使用聚焦声制备用于纳米递送之纳米制剂和系统的组合物和方法

摘要

聚焦超声声处理(focused ultrasonic acoustic processing)用于制备范围为约10nm至约50微米(例如，1微米至20微米)或约10nm至约400nm(例如，10nm至100nm)的制剂颗粒。制剂(例如，纳米制剂)可包括混悬剂(例如，纳米混悬剂)、乳剂(例如，纳米乳剂)或其他小颗粒系统。制剂可用作治疗剂的递送系统。制剂还可包括微米或亚微米大小的颗粒分散在溶剂中的混悬剂。或者，制剂可包括生物活性剂和包封所述生物活性剂的载体化合物如表面活性剂(例如，含有药物、多核苷酸等的脂质体/微团)。在一些情况下，制剂中颗粒大小分布的多分散指数小于0.1。制剂可合适地使用导致混合物平均颗粒大小降低的聚焦声能来制备。或者，合适的制剂可使用聚焦声以不降低所述混合物平均颗粒大小的方式来制备。

说明书

本申请要求2011年1月21日提交的美国临时申请no.61/434,941和2010年7月1日提交的美国临时申请no.61/360,700的权益，其通过引用整体并入本文。

背景技术

1.发明领域

本文中描述的一些方面涉及使用聚焦声能(focused acoustic energy)来制备用于纳米递送的制剂(例如，纳米制剂(nanoformulation))和/或系统。在一些情况下，本文中讨论的纳米递送系统可用于与递送生物活性剂相关的领域。

2.相关领域

声处理系统(acoustic treatment system)可用于使样品暴露于声场(acoustic field)。可进行声处理的样品包括遗传物质(例如，DNA、RNA)、组织材料(例如，骨、结缔组织、血管组织)、植物材料(例如，叶、种子)、细胞以及其他物质。声处理系统可用于处理生物和域非生物物品。在一些安排下，声能(acoustic energy)可相对强烈，引起样品材料被破碎、裂解或以其他方式破坏。例如，可将含有多个细胞的样品暴露于声处理，以致细胞膜和其他组分被破坏或以其他方式降解，从而使DNA或其他遗传物质释放到液体中。然后可收集所述遗传物质并将其用于多种类型的分析。声处理系统使用声换能器(acoustic transducer)来为这些过程产生合适的声场。所述声场被聚焦或以其他方式安排，从而引起对样品材料的期望作用。此类系统的实例在美国专利No.6,948,843；6,719,449；7,521,023；和7,687,026中描述。

发明概述

本文中描述的一些方面涉及使用聚焦超声声处理(focused ultrasonicacoustic processing)的制备纳米制剂的组合物和方法。在纳米制剂的制备中，可将聚焦超声声能(focused ultrasonic acoustic energy)施用于含有至少两种不同组合物的混合物，以形成非常小之颗粒的紧密分布(tighdistribution)(例如，具有低多分散指数(polydispersity index))。在一些情况下，这样的小颗粒具有微米或纳米(亚微米)大小的特征。本文中所讨论的纳米制剂可包含在混悬剂(例如，纳米混悬剂)、乳剂(例如，纳米乳剂)或包含小颗粒之其他系统中的微颗粒和/或纳米颗粒。在一些实施方案中，尽管不是必需的，纳米制剂也还用作生物活性剂(例如药物和/或其他治疗性化合物)的纳米大小的递送系统。例如，纳米制剂可包含例如药物(pharmaceutical)、营养品(nutraceutical)和/或药用化妆品(cosmeceutical)的化合物。纳米制剂可包含分散在溶剂中的微米或亚微米大小之颗粒的混悬剂。或者，纳米制剂可包含生物活性剂和载体化合物(例如包封(encapsulate)生物活性剂(例如包含在脂质体中的药物)的表面活性剂)。

在纳米制剂的制备中，含有两种不同的组合物的混合物可放置于容器中，并暴露于小于2厘米大小的声能聚焦区(focal zone)。聚焦的声场可由声能来源(acoustic energy source)产生，所述来源在合适的功率水平下运作一定的时间，从而在所述混合物充分暴露于声场聚焦区之后可产生含有平均大小为约10nm至约50微米且相对紧密分布之多个颗粒的纳米制剂。在一些情况下，在所述混合物经受聚焦声处理之前混合物中的平均颗粒大小大于100微米，或大于200微米。根据所述混合物的处理方式，所产生的平均颗粒大小可小于10微米、小于1微米、在100nm至1微米之间或在10nm至100nm之间。在一些实施方案中，所产生的平均颗粒大小的范围是10nm至400nm。

在一些实施方案中，可用聚焦声能来处理具有多种组合物和起始平均颗粒大小分布的混合物，处理方式为降低所述混合物的平均颗粒大小和/或以其他方式产生单峰的并具有低多分散指数的颗粒大小分布。虽然，在混合物中降低颗粒大小和/或制备某种颗粒大小分布在一些情况下是有利的，但这不是本公开内容所必需的方面。在一些实施方案中，可根据聚焦声法对具有多种组合物的混合物进行合适的处理，从而使所述混合物的平均颗粒大小不降低，而是组装(assemble)或以其他方式形成期望大小范围的颗粒。

在一个举例说明性的实施方案中，提供了制备纳米制剂的方法。所述方法包括在容器中提供混合物，所述混合物包含第一组合物和第二组合物；使具有约100千赫至约100兆赫之频率和具有小于约2厘米大小之聚焦区的聚焦声能传送穿过所述容器的壁，从而使所述混合物至少部分地置于所述聚焦区中；和至少部分地通过将所述混合物暴露于所述聚焦区一段时间以在混合物中形成多个颗粒，在所述混合物暴露于所述聚焦区所述一段时间后，所述多个颗粒具有约10nm至约50微米的平均大小。

在另一个举例说明性的实施方案中，提供了用于制备纳米制剂的系统。所述系统包括容器；包含第一组合物和第二组合物的混合物，所述混合物置于所述容器中；和声能来源，其与所述容器隔开且在其外部并且适于发射聚焦声能，所述聚焦声能具有约100kHz至约100MHz的频率和穿过所述容器壁的具有小于约2cm大小的聚焦区，从而使所述混合物至少部分地置于聚焦区中，其中，在所述混合物暴露于聚焦区一段时间之后，所述混合物包含平均大小为约10nm至约50微米的多个颗粒。

本发明的多个实施方案提供了某些优点。本发明的所有实施方案并不共有同样的优点，并且共有同样优点的那些实施方案并不是在所有情况下都共有所述同样的优点。

下文中参照附图详细地描述了本发明的其他特征和优点以及本发明多个实施方案的结构。

附图简述

参照附图通过举例的方式来描述本发明的一些非限制性实施方案，所述附图是示意性的且并不旨在按比例绘制。在图中，图示的每个相同或几乎相同的组件通常由同一数字表示。为了清楚的目的，并不是在每幅图中对每个组件都进行标记，当图示对于本领域普通技术人员理解本发明来说并不必需时，也并不示出本发明每个实施方案的每个组件。图中：

