一种香椿叶中没食子酸及其甲酯的同时制备及检测方法

摘要

本发明一种香椿叶中没食子酸及其甲酯的同时制备及检测方法，属于中药技术领域。采用的制备方法通过提取、萃取和两次柱色谱即可从中药香椿叶中同时获得没食子酸和没食子酸甲酯，避免使用多种柱色谱填料和反复柱层析，操作简便，时间和试剂消耗低；采用的检测方法利用实验室常备的高效液相色谱仪，分离度、准确性、重现性、稳定性等各种方法学指标均符合含量测定的要求，可靠性高，可用于分析不同来源、批次的香椿叶药材中没食子酸和没食子酸甲酯的含量，能满足药理活性测试以及对该中药进行常规质量控制的需要。

说明书

 

技术领域

    本发明涉及利用高效液相色谱技术对香椿叶中两种抗氧化活性物质没食子酸和没食子酸甲酯进行同时制备以及定量检测，属于中药技术领域。

背景技术

    楝科乔木香椿（Toona sinensis A. Juss. Roemer）广泛分布于整个亚洲，尤其在中国和印度地区普遍栽培，春季采收的新鲜嫩叶（Chinese Toon）是当地民众最喜欢的时令蔬菜之一。此外，香椿叶（Toonea Sinensis Folium）为该植物的干燥树叶，是一味具有解毒和消炎功效的中药，临床中主要被用于治疗口臭、呕吐、痢疾、食欲不振、肠炎和瘙痒等病症，到目前为止在使用中尚未观察到任何副作用。

    一方面，因为抗氧化剂可有效地减轻氧化应激；另一方面，尽管合成抗氧化剂在很长时间内已广泛用于食品、药品或化妆品，但是其安全性存疑，引起人们的普遍焦虑；因此，近年来植物源性抗氧化剂逐渐成为科学家研究的重点。

目前，对香椿叶中活性物质基础的提取分离主要为某类化合物的总体。例如，中国专利200510069895.5中，以60%乙醇于60^oC下提取2次，每次提取60分钟，经过过滤、浓缩和干燥，最终可分别同时得到90%提取率的总黄酮与总皂甙；中国专利200810073836.9、201010263595.1中，分别采用双水相体系、表面活性剂辅助等方法富集香椿叶中的总黄酮；中国专利200710058385.7中，利用60%乙醇提取、AB-8大孔吸附树脂获取具有抗氧化活性的提取物。

另外，2007年Kai-Jin Wang等（Food Chemistry，Vol. 101，P365～371）以80%丙酮冷浸提取，粗提物依次用乙醚、乙酸乙酯分别萃取，然后结合使用Diaion HP20SS、Sephadex LH-20、MCI-gel CHP20P和Chromatorex ODS四种填料经过反复柱层析从乙酸乙酯萃取部位中分离得到了没食子酸、没食子酸甲酯，并且用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除实验证明了两者均具有突出的抗氧化活性；2009年Ka-Wing Cheng等（Journal of Functional Foods，Vol. 1，P253～259）以70%甲醇超声提取，将氯仿萃取后的萃余物用反相键合C₁₈、Sephadex LH-20、Polyamide-6、正相硅胶为填料或采用半制备高效液相色谱进行分离，获得了没食子酸、没食子酸甲酯；但是，该些方法均使用了价格高昂的Sephadex LH-20为填料，且分离中涉及使用多种分离材料进行反复柱层析，至少经过三次柱色谱分离，步骤繁琐，时间和试剂消耗大；而使用半制备高效液相色谱法时，处理量较小，并且这两种活性化合物在进行初步分离时分散于不同的流分，导致后续实验中不能对两者进行同时制备。

在检测方面，2002年张仲平等（中国野生植物资源，Vol. 2（14），P52～53）、2011年Ying Yang等（Food Chemistry，Vol. 128，P831～838）仅对香椿叶中的没食子酸进行了定性检识。2006年Ming-Mu Hsieh等（Journal of the Chinese Chemical Society，Vol. 53，P1203～1208）利用胶束电动毛细管电泳对没食子酸、没食子酸甲酯等多酚类成分进行定量分析，但是两者与其它成分未实现基线分离（R<1.5），且并未对准确性、重现性、稳定性等重要技术指标进行考察，可靠性差；除此之外，由于可调节参数较少、应用范围较窄等原因，在医药化工行业的生产实践中，毛细管电泳的普及程度远不如高效液相色谱，造成实际应用困难。

