖凝胶电泳只在底物为克氏针茅DNA时有特异性条带；荧光定量PCR 扩增曲线平滑单一。

羊草特异性引物PCR扩增后琼脂糖凝胶检测及荧光定量PCR结果：如图2所 示，琼脂糖凝胶电泳只在底物为羊草DNA时有特异性条带；荧光定量PCR扩增 曲线平滑单一。

糙隐子草特异性引物PCR扩增后琼脂糖凝胶检测及荧光定量PCR结果，如图3 所示，琼脂糖凝胶电泳只在底物为糙隐子草DNA时有特异性条带；荧光定量PCR 扩增曲线平滑单一。。

小叶锦鸡儿特异性引物PCR扩增后琼脂糖凝胶检测及荧光定量PCR结果，如 图4所示，琼脂糖凝胶电泳只在底物为小叶锦鸡儿DNA时有特异性条带；荧光 定量PCR扩增曲线平滑单一。

冷蒿特异性引物PCR扩增后琼脂糖凝胶检测及荧光定量PCR结果，如图5所 示，琼脂糖凝胶电泳只在底物为冷蒿DNA时有特异性条带；荧光定量PCR扩增 曲线平滑单一。

猪毛菜特异性引物PCR扩增后琼脂糖凝胶检测及荧光定量PCR结果，如图6 所示，琼脂糖凝胶电泳只在底物为猪毛菜DNA时有特异性条带；荧光定量PCR 扩增曲线平滑单一。

实施例2、检测蝗虫食物偏好性

混合3次试验重复所得单一植物（克氏针茅、羊草、糙隐子草）饲喂的蝗虫嗉 囊，提取DNA，植物特异性引物荧光定量PCR检测对应植物的拷贝数，用上述方程 对应回蝗虫嗉囊内含物中该植物的重量。将其与传统方法所得蝗虫每小时摄入体内 的植物重量比较，检验荧光定量PCR技术测定蝗虫食量方法的准确性（如图7-1、 7-2、7-3所示）。

通过对六组数据的变化趋势及各组数据的标准差进行比较分析，选定每日 15时（即蝗虫开始取食后三小时）蝗虫嗉囊内含物的质量代表蝗虫每小时的 食量，蝗虫采食时间一般为10:00-16:00，算得亚洲小车蝗成虫食量，雄虫： 克氏针茅0.291±0.018g/d，羊草0.223±0.043g/d，糙隐子草0.293±0.023g/d，雌 虫:克氏针茅0.357±0.015g/d，羊草0.239±0.019g/d，糙隐子草0.449±0.146g/d。 亚洲小车蝗室内不吃小叶锦鸡儿、冷蒿、猪毛菜，所以用小叶锦鸡儿、冷蒿、猪毛 菜基因特异性引物在蝗虫嗉囊DNA里未现扩增。