图1示出了根据一个举例说明性实施方案之声处理系统的示意图；

图2图示了根据一个举例说明性实施方案之另一声处理系统的示意图；

图3描述了根据一个举例说明性实施方案之另一声处理系统的示意图；

图4示出了根据一个举例说明性实施方案之不同声处理系统的示意图；

图5图示了根据一个举例说明性实施方案之另一声处理系统的示意图；

图6示出了根据实施例的声处理之前和之后混合物中颗粒的显微照片；

图7描述了根据一个实施例在处理混合物期间随时间之平均颗粒大小的图；

图8图示了根据另一个实施例在处理混合物期间随时间之平均颗粒大小的图；

图9描述了根据一个实施例在处理混合物期间随时间之平均颗粒大小的图；

图10图示了根据一个实施例在处理混合物期间随时间之平均颗粒大小的图；

图11示出了根据另一个实施例的混合物颗粒大小分布的图；

图12示出了根据不同实施例的混合物颗粒大小分布的图；

图13图示了处理前根据一个实施例的混合物颗粒大小分布的图；

图14图示了聚焦声处理之后根据图13的实施例的混合物颗粒大小分布的图；

图15图示了聚焦声处理之后根据图13的实施例的混合物颗粒大小分布的另一幅图；

图16描述了根据一个实施例的混合物颗粒大小分布的图；和

图17描述了根据另一个实施例的混合物颗粒大小分布的图。

发明详述

本公开内容涉及用于制备具有窄分布之期望颗粒大小分布的纳米制剂的利用聚焦声的系统和方法，并且所述系统和方法还可重复、可控、快速产生结果、避免样品材料的交叉污染，并且是等温的(即，避免样品的过热)。这样的纳米制剂和以简单、方便的方式产生它们的能力可用于增进治疗性递送的现有方法，以及用于治疗性递送的制备系统。合适的纳米制剂可包括混悬剂、乳剂或不同的小颗粒系统中的颗粒。在一些情况下，纳米制剂可用于递送治疗剂。本文提供的纳米制剂的实例包括分散在溶剂中微米或亚微米大小之颗粒的混悬剂，或配置在载体组合物(例如，载体中的脂质体)中的生物活性剂。如本文所述，纳米制剂可被认为是包含亚微米大小之颗粒的制剂。

根据所描述的方法生产的纳米制剂可包含平均颗粒大小为约10nm至约50微米(或在一些情况下为约10nm至约400nm)的混合物。在一些实施方案中，颗粒大小分布相对紧密，例如具有小于0.1的多分散指数。在一些实施方案中，纳米制剂可通过使具有多种组合物的混合物经受聚焦声能来制备，制备方式为降低混合物的平均颗粒大小和/或以其他方式(例如，通过形成脂质体)处理混合物，以产生具有低多分散指数的单峰颗粒大小分布。在另一些实施方案中，纳米制剂可通过向混合物施用聚焦声能来制备，制备方式不显著降低所述混合物的平均颗粒大小，而是通过将组分组装在一起(例如形成脂质体)而形成期望大小范围的颗粒。

本发明人已经认识并领会到，用市场上现有的几种药物，通过制药工业生产的大量化学组合物是亲脂性(可溶性差)化合物。作为如此差溶解度的结果，药剂趋于表现出生物半衰期短、生物利用度差、明显的不良作用和整体降低的稳定性。然后是在临床前阶段评价此类组合物，所述组合物经常作为水基混悬剂而经口服用。与服用溶液制剂相比，服用水基混悬剂不利的一面是可能出现不利的体内结果，例如降低的生物利用度和更高的对象间可变性。相反地，使用常规方法但却不用无毒水平的赋形剂和/或不消耗相当大的资源就不易获得溶液制剂，从而使多个化合物的早期评价无法实现。

生产具有期望(并且相对小)颗粒大小的混悬剂可有助于缓和前述问题。本发明人认识并领会到，快速且方便地形成跨越一系列样品容量和浓度、无污染(例如，来自重复使用可重复使用的探针)或降解(例如，由于过度加热)的具有期望颗粒大小之混悬剂的常规方法并不理想。传统方法通常产生宽的颗粒大小分布(例如，高多分散指数)，这与紧密、窄的颗粒大小分布(例如，低多分散指数)相反。配制用于临床前经口服用之简单混悬剂的常规方法包括声波处理、匀浆(homogenization)、微流化、搅拌和/或使用用于提升同质性的赋形剂(例如具有表面活性的湿润剂或聚合物)。

尚未发现机械匀浆理想地用于生产混悬剂，因为所述技术在制剂中产生泡沫，并且不提供用于减轻交叉污染的方法。此外，微流化除了允许在处理室中的交叉污染之外，还有产生非常大量热的趋势。微流化的其他缺点包括处理后样品必须用热交换器冷却，和样品必须频繁地多次通过微流化系统，致使样品材料不可完全回收。作为额外的步骤，配制前研磨化合物为整个处理添加了更多的时间，且由于需求而进行更多的步骤，所以引入了更大的产率损失。

虽然超声已用于多种诊断、治疗和研究目的，但是生物物理学、化学和机械的作用通常仅被经验性地理解。在材料处理中对声能(sonic energy或acoustic energy)的一些使用包括“超声处理”，其是机械破坏的未精制处理，涉及将发射低千赫(kHz)范围(例如，15kHz)能量的未聚焦超声来源直接浸入被处理材料的流体混悬剂中。因此，声能由于声波的未聚焦和随机性而产生不一致的结果，并且易于诱导样品过热，这是因为能量被分散、吸收和/或未与靶标适当地对齐。

与先前使用声能相反，本文中所描述的在纳米制剂的制备中使用“聚焦声”有显著的益处，包括以下列出的那些。聚焦声提供独特的益处，其允许产生具有期望颗粒大小分布的纳米制剂(例如，具有窄单峰分布的合适的颗粒大小范围)。在声处理期间，聚焦声还为纳米制剂的处理和产生提供极少的(或没有)样品加热(即，提供等温处理)。组合物可在包容环境(contained environment)(即，封闭系统)下处理，使得无污染风险的无菌非接触式操作成为可能。与制备纳米制剂的常规方法(例如，研磨、微流化、匀浆等)相比，最终回收产率显著提高(例如，100％的材料回收)。聚焦声处理在小量(例如，小于10mL)和大量(例如，大于250mL)处理体积之间可高度地扩展。聚焦声可用于制备具有宽范围浓度的纳米制剂，其中对于不同的混合物(在混合物中具有大幅不同浓度的特定组合物)出现基本相同的处理结果(例如，在具有浓度低至1mg/mL和高至100mg/mL的不同混合物的聚焦声处理之后，结果可以是相似的)。本文中描述的聚焦声法还可涉及简单的处理操作，与常规超声处理或制备纳米制剂的方法相比，需要更少的操作人力和更低的操作技能组合(skillset)。本文中讨论的使用聚焦声法的纳米制剂可表现出延长的保质期，极少或没有活性成分(例如，治疗剂)的降解，而这可发生于形成纳米制剂的常规方法中。聚焦声使得能够在混合物中使用宽范围的表面活性剂和分散介质；以及能够使用含低浓度表面活性剂和分散介质的混合物，或可能完全不使用表面活性剂和分散介质。此外，聚焦声能可用于裂解细胞，并因此杀死细菌和病毒，因此提供将目标组合物灭菌的方法。可根据Covaris，Inc，Woburn，MA提供的适应性聚焦声(adaptive focused acoustics，AFA)法来使用聚焦声。

本文中呈现的系统和方法将聚焦声用于可控、快速且方便地制备具有紧密分布的小颗粒大小纳米制剂，而避免例如样品污染和过度加热的缺点。在一些实施方案中，可通过在合适的条件下使组合物的混合物经受声能聚焦区从而形成具有约10nm至约50微米(例如，20nm至100nm、100nm至1微米、1微米至20微米)平均大小的颗粒来制备纳米制剂。在一些情况下，将组合物的混合物在某些条件下暴露于聚焦声能，会大幅降低混合物中颗粒的平均大小。在一些情况下，通过对组合物的混合物进行聚焦声处理来制备纳米制剂可涉及生产具有紧密分布的小颗粒，在混合物中没有已存在颗粒大小的大幅降低。

本文中描述的混合物和/或纳米制剂的颗粒大小分布可使用动态激光光散射法(dynamic laser light scattering)(还称为光子相关光谱法(photoncorrelation spectroscopy))来测量(例如，使用Malvern Zetasizer-S，Zetasizer Nano ZS-90或Mastersizer2000仪器；Malvern Instruments Inc.；Southborough MA)。Malvern Zetasizer-S仪器用于使用在波长633nm运作的4mW He-Ne激光和雪崩光电二极管探测器(avalanche photodiodedetector，APD)来评估平均颗粒大小。可作为平均水动力大小(hydrodynamic size)来评估混合物中颗粒的平均大小。颗粒大小分布可根据多分散指数(polydispersity index，PDI)来评估，其在本领域中被认作是分布紧密性的量度。本文中讨论的混合物和纳米制剂的平均大小和PDI根据动态光散射国际标准(International Standard on dynamic lightscattering)(ISO13321)来计算。