现代高效液相色谱技术按照应用目的，可分为制备型和分析型两种，均具有速度快、产物纯度与回收率高、分离填料可反复利用等特点，是目前对中药及食品中活性化合物进行分离与分析的最为常用的技术手段。到目前为止，基于该技术对这两种抗氧化活性物质在香椿叶药材中的同时制备方法及相应的定量分析方法尚未加以研究。

 

发明内容

    本发明的目的在于克服现有技术不能对没食子酸及其甲酯进行同时制备、操作繁琐、代价高昂、分析的可靠性差、应用困难等不足，提供一种基于高效液相色谱技术从香椿叶中同时制备两种植物源性抗氧化剂没食子酸和没食子酸甲酯，并测定香椿叶药材中这两种成分含量的方法。

本发明通过以下步骤达到同时制备没食子酸和没食子酸甲酯的目的：

一种香椿叶中没食子酸及其甲酯的同时制备方法，按照下述步骤进行：

    1）新鲜采摘的香椿叶置于通风处阴干，粉碎，得细粉，加入5～7倍量（g/mL）85～95%（v/v）乙醇，超声提取，每次1～1.5小时，提取2～3次，合并提取液，50^oC以下减压回收溶剂，得浸膏；

2）浸膏中加入6倍量（g/mL）水混悬，以等量水饱和正丁醇萃取3次，合并萃取液，减压回收溶剂，得正丁醇萃取物；

3）正丁醇萃取物干法上样载入硅胶柱进行分离，萃取物与硅胶质量比例为1:50～70；以二氯甲烷-甲醇-水-甲酸体积比例为100:10:1:0.3～100:15:3:3的混合溶液为洗脱剂，进行等度洗脱；以硅胶质量:流分体积为1:1～1.5（g/mL）收集一份流出液，收集第5～8份流分，合并，减压回收溶剂，得初步纯化物；

3）将初步纯化物:甲醇以比例为1:30～50（g/mL）进行溶解，溶液载入制备型高效液相色谱仪进行分离，分别收集6min～9min和9min～12min两个流份；将流份分别于50^oC以下减压浓缩至干，得白色固体I和白色固体II，经过核磁共振氢谱和碳谱分析，并与文献数据进行对照，确认白色固体I为没食子酸，白色固体II为没食子酸甲酯。

其中步骤3）中的色谱条件为：流动相为甲醇-0.1%～0.2%三氟乙酸水溶液（v/v）体积比例为5%～15%:95%～85%等度洗脱；进样量为4～5mL；流速为20～30mL/min；色谱柱填料为5μm的C₈或C₁₈反相键合硅胶；色谱柱尺寸为内径15mm～30mm、长度150mm～250mm；紫外检测波长为270nm。

  一种香椿叶中没食子酸及其甲酯的同时检测方法，按照下述步骤进行：

    （1）对照品溶液制备（内标法）：

    将没食子酸:没食子酸甲酯:甲醇以比例为1:1:2.5（mg/mg/mL）溶解得对照品母液；以没食子酸乙酯为内标物，按比例为1:2（mg/mL）溶于甲醇，得内标物母液；取适量对照品母液和内标物母液混合，加入甲醇将对照品母液稀释至原浓度的1/2、1/5、1/10、1/20、1/50和1/100，将内标物母液稀释至原浓度的1/20，得不同浓度的6份混合对照品工作溶液；另将内标物母液用甲醇稀释到原浓度的1/20，得到含内标物的甲醇溶液。

    所述的没食子酸、没食子酸甲酯和没食子酸乙酯的化学结构和分子量如下所示：

    （2）样品溶液制备（内标法）：

    精密称取香椿叶粉末，加入含内标物的甲醇溶液，比例为1:20（g/mL），超声辅助提取（600W，40kHz）45～60分钟，冷却至室温，摇匀，混悬液通过0.45μm微孔滤器，收集续滤液。