纳米制剂的颗粒可具有任何三维形状，例如球体、长方体、平行六面体、六面体、多面体等。应领会的是，本文中所用的术语“颗粒大小”，可指通过本领域已知方法评估的估计的颗粒大小。例如，颗粒大小可指假设大致是球体形之颗粒的估计的直径。或者，颗粒大小可指多面体(例如长方体)的估计的宽、长或其他维度。

聚焦声处理过程可根据本文中提供的系统和方法扩大规模。在一些实施方案中，处理容器可具有一个或更多个合适的入口和/或出口，其允许样品材料流入和流出容器。一旦在容器中合适地放置，样品材料就在适当设置的条件下经受聚焦声处理。足够程度的聚焦声处理之后，样品材料可从容器中排出，以允许之前未被处理的更多样品经受聚焦声处理。对于本文中描述的多个实施方案，可被认处理容器与处理室等同。

在一些实施方案中，声处理系统可包括储池(reservoir)和处理室(process chamber)，各自具有入口和出口，其彼此之间流体连通；即，允许流体通过合适的导管在储池与处理室之间移动(travel)。因此，可引起来自储池的样品材料移动至处理室，用于在合适的条件下进行聚焦声处理，随后可引起移动回至储池。结果，样品材料可周期式地被声处理，其中一部分样品材料可接受多次聚焦声处理。

在一些实施方案中，样品材料可从供给储池移动至用于聚焦声处理的处理室。被处理的样品材料可随后从处理室移动至与供给储池隔开的不同容器。

在一些实施方案中，样品材料可从供给储池移动通过用于不同水平处理(例如不同条件的聚焦声)的多个处理室。还可提供额外的导管用于样品材料的添加/移除。

图1举例说明了根据美国专利No.6,948,843；6,719,449和7,521,023描述的系统的聚焦声处理系统10。所述系统利用压电式换能器20产生朝向容器40所限定之空间内的样品42的声能波22。容器40位于流体浴容器30内，声耦合介质32(例如，水)位于其中并与容器的外表面相接触。声能波22从换能器20传送通过介质32，穿过容器40的壁并在容器壁内或与其接近的聚焦区24会聚。声波的频率可具有任何合适的范围，例如约100千赫至约100兆赫，或约500千赫至约10兆赫。聚焦区24与样品42邻近，从而向样品42施用非接触式等温机械能。聚焦区可具有任何合适的形状和大小，例如具有小于约2cm的宽度(例如，直径)。

本发明人已认识并领会到，用聚焦声系统的样品材料的处理过程扩大规模为更大体积的材料的处理是有利的。虽然图1的系统可包含允许换能器与容器之间的相对运动的机械和/或电机构(mechanism)，但样品材料通常包含在容器40所限定的空间内。同样，为处理随后的样品材料，换能器和/或容器应被移开。图2描述允许样品材料流入和流出的声处理系统10，其无需移动换能器20或容器50。图2的系统与图1所示系统相似，其包括具有样品材料52位于其中的容器50；但是，系统还包括样品来源60和样品排出装置(drain)70。容器50包括与导管64流体连通的入口62，以允许来自来源60的样品材料的流入，沿着箭头A的方向穿过导管64进入容器50。容器还包括出口72，其允许来自容器的样品材料流出，并沿着箭头B的方向进入导管74，这提供样品材料至排出装置70的流体流动。因此，该系统提供未处理样品材料移动到容器中、被聚焦声能处理并继而移动出容器的能力，这允许更多样品材料被聚焦声处理而不需要容器或换能器彼此相对运动。

图3描述了聚焦声处理系统100的另一个举例说明性实施方案，其使得用聚焦声处理样品材料的规模扩大方法成为可能。系统还提供多次处理样品材料的能力。系统包括用于容纳样品材料供给的储池120和提供用于样品材料经受声处理之空间的处理室110。储池120包括允许样品材料流入至储池和从储池流出的储池出口122和储池入口124。相似地，处理室110包括允许样品材料流入至处理室和从处理室流出的室入口112和室出口114。储池出口122允许样品材料沿着箭头C的方向从储池移动进入导管130，并进一步通过室入口112移动进入处理室。在样品材料的充分声处理后，适当量的样品材料可通过室出口114从处理室离开，进入导管140，从而沿着箭头D的方向通过储池入口124移动回到储池120中。

因此，与处理室的空间所限定的体积相比，更大量的样品材料可被声处理。此外，样品材料可被多次声处理，这是因为从处理室运送回储池的已处理材料，可最终引起从储池移动回到处理室用于进一步的声处理。

如本文中所描述的，可提供任何合适的结构作为入口和/或出口。例如，合适的入口和出口可包括喷嘴(nozzle)、孔、管、导管等。在一些情况下，入口和/或出口可包括装有阀的结构，当期望时其开放和关闭以控制材料的流入和流出。此外，处理室和储池不限制入口/出口的数目和位置。例如，处理室和/或储池可具有额外的入口或出口，用于使样品材料流动至在导管130、140旁的其他合适位置。

可提供任何合适的动力用于引起样品材料在储池与处理室之间的运动(例如，穿过导管130、140和各自的入口/出口)。在一些实施方案中，提供泵150以对样品材料加压，以使样品材料从储池移动到处理室并返回。可使用任何合适的泵装置。在一些情况下，泵与导管偶联，例如图3所示在导管140与泵150之间的偶联。可在系统的任何合适位置提供一个或更多个合适的泵。在一些实施方案中，无需泵装置，在系统的多个区域之间提供压差梯度。例如，可沿着导管130保持压力梯度，从而引起样品材料从储池通过储池出口122并通过室入口122进入处理室的流动。相似地，还可沿着导管140保持压力梯度，其引起样品材料从处理室通过室出口114，通过导管140并通过储池入口124进入储池的流动。

图4示出聚焦声处理系统200的另一个举例说明性实施方案，其使样品材料的大规模聚焦声处理成为可能。该系统提供样品材料通过处理室的单通道。所述系统包括：保存待处理样品材料之供应的第一储池220、提供用于样品材料经受声处理之空间的处理室210和用于接收已处理之样品材料的第二储池230。第一储池220包含储池出口222，以允许样品材料从储池沿着箭头E的方向进入导管240的流出。处理室210包含室入口212，其允许样品材料进入处理室的流入。处理期间，声换能器202产生声波204以形成合适的聚焦区206，样品材料暴露于其中。当样品材料被充分处理后，合适量的样品材料可从处理室离开，通过室出口214并进入导管250，从而沿着箭头F的方向移动并通过储池入口232进入第二储池230。如图3所提供的，虽然与处理室之体积所限定的样品材料量相比更大量的样品材料可在该系统中被声处理，但是样品材料的流动实际上不是循环的。

与关于图3的如上所述相似，可提供任何合适的动力以引起样品材料从第一储池220移动至处理室210，并从处理室移动至第二储池230。在一些实施方案中，提供泵260以迫使样品材料移动通过聚焦声处理系统。如图4所示(非限制性地)，泵260可与导管(例如，非限制性地，导管250)相偶联并被合适地操作。

图5描述了聚焦声处理系统300的一个举例说明性实施方案，其提供样品材料的大规模聚焦声处理，在其中采用了多个处理室。图示的系统允许样品材料穿过每个处理室，在其中样品材料可经受相似或不同的聚焦声处理条件。此外，如所期望的，可在处理室之间添加或移除一部分样品材料。

储池330保存待在第一处理室310和第二处理室320中处理的样品材料的供应，每个处理室均为样品材料提供经受聚焦声处理的空间。储池330包括储池出口332，其允许样品材料从储池的流出，并沿着箭头G的方向进入导管340。处理室310包含室入口312，其允许样品材料的流入处理室。声处理期间，换能器302提供声波304以形成合适的聚焦区306，样品材料暴露于其中。在样品材料被充分声处理后，合适量的样品材料可从处理室离开，通过室出口314并进入导管350。样品材料可沿着箭头I的方向移动并通过室入口322最终进入第二处理室320。样品材料可在与第一处理室310相同或不同的条件下在第二处理室320所限定的空间中经受进一步声处理。换能器303产生声波305，形成合适的聚焦区307，其可用于样品材料的声处理。合适的声处理后，样品材料可通过室出口324流出第二处理室320，并沿着箭头K的方向运动进入导管360，用于在排出装置362收集。