    （3）高效液相色谱分析条件：

    流动相由A和B组成，其中A为乙腈，B为0.1%～0.2%乙酸水溶液（ν/ν）；流速为0.9 mL/min～1.0mL/min；色谱柱填料为5μm的C₈或C₁₈；色谱柱尺寸为内径4.6mm、长度150mm～250mm；柱温为30^oC～40^oC；进样量为5～10μL；检测波长为270nm；梯度洗脱程序为（以体积百分比计算）0min，A：3%～5%、B：97%～95%；18min，A：30%～35%、B：70%～65%。

本发明方法的方法学考察和浓度计算方法：

    以标准品没食子酸、没食子酸甲酯和没食子酸乙酯进行本发明方法的方法学考察，得到本发明的线性范围分别为5.00～200μg/mL 和5.00～250μg/mL，相关系数在0.9999以上；检测限均为0.2μg/mL（信噪比≥3）；定量限分别为0.8μg/mL和1.0μg/mL（信噪比≥10）；两个被检测物均与其它成分达到基线分离（R>1.5）；日内及日间精密度、重现性、稳定性相对标准偏差RSD<2%；加样回收率在90%～110%（RSD<5%）。按内标法计算得到不同来源、批次香椿叶中没食子酸和没食子酸甲酯的含量。

    本发明的有益效果如下：

    （1）本发明的制备方法仅通过两次柱色谱即可从中药香椿叶中同时获得没食子酸和没食子酸甲酯，避免使用了Sephadex LH-20等多种填料和反复柱层析，操作简便，时间和试剂消耗低。

    （2）本发明的检测方法经过系统的方法学考察，分离度、准确性、重现性、稳定性等各种方法学指标均符合含量测定的要求，是一种可靠性高的测定方法。

    （3）本发明利用实验室常备的高效液相色谱仪，可清楚明了地分析不同来源、批次的香椿叶药材中没食子酸和没食子酸甲酯的含量，能满足药理活性测试以及对该中药进行常规质量控制的需要。

附图说明

图1是没食子酸和没食子酸甲酯的制备高效液相色谱图；图中7.20min色谱峰为没食子酸；10.98min色谱峰为没食子酸甲酯。

图2是没食子酸的核磁共振氢谱。

图3是没食子酸的核磁共振碳谱。

图4是没食子酸甲酯的核磁共振氢谱。

图5是没食子酸甲酯的核磁共振碳谱。

图6是没食子酸、没食子酸甲酯和没食子酸乙酯的分析高效液相色谱图；图中6.98min色谱峰为没食子酸；12.01min色谱峰为没食子酸甲酯；15.76min色谱峰为没食子酸乙酯。

 

具体实施方式

制备实施例1

香醇叶细粉1kg用85%乙醇5L超声提取2次，每次1小时，合并提取液，50^oC以下减压回收溶剂，得浸膏；加入6倍量水混悬，以等量水饱和正丁醇萃取3次，合并萃取液，减压回收溶剂，所得正丁醇萃取物干法上样载入硅胶柱分离，萃取物与硅胶质量比例为1:50，以二氯甲烷-甲醇-水-甲酸体积比例为100:10:1:0.3等度洗脱，以硅胶:流分体积为1:1.5（g/mL）收集一份流出液，收集第6～7份流出液，合并，减压回收溶剂，得初步纯化物；将初步纯化物:甲醇以比例为1:30（g/mL）溶解，溶液载入制备型高效液相色谱仪进行分离；仪器：Waters制备型HPLC仪（由2545型二元梯度仪、2767型样品控制器、2489型紫外可见检测器、515型泵、泵控制器Ⅱ以及10000:1分流器组成）；色谱柱：Waters SunFire Prep C₁₈（15mm I.D.×150mm L.，5μm）；流动相为甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液体积比例为5%:95%；进样量为4mL；流速为20mL/min；紫外检测波长为270nm；典型制备液相色谱图如图1所示；分别收集7min～9min和10min～12min两个流份，然后将流份分别于50^oC下减压浓缩至干，即得没食子酸和没食子酸甲酯，两个化合物的核磁共振氢谱和碳谱如图2、图3、图4和图5所示。