在一些实施方案中，如图5所示，提供泵380以提供动力来引起样品材料移动通过聚焦声处理系统。虽然泵380被描述为与导管340偶联，可领会的是，可在任何合适的位置将任何合适的泵与聚焦声处理系统相偶联。

可在系统中合适的位置提供导管370、372，从而允许按需求被添加和/或移除样品材料。例如，由于样品材料沿着导管340朝向第一处理室310流动，导管370可提供与样品材料一起在处理室310中待声处理的添加成分(例如，药物、载体表面活性剂等)。相似地，导管372还可移出或提供额外的成分，其可在处理室320中与样品材料一起被声处理。方向箭头H、J用以例示导管370、372可视情况而用来添加或移出材料。可以领会的是，任何聚焦声处理系统可视情况而提供某些位置，在其中样品材料可用额外的成分补充或在其中可从处理系统中移出部分样品材料。

在一些实施方案中，本文中描述的聚焦声处理系统可包括合适的代偿控制系统，用于感知声样品处理的特征并根据所感知的特征来调整系统的参数。例如，可监测样品材料的某特性，例如，样品材料的颗粒大小分布、在样品材料中的平均颗粒大小、在沿处理系统之多个位置处的样品材料体积、样品材料移动通过系统的速率或任何其他合适的特征。

例如，经受通过两个处理室中第一个的声处理后，系统可能感知到样品材料的平均颗粒大小比在那时期望的平均颗粒大小更大。结果，可据此调整第二处理室中样品材料的声处理(例如，处理可被延长，从换能器输出的功率可被提高，等)。或者，可期望样品材料中90％的颗粒应在某个大小范围内，并且测定了(由计算机或使用者监测大小范围)样品材料90％的颗粒在处理期间的那时小于优选的大小范围。因此，可据此调整处理参数，以使样品材料经受缩短的处理时间，导致在样品材料中颗粒大小之降低的总体降低。或者，可以测定，为合适地形成脂质体或微团以包封生物活性剂，在样品材料中提供了不足量的表面活性剂。因此，可将额外的表面活性剂注入(例如，通过导管370、372)样品材料中，从而可适当地形成脂质体/微团。还可监测样品材料的其他特征，产生对处理参数的合适调整。

例如，当组合物混合物中已存在的颗粒的大小降低时，在混合物中颗粒的平均起始大小范围可以是约10微米至约500微米，且在合适的条件下将所述混合物暴露于聚焦声能后，所产生的混合物中颗粒的平均大小的范围可以是，例如10微米至50微米，或10nm至100nm。在颗粒大小降低的另一个实例中，混合物中具有15mL至20mL体积(包括药物，例如布洛芬)之颗粒的平均起始大小可以是约200微米。将所述混合物暴露于在约150W功率、具有约1MHz频率的声能的聚焦区10分钟后，混合物中颗粒的平均大小可降低至约40微米。将混合物暴露于同样的聚焦声条件小于1小时(例如，30分钟)后，混合物中颗粒的平均大小可降低至小于100nm。提高混合物向聚焦声条件的暴露可产生具有甚至更小的平均颗粒大小的混合物。在一些实施方案中，将具有治疗组合物和载体组合物两者的混合物暴露于聚焦声能，可导致在混合物中颗粒受控地降低至混合物中颗粒平均起始大小的低至0.01％的百分比(例如，从200微米的平均大小至10nm的平均大小)。

本文中描述的混合物可例如以纳米制剂前体的形式包含数种组合物，或所述混合物可以是纳米制剂本身。在一些情况下，在混合物或纳米制剂中的一种或更多种组合物可以是任何药物、营养品、药用化妆品或其组合。

药物可用作混合物中的生物活性组合物，并可包括但不限于：选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator，SERM)(例如，他莫昔芬)、烷化剂(例如，取代的咪唑化合物(例如达卡巴嗪))、紫杉烷化合物(例如，紫杉醇)、核苷类似物(例如，吉西他滨)、他汀类(例如，洛伐他丁、阿托伐他汀、辛伐他汀，等)、嘧啶类似物(例如，5-氟尿嘧啶)、核酸分子(例如，DNA、RNA、mRNA、siRNA、RNA干扰分子、质粒，等)、药物(例如，布洛芬、桂利嗪、吲哚美辛、灰黄霉素、非洛地平、槲皮素，等)等。在本文所述纳米制剂中可包含任何合适的药物。

如讨论的那样，纳米制剂中的组合物可包含多核苷酸分子(例如，siRNA、RNA、DNA、质粒)或多肽化合物。根据一些实施方案，可制备包含siRNA或其他多核苷酸的纳米制剂而不使siRNA分子降解，或至少不使siRNA或其他分子显著降解。即，作为纳米制剂的一部分而提供的包含siRNA分子的组合物通常保留siRNA分子调节相应mRNA分子或其他靶标化合物之活性方面的功能，从而具有对蛋白质表达或靶标之其他功能的整体作用。所述多核苷酸或多肽化合物可以是针对靶标的反义化合物。在mRNA的情况下，可能被干扰的一些功能包括mRNA向蛋白质翻译位置的转位、蛋白质从mRNA的实际翻译、mRNA的剪接以产生一种或更多种mRNA种类、mRNA的周转或降解以及RNA可参与的可能的独立催化活性。对mRNA功能的此类干扰的整体作用可表现为调节一种或更多种蛋白质的表达，这可导致基因表达的升高(刺激)或降低(抑制)。

本发明人已认识到，与用于生产包含siRNA或其他多核苷酸的纳米制剂的不使用聚焦声的方法引起多核苷酸化合物的降解，例如，因为在处理纳米制剂期间向化合物引入的机械剪切、压力、异物污染和/或加热。使用聚焦声制备的包含siRNA或其他多核苷酸化合物的纳米制剂可具有更高的效力或其他性能，例如，因为在处理纳米制剂期间引入到材料中的更低的热量，以及所引入的降低的机械剪切、压力和/或污染物。例如在siRNA的情况下，分子相对不稳定，并在未灭菌环境和升高的温度水平中核酸酶的影响下发生降解。用于生产含有siRNA之纳米制剂的聚焦声处理试图控制siRNA的温度敏感性。因此，本文中描述的一些方面可使得能够生产具有治疗或其他功能性效力的包含siRNA或其他多核苷酸材料的纳米制剂，这对于其他处理来说是根本不可能的。

混合物中至少一种组合物可包含治疗剂，混合物中一种或更多种其他组合物可包含非治疗剂。在一些实施方案中，混合物中的组合物可包含可用于包装混合物中其他组合物(例如，治疗剂)的载体化合物。在一些情况下，混合物可包含表面活性剂，其可起到降低混合物中液体表面张力(例如在两种液体间的界面张力或在液体和固体间的张力)的作用。表面活性剂可包括一种或更多种具有疏水和亲水两种基团的两亲性分子。合适的表面活性剂可以是阴离子性的，例如，具有以下至少一个：硫酸盐(例如，月桂基硫酸铵、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、月桂醇聚醚硫酸钠(sodium laureth sulfate)、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠(sodium myrethsulfate))、磺酸盐(sulfonte)(例如，磺基琥珀酸二辛酯钠、全氟辛烷磺酸盐、全氟丁烷磺酸盐、烷基苯磺酸盐)、磷酸盐(例如，烷基芳基醚磷酸盐、烷基醚磷酸盐)或羧酸盐基团(烷基羧酸盐、硬脂酸钠、月桂酰肌氨酸钠、全氟壬酸盐、全氟辛酸盐)。在一些实施方案中，表面活性剂可以是阳离子性的、两性离子性的或非离子性的。

在一些实施方案中，本公开内容的纳米制剂可制备为乳剂(例如，纳米乳剂)，其可包含分散介质，例如水性介质或油基介质。在一个实施方案中，油基介质选自但不限于：来自植物和海洋来源的饱和及不饱和油、硅油、矿物油和植物来源的油。表面活性剂(如果包含的话)可以是任何离子(例如，阴离子、阳离子)性、非离子性或两性离子性材料。

在一些实施方案中，将混合物暴露于聚焦区可包括在等温环境中处理混合物。因为向混合物施用的聚焦声能不具有显著程度的随机散射能(即，以热形式)，所以样品材料的温度可通常保持在合适程度的变化之内。例如，混合物的温度可保持在起始温度的约5℃内、约2℃内或约1℃内的温度。

根据本文中所描述方法制备的纳米制剂可具有任何合适的颗粒大小分布。在一些实施方案中，虽然不是必需的，但是所描述的涉及使用聚焦声能以制备纳米制剂的系统和方法导致了单峰的颗粒大小分布。例如，颗粒大小分布可与高斯分布(Gaussian distribution)相似。但是，在另一些情况下，合适的纳米制剂的颗粒大小分布是多峰的。在一些实施方案中，经声处理的纳米制剂的颗粒大小分布的PDI小于0.5，小于0.3，小于0.1，小于0.08或小于0.06。例如，经合适声处理的纳米制剂的颗粒大小分布的PDI可在约0.03至约0.1之间、约0.05至约0.09之间或约0.06至约0.08之间。在一些实施方案中，经声处理的纳米制剂的颗粒大小分布的相对标准偏差可以是所述纳米制剂的平均颗粒大小的小于1％，小于0.5％或在其0.1％至0.8％之间。

如本文中讨论的，颗粒大小分布可以以特定阈值大小之上或之下的颗粒数目的形式来表示。多个颗粒的d90颗粒大小指90％的颗粒具有比所给定的d90大小更大的大小。例如，具有10微米d90颗粒大小的多个颗粒被定义为90％的颗粒具有比10微米更大的大小。因此，同样的例子，10％的颗粒具有小于10微米的大小。多个颗粒的d50颗粒大小指50％的颗粒具有比所给定的d50大小更大的大小，即中值。多个颗粒的d10颗粒大小指10％的颗粒具有比所给定的d10大小更大的大小。通常，本文中讨论的d90、d50和d10颗粒大小的测量针对基本上单峰的颗粒大小分布。

使用本公开内容的聚焦声能制备的纳米制剂的保质期可比使用常规技术制备的制剂的保质期更长。在一些实例中，当在周围环境中贮存时，混悬剂、乳剂或某些载体制剂(例如，包封生物活性剂的脂质体或微团)的颗粒可具有聚集成更大颗粒的趋势，表现出相对短的保质期的颗粒大小分布。例如，在脂质体或微团颗粒的情况下，邻近颗粒的磷脂分子可组合在一起，导致混合物中平均颗粒大小的整体提高。或者，在常规混合物中的颗粒可具有随时间降解(即，失去功能)的趋势。但是，与使用常规方法制备的制剂相比，本文中描述的纳米制剂可表现出相对长的保质期，而无样品降解(即保持功能)。在一些实施方案中，根据本文中描述的系统和方法制备的纳米制剂的颗粒大小分布可通常是稳定的。即，对于通过聚焦声合适地形成的纳米制剂的小颗粒存在尽可能小的随时间合并成更大颗粒的趋势。在一些实施方案中，在允许优选的纳米制剂静置12小时、24小时、2天、5天、1周、1个月、1年或更长后，所述纳米制剂实施方案的平均颗粒大小和/或多分散指数波动不超过2％、5％或小于10％。在一些实施方案中，在纳米制剂中形成的颗粒的期望大小分布(例如，100nm、1微米、10微米、50微米等，具有低PDI，等)可保持更长的时间，例如，1天至24个月、2周至12个月或2个月至5个月。

如前所述，可在一些条件下向包含多种组合物的混合物施用聚焦声能，这导致形成多个具有约10nm至约50微米平均大小的颗粒。在一些实施方案中，通过将所述混合物合适地暴露于聚焦声场一段时间而产生颗粒，其具有以下平均大小：约20nm至约100nm、约100nm至约10微米或约10微米至约50微米。在一些情况下，在合适地暴露于聚焦声能后，混合物中颗粒的平均大小可小于50微米、小于40微米、小于30微米、小于20微米、小于10微米、小于1微米、小于500nm、小于100nm、小于50nm、小于20nm或小于10nm。

根据本文中描述的方法，当暴露于聚焦声能时，混合物可发生颗粒大小的总体降低。在一些实施方案中，在合适的条件下声处理后，混合物中颗粒的平均大小可以降低至小于平均起始颗粒大小的50％、20％、10％、1％、0.05％的平均颗粒大小。例如，在将混合物暴露于声能的聚焦区暴露合适的一段时间后，混合物中所有颗粒的平均大小为暴露于聚焦区之前平均起始颗粒大小的0.01％至50％、0.05％至5％、0.1％至3％、0.5％至1％、1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％或40％至50％。在一个实施方案中，在使所述混合物经受小于60分钟的声处理后，混合物中多个颗粒的平均大小可以从至少200微米降低至小于1微米。

在一些实施方案中，在暴露于聚焦区之前，混合物中平均起始颗粒大小可以是约10微米至约500微米、约50微米至约300微米或约100微米至约200微米。在一些情况下，在暴露于聚焦区之前，混合物中平均起始颗粒大小可大于10微米、大于50微米、大于100微米、大于200微米、大于300微米、大于500微米或大于1000微米。

在一些实施方案中，经受聚焦声处理(这产生具有优选的颗粒大小范围的纳米制剂)的混合物不发生颗粒大小的总体降低。例如，聚焦声能可被用于处理具有多种组合物的混合物，其中混合物中的颗粒不是被处理而发生大小的降低，而是被声处理以形成特定类型的纳米制剂，例如脂质体/微团、纳米混悬剂和/或纳米乳剂。在一些实施方案中，通过将合适组合物的混合物经受聚焦声能从而不发生平均颗粒大小降低而制备的纳米制剂可包封治疗剂。

如上讨论，聚焦声可被用于提高效率并给纳米制剂的制备带来很大程度的方便。在一些实施方案中，用以产生合适纳米制剂的、混合物暴露于聚焦声场的时间较短。例如，可将混合物暴露于聚焦声场小于2天、小于1天、小于12小时、小于10小时、小于5小时、小于1小时、小于30分钟、小于10分钟或小于5分钟的时间以形成合适的纳米制剂。相反地，除使其他现有方法不可取的其他因素(例如，污染的可能性、样品的加热、低程度的可重复性，等)外，制备合适纳米制剂的现有方法可包括需要大量时间的多个步骤。

聚焦声系统可在用于制备具有优选特性的纳米制剂的任何合适功率下运作。在一些实施方案中，聚焦声场在以下功率下运作：50瓦特至250瓦特、100瓦特至200瓦特、120瓦特至170瓦特或约150瓦特。

在一些实施方案中，从起始混合物制备合适的纳米制剂所需要的时间、功率和/或精力的量很大程度上并不取决于混合物的体积。换句话说，对于扩大规模至具有更高体积(例如，250mL)的类似混合物，不必大幅延长小体积混合物(例如，5mL)所需的暴露于聚焦声能的时间。例如，合适的纳米制剂可由合适地暴露于聚焦声场30分钟的各自具有5mL和250mL体积的混合物产生。在一些实施方案中，合适的纳米制剂可在混合物暴露于合适的聚焦声场后产生，混合物包含的体积为约1mL至约500mL、约5mL至约250mL或约10mL至约100mL。

在一些情况下，与具有远远更小体积(少于10mL)的混合物相比，将具有显著大体积(例如，多于5L)的混合物暴露于聚焦声能更长的时间以产生相似的纳米制剂结果，这可以是合适的。例如使具有500mL体积的混合物经受聚焦声场60分钟，可产生纳米制剂，其具有与具有250ml体积的混合物经受聚焦声场30分钟的相似实例中的相似的特征。因此，在一些实施方案中，为获得特定的纳米制剂结果(例如，根据本文中描述的纳米制剂结果的平均颗粒大小、多分散指数、颗粒大小降低、颗粒大小分布，等)，组合物的混合物可暴露于合适的聚焦声场，例如，每10mL混合物30分钟、每50mL的混合物30分钟、每100mL的混合物30分钟、每250mL的混合物30分钟、每500mL的混合物30分钟或每1000mL的混合物30分钟。相似地，在一些实施方案中，合适的纳米制剂结果可出现在组合物的混合物暴露于适当的聚焦声场之后，例如，每500微升的混合物15分钟、每1mL的混合物15分钟、每2mL的混合物15分钟、每10mL的混合物15分钟、每50mL的混合物15分钟或每100mL的混合物15分钟。