制备实施例2

香醇叶细粉100g用90%乙醇700mL超声提取3次，每次1.5小时，合并提取液，50^oC以下减压回收溶剂，得浸膏；加入6倍量水混悬，以等量水饱和正丁醇萃取3次，合并萃取液，减压回收溶剂，所得正丁醇萃取物干法上样载入硅胶柱分离，萃取物与硅胶质量比例为1:70，以二氯甲烷-甲醇-水-甲酸体积比例为100:12:2:1等度洗脱，以硅胶:流分体积为1:1.2（g/mL）收集一份流出液，收集第6～8份流出液，合并，减压回收溶剂，得初步纯化物；将初步纯化物:甲醇以比例为1:30（g/mL）溶解，溶液载入制备型高效液相色谱仪进行分离；仪器：Waters制备型HPLC仪（由2545型二元梯度仪、2767型样品控制器、2489型紫外可见检测器、515型泵、泵控制器Ⅱ以及10000:1分流器组成）；色谱柱：Waters SunFire Prep C₁₈（15mm I.D.×150mm L.，5μm）；流动相为甲醇-0.2%三氟乙酸水溶液（v/v）体积比例为10%:90%；进样量为4mL；流速为20mL/min；紫外检测波长为270nm；分别收集7min～9min和10min～12min两个流份，将流份分别于50^oC下减压浓缩至干，即得没食子酸和没食子酸甲酯。

制备实施例3

香醇叶细粉100g用90%乙醇600mL超声提取3次，每次1.5小时，合并提取液，50^oC以下减压回收溶剂，得浸膏；加入6倍量水混悬，以等量水饱和正丁醇萃取3次，合并萃取液，减压回收溶剂，所得正丁醇萃取物干法上样载入硅胶柱分离，萃取物与硅胶质量比例为1:70，以二氯甲烷-甲醇-水-甲酸体积比例为100:10:3:3等度洗脱，以硅胶:流分体积为1:1（g/mL）收集一份流出液，收集第5～6份流出液，合并，减压回收溶剂，得初步纯化物；将初步纯化物:甲醇以比例为1:50（g/mL）进行溶解，溶液载入制备型高效液相色谱仪进行分离；仪器：Waters制备型HPLC仪（由2545型二元梯度仪、2767型样品控制器、2489型紫外可见检测器、515型泵、泵控制器Ⅱ以及10000:1分流器组成）；色谱柱：汉邦Lichrospher C₈（30mm I.D.×250mm L.，5μm）；流动相为甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液（v/v）体积比例为15%:85%；进样量为5mL；流速为30mL/min；紫外检测波长为270nm；分别收集6min～8min和9min～11min两个流份，将流份分别于50^oC下减压浓缩至干，即得没食子酸和没食子酸甲酯。

检测实施例1

1 材料

1.1 仪器

Shimadzu Prominence高效液相色谱仪，配备DGU-14A脱气机、LC-10AT VP泵、CTO-10ASVP柱温箱、FCV-10ALVP Mixer SUS混合器、SPD-M10AVP二极管阵列检测器和SCL-10AVP系统控制器，用Class-VP软件记录与分析数据。

色谱柱：Waters XBridge Shield RP18柱（4.6mm I.D.×150mm L.，5μm）。

1.2 药品与试剂

乙腈和乙酸为色谱纯，购自Tedia公司；甲醇为分析纯，购自国药集团上海化学试剂公司；超纯水（>18.2MΩ·cm）；0.45μm微孔滤器（Fisher）；内标物没食子酸乙酯（98%）购自Aladdin试剂公司。

2 对照品和样品溶液制备

2.1 对照品溶液制备

将没食子酸、没食子酸甲酯溶解于甲醇，比例为1:1:2.5（mg/mg/mL），作为对照品母液，将没食子酸乙酯溶于甲醇，比例为1:2（mg/mL），作为内标物母液。取适量对照品母液和内标物母液混合，加入甲醇将对照品母液稀释至原浓度的1/2、1/5、1/10、1/20、1/50和1/100，将内标物母液稀释至原浓度的1/20，得不同浓度的6份混合对照品工作溶液；另将内标物母液用甲醇稀释到原浓度的1/20，得到含内标物的甲醇溶液。

2.2 样品溶液制备

精确称取香醇叶粉末，加入含内标物的甲醇溶液，比例为1:20（g/mL），超声辅助提取（600W，40kHz）60分钟，冷却至室温，摇匀，混悬液通过0.45μm微孔滤器，收集续滤液。