与体积方面的相似，对于一些实施方案，从起始混合物制备合适的纳米制剂所需要的时间、功率和/或精力的量可能并不很大程度上低取决于混合物的浓度。例如，具有相似颗粒大小分布的纳米制剂可通过使具有1mg/mL和100mg/mL各自浓度的组合物的混合物经受合适的聚焦声场30分钟而得到。在一些实施方案中，具有优选特征的纳米制剂可在合适的聚焦声场暴露于包含组合物的混合物之后出现，所述混合物具有约1mg/mL至约500mg/mL、约1mg/mL至约100mg/mL、约15mL至约100mg/mL或约40mg/mL至约70mg/mL的浓度。例如，与在聚焦声处理之前的起始颗粒大小相比，在大幅变化的浓度(例如，1mg/mL至100mg/mL)之间颗粒大小(例如，d90、d50、d10、平均大小等)的变化百分比差异可小于15％、小于10％、小于5％、小于3％或小于1％。

在一些情况下，与具有远远更小浓度的特定组合物的混合物(小于1mg/mL)相比，将具有显著大浓度的组合物的混合物(例如，大于5g/mL)暴露于聚焦声能更长的时间以产生相似的纳米制剂，这可以是有益的。例如使具有200mg/mL浓度的混合物经受聚焦声场60分钟，可以产生纳米制剂，其具有与具有100mg/ml浓度的混合物经受聚焦声场30分钟的相似情况中的相似的特征。在一些实施方案中，为实现特定的纳米制剂结果(例如，平均颗粒大小、多分散指数，等)，可将组合物的混合物暴露于合适的聚焦声场，例如，每100mg/mL混合物30分钟、每200mg/mL混合物30分钟或每300mg/mL混合物30分钟。

尽管可以领会上述相关参数(例如处理时间、混合物体积和组合物浓度)的任何组合可合适地用于生产具有优选的颗粒大小分布的纳米制剂，但下文中还是讨论了多个实例的颗粒大小分布。在一个实施方案中，在混合物暴露于聚焦声能之前，混合物中所有颗粒的至少90％可具有大于40微米的大小。但是，在混合物暴露于聚焦声能小于约5分钟或小于10分钟之后，混合物中所有颗粒的至少90％可具有小于40微米的所产生的大小。在另一个实施方案中，在混合物暴露于聚焦声能之前，混合物中所有颗粒的至少90％可具有大于100微米的大小。在混合物暴露于聚焦声能小于约10分钟后，混合物中所有颗粒的至少90％可具有小于20微米的所产生的大小。在另一个实施方案中，在混合物暴露于聚焦声能之前，混合物中所有颗粒的至少90％可具有大于150微米的大小。可是，在混合物暴露于聚焦声能小于约5分钟之后，混合物中所有颗粒的至少90％可具有小于15微米的大小。在另一个实施方案中，在混合物暴露于聚焦声能小于约10分钟之后，混合物中所有颗粒的至少90％可具有小于暴露于聚焦声能之前混合物中所有颗粒起始d90大小的20％。在另一个实施方案中，在混合物暴露于聚焦声能小于约5分钟之后，混合物中所有颗粒的至少90％可具有小于在混合物暴露于聚焦声能之前混合物中所有颗粒起始d90大小的10％。

如上所述，混合物处理体积的提高可涉及声处理时间的延长。在一个实施方案中，对于具有超过200mL(例如，约250mL)处理体积的混合物，混合物暴露于合适的聚焦声场小于约60分钟可导致混合物中所有颗粒的至少90％具有小于暴露于在聚焦声场暴露之前混合物中所有颗粒起始d90大小15％的大小。在另一个实施方案中，具有超过200mL处理体积的混合物暴露于聚焦声场小于约30分钟可导致混合物中所有颗粒的至少50％具有小于在向聚焦声场暴露之前混合物中所有颗粒起始d50大小20％的大小。在另一个实施方案中，将具有超过200mL处理体积的混合物暴露于聚焦声场小于约15分钟，可导致混合物中所有颗粒的至少10％具有小于在混合物暴露于聚焦声场之前混合物中所有颗粒起始d10大小15％的大小。在另一个实施方案中，具有超过200mL处理体积的混合物暴露于聚焦声场小于约60分钟导致混合物中所有颗粒的平均大小小于在混合物暴露于聚焦声场之前混合物中所有颗粒平均起始大小的0.5％。在另一个实施方案中，将具有超过200mL处理体积的混合物暴露于聚焦声场小于约10小时导致混合物中所有颗粒的平均大小小于在混合物暴露于聚焦声场之前混合物中所有颗粒平均起始大小的约0.2％。

在本文中描述的多个实施方案、方面中考虑了包含具有约10至约400纳米直径颗粒群的纳米制剂，其中所述纳米制剂不被具有更大或更小直径(即，样品是单分散的)的颗粒污染。在一个实施方案中，颗粒包封化合物。所述化合物可以是药物、营养品和药用化妆品。

在另一个实施方案中，本公开内容考虑用于形成纳米制剂的方法，其包括形成包含活性成分、液体分散介质和液体载体的混合物，其中化合物在所述介质中的大于3mg/mL。声能波列(wave train)朝向在容器中所容纳的混合物，以使混合物暴露于具有约100千赫至约100兆赫频率的声能场，且其聚集在主要位于容器中、宽度小于约2厘米的聚焦区。响应于暴露于聚焦区的声能，在混合物中形成了纳米制剂，其中纳米制剂包含混悬在液体载体中的液体分散介质的颗粒群。每个颗粒至少含有一些活性成分，并且直径为约10纳米至约400纳米。

在一个实施方案中，分散介质选自水性介质和油基介质。在一个实施方案中，油基介质选自但不限于：来自植物和海洋来源的饱和及不饱和油、硅油、矿物油和植物来源的油。表面活性剂(如果包含的话)可以是任何离子性、非离子性或两性离子性材料。

在本发明的一个实施方案中考虑用于加强纳米晶体之合成的方法，所述纳米晶体由例如基于聚合物、基于金属或药物纳米颗粒形成(例如，金、铁氧化物和药物纳米晶体)的过程产生。

在另一个实施方案中，本公开内容的一些方面还可用于制备碳酸钙纳米颗粒，其可用于接合剂(cement)的制造过程，所述结合剂用作牙齿修复或其他牙科技术中的填料。

在另一个实施方案中，本公开内容考虑均匀的聚焦超声声纳米制剂，其具有抗菌性。在一个实施方案中，所述抗菌性包括声剪切力诱导的细胞裂解。在一个实施方案中，所述纳米制剂是无菌的。

根据本文中描述的一些方面，通过聚焦声制备的纳米制剂可包括反义化合物，其可被用作研究试剂、诊断助剂(diagnostic aid)、治疗剂和/或用于其他目的。能够特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸可用于阐明特定基因的功能，例如，siRNA可用作作为筛选过程之一部分的转录的序列选择性抑制剂，所述筛选过程包括本领域技术人员所知的称为SELEX的技术。所述SELEX过程可允许鉴别具有独特序列的核酸分子，其中每个都具有与期望靶标化合物或分子特异性结合的性质。例如，反义化合物还可用于辨别生物学通路的多种成员的功能。根据本文中描述的一些方面产生的纳米制剂还可包括其他低聚反义化合物，包括但不限于寡核苷酸模拟物。所述反义化合物可以是由聚焦声生产之纳米制剂中的活性组分，并具有约8个至约30个核苷酸碱基(即，约8个至约30个连接的碱基)，但是本发明中也可使用更长和更短的序列。例如，此类反义活性组分可以是反义寡核苷酸，例如包含约12个至约25个核苷酸的那些。

在一个实施方案中，本公开内容考虑生产纳米乳剂，其显著提高药物或其他活性化合物的效力。在一个举例说明性的方法中：a)鉴定对以治疗有效量施用之化合物不反应的对象；和b)在这样的条件下向所述对象递送纳米乳剂，从而使化合物的生物利用度被提高，并且其中所述化合物是治疗上有效的。在一个实施方案中，所述提高的生物利用度包括选自降低的Tmax、升高的Cmax和升高的AUC的药物代谢动力学参数。在一个实施方案中，所述递送包括选自以下的方法：递送纳米乳剂的经口、经皮、静脉内、腹膜内、肌内和皮下方法。

纳米乳剂可通过不同类型的方法形成，例如高能乳化法和低能相转变温度法。在高能乳剂形成法中，使用微流化设备使纳米乳剂组分(例如，油、水、表面活性剂和任选的药物、营养品或药用化妆品试剂)的混合物经受在高压下(例如，至少24,000psi)的连续紊流(turbulent flow)以形成纳米乳剂(例如，如Cook等在1984年2月21日提交的美国专利4,533,254和5月26日提交的美国专利4,908,154中所描述的那样)。

或者，纳米乳剂可通过低能“自组装纳米乳剂”(self-assemblynanoemulsion，SANE)方法形成，而没有通过将能够温度依赖性相转变(例如，非离子性聚乙氧基化表面活性剂)的表面活性剂与其他纳米乳剂组分(例如，油、水和任选的药物、营养品或药用化妆品试剂)相组合的微流化装置(microfluidizer)处理。该技术在公布的PCT申请号WO/2009/121069中被引用。所述纳米乳剂组分被混合并加热至超过表面活性剂的相变温度(phase inversion temperature，PIT)(即，表面活性剂对不同相的亲合力改变的温度)。例如，水包油型(O/W)粗乳剂(macroemulsion)超过PIT时可发生可逆的温度依赖的过渡相转变，以形成油包水型(W/O)乳剂。随后的低于PIT(例如通过热冷却或添加水)的W/O乳剂的迅速冷却可导致形成悬浮于水中之油滴的动力学上稳定的O/W纳米乳剂组合物(任选地含有药物、营养品或药用化妆品试剂)。可进行热冷却以形成纳米乳剂，例如，通过将包含W/O乳剂的容器放置于冰浴中。除非另有指明，否则“迅速冷却”指以适于形成无微流化之纳米乳剂的速率进行冷却。

但是，这些处理的每一种都具有显著的技术和商业缺点。在微流化的情况下，混合物在处理期间经受极高的压力(例如，40,000psi)，这可对活性成分具有不利的作用。此外，作用于流体的这些高压强和高剪切应力可生热，这使活性组分进一步降解。微流化设备需要敏感和复杂的操作以及操作者相当程度的技术。此外，处理后微流化装置在系统中留下很大一部分不可回收的材料，因此损失了宝贵的产率。该产率损失对于50mL以下体积的处理来说尤其显著，在处理期间经常损失材料的20％至40％。此外，微流化设备在样品之间需要清洗，因此具有样品间交叉污染的可能性。

在SANE技术的情况下，必须使用特定的表面活性剂和比例。虽然可以达到很小的微滴大小和紧密的大小分布，但是用SANE技术产生的纳米乳剂表现出缩短的保质期和降低的随时间的稳定性，尤其是当经受阳光和温度时。简单地在室温下贮存SANE样品在一些情况下经数周可引起降解。此外，使用SANE技术必须使用非常特定的表面活性剂、比例和组合以获得稳定的纳米乳剂。对于制剂的药物代谢动力学性能来说，这些表面活性剂可以是有害于的。此外，表面活性剂在其他方面可以是有害的，例如毒性或缩短保质期。与其他技术相比，已知SANE技术用于包封较小量的包封物(encapsulant)(例如，依赖于油与表面活性剂的比例(1：5)，SANE处理可容纳1～2mg/mL，但是微流化系统可超过4mg/mL)。

虽然对于形成纳米乳剂的一些现有技术可具有缺点，使用根据本发明一些方面的聚焦声的可以是对微流化、SANE和基于聚合物之技术的补充。在SANE处理的情况下，可在处理的预热和相转变温度步骤期间应用聚焦声处理，可能产生更令人满意的大小分布、更低或更宽范围的表面活性剂要求。聚焦声还可与微流化相组合，在流化装置(fluidizer)通道的上游或者下游，或者还在通道本身中，因此提高能量水平并产生更好的大小分布、或提高生产能力或降低压力要求。

实施例

以下实施例旨在举例说明本发明的某些实施方案，但不被解释为限制并且不例示本发明的全部范围。

实施例1

对于布洛芬(来自Spectrum Chemicals)、桂利嗪(来自SpectrumChemicals)、吲哚美辛(来自Spectrum Chemicals)和灰黄霉素(来自MP Bio)，制备在水(通过Barnstead水纯化系统去离子化并纯化)、甲基纤维素(来自Sigma Aldrich)和月桂基硫酸钠(来自Fisher Scientific)中的混悬剂混合物。这些混悬剂混合物的起始颗粒大小经受聚焦声处理而降低，所述聚焦声处理在150瓦特功率下使用Covaris SF220高性能制剂处理系统。颗粒大小分布用Malvern Zetasizer Nano ZS-90在纳米颗粒大小范围测量，并且用Malvern Mastersizer2000在微米颗粒大小范围测量。

颗粒大小的降低：15mg/mL的布洛芬、桂利嗪、吲哚美辛和灰黄霉素

对于2mL、12mL和18mL批次的15mg/mL的布洛芬、桂利嗪、吲哚美辛和灰黄霉素，混悬剂混合物包含水、0.5％甲基纤维素和0.1％的月桂基硫酸钠。使所述2mL、12mL和18mL批次分别经受5分钟、5分钟和10分钟的聚焦声处理。图6示出聚焦声处理前后的被处理的15mg/mL浓度布洛芬在50×放大下的显微照片(具有50微米比例尺)。与被聚焦声处理颗粒之后图像402所示的相应颗粒相比，在暴露于聚焦声之前的图像400描述的颗粒远远更大(例如，15～20×)。表1中提供了四种化合物中每一种的颗粒大小的结果(除非另外指明，颗粒大小按d90记录)。

表1：布洛芬、桂利嗪、吲哚美辛和灰黄霉素的颗粒大小结果(d90)。

颗短大小的降低：1mg/mL、15mg/mL和100mg/mL的布洛芬

然后改变2mL、12mL和18mL固定体积的各个混悬剂中布洛芬的浓度。表2列出每种浓度下布洛芬的d90颗粒大小。如示，即使混悬剂浓度大幅改变，所述d90颗粒大小结果也不显著改变。例如，聚焦声处理10分钟后，在浓度(即，1mg/mL、15mg/mL和100mg/mL)之间d90颗粒大小的最大变化(即，39.53-34.04＝5.49)与起始d90颗粒大小(即，203.67)相比的百分差异小于3％。因此，于此证明为制备具有浓度大幅变化的纳米制剂的聚焦声学处理可产生基本上相似的结果。

表2：1mg/mL、15mg/mL和100mg/mL布洛芬的颗粒大小结果(d90)。

颗粒大小的降低：纳米-混悬剂

对于2mL批次的5mg/mL的布洛芬、桂利嗪、吲哚美辛和灰黄霉素，混悬剂混合物包括水、0.025％的甲基纤维素和0.1％的月桂基硫酸钠。每个批次分别经受15分钟和30分钟的聚焦声处理。表3列出四种化合物每种的平均颗粒大小结果。在15分钟内，产生了对于每种混合物具有100nm至280nm的平均颗粒大小的纳米混悬剂。在30分钟内，获得20nm至97nm的平均颗粒大小范围。

表3：纳米-混悬剂的平均颗粒大小结果。

参数布洛芬桂利嗪吲哚美辛灰黄霉素初始203.67微米149.17微米239.88微米44.45微米15分钟110nm280nm127.4nm100nm30分钟97nm56.85nm20nm90nm