3 仪器条件

3.1液相色谱条件

流动相：A：乙腈；B：0.1%乙酸水溶液（ν/ν）。

流速：1.0mL/min。

进样量：5μL。

柱温：40^oC。

检测波长：270nm。

梯度洗脱（以体积百分比计算）：0min，A：3%、B：97%；18min，A：30%、B：70%。

3.2 方法学考察

分别测定分离度、稳定性、重现性、精密度，要求相对标准偏差RSD≤5，检测限要求信噪比≥3，定量限要求信噪比≥10，得本发明方法没食子酸和没食子甲酯的检测限均为0.2μg/mL；定量限分别为0.8μg/mL和1.0μg/mL；两个被检测物均与其它成分达到基线分离（R>1.5）；线性范围分别为4～200μg/mL 和5～250μg/mL，相关系数在0.9999以上；日内及日间精密度相对标准偏差RSD≤2；重现性相对标准偏差RSD<2%；稳定性相对标准偏差RSD<2%；加样回收率在90%～110%（RSD<5%）。

3.3 检测结果

典型高效液相色谱图如图6所示；经确认，香椿叶中没食子酸和没食子酸甲酯的保留时间分别为6.98min和12.01min；此外，不同批次香椿叶药材中没食子酸和没食子酸甲酯的含量范围分别为0.20～1.8mg/g和0.17～0.9mg/g。

检测实施例2

1 材料

1.1 仪器

Shimadzu Prominence高效液相色谱仪，配备DGU-14A脱气机、LC-10AT VP泵、CTO-10ASVP柱温箱、FCV-10ALVP Mixer SUS混合器、SPD-M10AVP二极管阵列检测器和SCL-10AVP系统控制器，用Class-VP软件记录与分析数据。

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C₈柱（4.6mm I.D.×250mm L.，5μm）。

1.2 药品与试剂

乙腈和乙酸为色谱纯，购自Tedia公司；甲醇为分析纯，购自国药集团上海化学试剂公司；超纯水（>18.2MΩ·cm）；0.45μm微孔滤器（Fisher）；内标物没食子酸乙酯（98%）购自Aladdin试剂公司。

2 对照品和样品溶液制备

2.1 对照品溶液制备

将没食子酸、没食子酸甲酯溶解在甲醇中，比例为1:1:2.5（mg/mg/mL），作为对照品母液，将没食子酸乙酯溶于甲醇，比例为1:2（mg/mL），作为内标物母液。取适量对照品母液和内标物母液混合，加入甲醇将对照品母液稀释至原浓度的1/2、1/5、1/10、1/20、1/50和1/100，将内标物母液稀释至原浓度的1/20，得不同浓度的6份混合对照品工作溶液；另将内标物母液用甲醇稀释到原浓度的1/20，得到含内标物的甲醇溶液。

2.2 样品溶液制备

精确称取香醇叶粉末，加入含内标物的甲醇溶液，比例为1:20（g/mL），超声辅助提取（600W，40kHz）45分钟，冷却至室温，摇匀，混悬液通过0.45μm微孔滤器，收集续滤液。

3 仪器条件

3.1液相色谱条件

流动相：A：乙腈；B：0.2%乙酸水溶液（ν/ν）。

流速：0.9mL/min。

进样量：10μL。

柱温：30^oC。

检测波长：270nm。

梯度洗脱（以体积百分比计算）：0min，A：5%、B：95%；18min，A：35%、B：65%。

3.2 方法学考察

分别测定分离度、稳定性、重现性、精密度，要求相对标准偏差RSD≤5，检测限要求信噪比≥3，定量限要求信噪比≥10，得本发明方法没食子酸和没食子甲酯的检测限均为0.2μg/mL；定量限分别为1.5μg/mL和1.9μg/mL；两个被检测物均与其它成分达到基线分离（R>1.5）；线性范围分别为4～200μg/mL 和5～250μg/mL，相关系数在0.9999以上；日内及日间精密度相对标准偏差RSD≤2；重现性相对标准偏差RSD<2%；稳定性相对标准偏差RSD<2%；加样回收率在90%～110%（RSD<5%）。

3.3 检测结果

    经确认，香椿叶中没食子酸和没食子酸甲酯的保留时间分别为8.65min和13.88min；此外，不同批次香椿叶药材中没食子酸和没食子酸甲酯的含量范围分别为0.20～1.8mg/g和0.17～0.9mg/g。