颗粒大小降低：规模扩大至250mL的布洛芬

使用规模扩大系统并且不改变颗粒大小降低处理的机械属性，将布洛芬混悬剂混合物提高至250mL。流速设为30mL/分钟。系统的同质性和稳定性通过从250mL混悬剂的不同深度(例如，顶部、中部和底部深度)取样来显示。使用稳定性指示方法作为指导通过HPLC来分析混悬剂的等分量。在首个15分钟测量时间点，混悬剂显示出同质性，其中混悬剂的颗粒大小分布具有0.40％的相对标准偏差。经过60分钟的聚焦声处理，混悬剂的颗粒大小分布被测量具有0.38％的相对标准偏差。此外，布洛芬显示出化学稳定性，60分钟的处理中不出现杂质增长。表4示出所述规模扩大处理的颗粒大小结果。图7举例说明了对于d90颗粒大小410、d50颗粒大小412和d10颗粒大小414随时间的此类大小降低的结果。

表4：对于规模扩大至250mL的布洛芬颗粒大小结果(d90、d50、d10)。

颗粒大小降低：规模扩大至250mL的桂利嗪

以与规模扩大之布洛芬混悬剂类似的方式将桂利嗪混悬剂混合物提高至250mL。所述混悬剂混合物包含水、0.025％甲基纤维素和0.1％月桂基硫酸钠，远低于临界胶束浓度范围。图8举例说明了根据对桂利嗪混悬剂随时间之曲线420的颗粒大小降低的图。起始平均颗粒大小是约200微米。对250mL混悬剂进行1小时的处理之后，达到了1微米的平均颗粒大小。通过约9小时的时间，平均颗粒大小稳定在约200nm。

实施例2

图9描述了根据随时间之曲线430、432、434的颗粒大小降低的图。曲线430涉及材料D15，曲线432涉及材料Z27，且曲线434涉及材料K19。

实施例3

使在无表面活性剂的水中规模扩大的250mL槲皮素样品经受聚焦声场。图10举例说明了沿着曲线440的颗粒大小降低的图，表现出在80分钟内平均颗粒大小从大于200微米降低至小于10微米。在聚焦声处理期间，样品的温度控制在24℃。

实施例4

使水中吲哚美辛的混合物经受聚焦声处理。根据图11的分布曲线450，暴露于聚焦声能之前的平均颗粒大小为100至200微米。图12描述了在混合物暴露于聚焦声能之后的分布曲线452，示出平均颗粒大小为约5微米。

实施例5

将Solutol HS15(非离子性增溶剂)与油和水相混合，以产生空白纳米乳剂(nanoemulsion blank)。对250mL的体积进行处理以显示可扩展性。

图13举例说明纳米乳剂的三种不同分布460a、462a、464a，表现出显著的多分散性。然后将混合物加热至50℃并经受5分钟160瓦特的聚焦声处理。

图14示出由聚焦声处理所产生的颗粒大小分布460b、462b、464b。观察到每种纳米乳剂是单分散的，具有20.27nm的平均颗粒大小。

图15描述了经受24小时静置之后纳米乳剂的颗粒大小分布460c、462c、464c。观察到颗粒保持稳定，具有19.62nm的平均颗粒大小。

实施例6

基于聚焦声的脂质体形成已被证明在一定的大小以下不降解生物材料。将2mg Phospholipon-90G(Lipoid LLC)与130微升去离子水组合，将10～30mgPhospholipon-90G以10mg/mL与2mL去离子水组合。分别以18瓦特(150PIP，10％工作周期，200个周期/猝发(burst))和150瓦特(300PIP，50％工作周期，1000个周期/猝发)向混合物施用聚焦声场30秒，同时使混合物保持在4℃的恒定温度下。

图16描述了纳米制剂的颗粒大小分布470。形成了具有小于100nm平均颗粒大小的包封DNA的单分散脂质体群。为评价稳定性，使所述纳米制剂在实验室条件下静置1周，然后再次测试颗粒大小。

图17示出了1周时间之后纳米制剂的颗粒大小分布472。平均颗粒大小仍然小于100nm。

测试以上处理条件以确定对DNA大小的影响。100bp的DNA链可用作起始材料，并经受与脂质体形成所要求的那些相一致的聚焦声处理水

平。在聚焦声的用量下，所述100bp DNA材料不示出降解的迹象，并保持全部完整。该实施例示出，使用聚焦声处理条件，具有约100bp或更长(或更短)长度的多核苷酸链未被破坏，并被包封。该实施例还证明了能够产生包含siRNA或其他多核苷酸颗粒(直径或其他大小为约10纳米至约400纳米)的纳米制剂，而不使多核苷酸显著地降解。

实施例7

将合适的油和表面活性剂与生物活性成分(活性成分)和DI水一起相混合。然后使混合物经受由Covaris，Inc.of Woburn，MA所售声处理设备产生的高强度(10％)聚焦声能，工作周期为20～50次，且周期/猝发为约200次。发现该处理产生具有约10～400nm大小的油颗粒的纳米乳剂，其中每个油颗粒包含生物活性成分，并悬浮在DI水载体中。由AFA的某些条件产生的一些制剂以及大豆油与Tween-80的组合表示于表7～12中，以示出AFA技术对乳剂的影响。非常低浓度的Tween-80和油(例如表7中所示)在生产具有与AFA能量暴露时间无关之期望性质的纳米乳剂中是不成功的。表8示出在10分钟的暴露条件下AFA能量的作用。表9示出在暴露于AFA能量5和10分钟的条件下对起始混合物之制剂的作用。在表10中，示出暴露于AFA能量5和10分钟对制剂的巨大作用。表11示出在15、30、40和60分钟的运行时间下进一步分析和开发纳米乳剂的希望，这是因为混合物制剂和声能条件产生的包括相当窄颗粒大小范围(例如，包括几乎87％的颗粒)的纳米乳剂具有260nm的大小。在15分钟暴露时，产生了组合的最大作用。

表6.

表7.0.25克大豆油+0.25克Tween80+19.5ml DI水。

0分钟1分钟5分钟10分钟

大小p1超出范围超出范围超出范围超出范围％强度超出范围超出范围超出范围超出范围大小p2超出范围超出范围超出范围超出范围％强度超出范围超出范围超出范围超出范围大小p3超出范围超出范围超出范围超出范围％强度超出范围超出范围超出范围超出范围PdI超出范围超出范围超出范围超出范围质量报告差差差差

表8.0.5克大豆油+0.5克Tween80+19ml DI水。

0分钟1分钟5分钟10分钟大小p1超出范围超出范围超出范围821.5％强度超出范围超出范围超出范围91大小p2超出范围超出范围超出范围4848％强度超出范围超出范围超出范围7.7大小p3超出范围超出范围超出范围120％强度超出范围超出范围超出范围1.4PdI超出范围超出范围超出范围0.425质量报告差差差好

表9.1克大豆油+1克Tween80+18ml DI水。

表10.1克大豆油+2克Tween80+17ml DI水。

0分钟1分钟5分钟10分钟大小p1超出范围超出范围270.7260.1％强度超出范围超出范围59.8％86.5％大小p2超出范围超出范围20803657％强度超出范围超出范围40.2％8.3％大小p3超出范围超出范围01432

％强度超出范围超出范围05.2％PdI超出范围超出范围0.4880.367质量报告差差好好

表11.1克大豆油+2克Tween80+17ml DI水。

表12.1克大豆油+2克Tween80+17ml DI水，10％强度。

实施例8

用起始包含1份DMA、99份PVP/SDS稳定剂和非洛地平的2mL样品形成晶体纳米颗粒。用Covaris S220机处理样品，使用18℃的水浴温度、50％工作周期、75瓦特峰入射功率(peak incident power，PIP)、1000周期/猝发和20分钟的总处理时间。该处理导致晶体纳米颗粒的形成(生长)，其中100％的颗粒具有约153.2nm的平均大小，最小大小为约137.5nm并且最大大小为约168.7nm。因此，在相对短的时间阶段内产生了非常窄或紧密的大小范围的颗粒。

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