胞壁酰二肽-抗CD20免疫偶联物制备方法及应用

摘要

本研究以疫苗接种所产生的特异性细胞免疫和单克隆抗体的免疫导向作用为理论依据，将卡介苗(BCG)的有效成分胞壁酰二肽(MDP)与抗淋巴瘤细胞膜抗原CD20的单克隆抗体Rituximab结合制备成胞壁酰二肽-抗CD20免疫偶联物，即MDP-Rituximab，了解经BCG免疫后的免疫活性细胞，在MDP-Rituximab的介导下的体内外抗肿瘤效果。该偶联物保持了MDP的免疫原性，刺激机体产生特异性的T细胞免疫应答，借助Rituximab抗体与淋巴瘤细胞膜CD20分子结合的免疫导向作用，将MDP带到残留的淋巴瘤细胞周围，通过MDP诱导T细胞介导的免疫应答达到清除残存肿瘤的最终目的，这样该方法不仅克服了单用Rituximab药物抗性，而且减少了抗体用量，预示其在恶性淋巴瘤中的应用前景。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种具有靶向结合抗原且具有通过刺激免疫活性细胞发挥抗肿瘤作用的胞壁酰二肽-抗CD20免疫偶联物(MDP-Rituximab)，本发明公开了其制备方法，及其在淋巴瘤治疗的作用。 

背景技术：

据世界卫生组织统计，淋巴瘤发病率每年增长7.5％，是目前发病率增长最快的恶心肿瘤之一。我国淋巴瘤的发病率大约为2/10万人口，每年新发病例2.5万人，死亡2万人，儿童占全国人口的30％，因此，每年大约有近万新例新发患儿。其死亡率占儿童恶性肿瘤的首位。提高儿童淋巴瘤的诊治水平是广大血液工作者急需解决的问题。90％以上为B细胞淋巴瘤中均有CD20表达，就目前国内外的治疗状况，儿童恶性淋巴瘤(NHL)的治疗首选仍以联合化疗为主，其治疗效果主要取决于治疗反应。尽管儿童恶性淋巴瘤是可治愈性疾病，但是仍有大约50％以上的NHL患儿发生耐药，导致治疗无效或复发。因此，完全缓解后抗复发治疗或停药后清除耐药肿瘤细胞是治疗NHL急需解决的问题。采用单克隆抗体(MAb)的治疗方法具有有效治疗肿瘤的潜力，且已被用于某些肿瘤的治疗。Maloney等首次将抗CD20抗体(Rituximab，美罗华)单独应用于I期临床试验治疗复发或低度恶性的B细胞淋巴瘤，1997年美国食品药物管理局(FDA)和1998年在欧洲批准美罗华用于CD20阳性的复发性或难治性低度恶性或滤泡性B细胞NHL。(Maloney DG，Liles TM，Czerwinski DK，Waldichuk C，Rosenberg J，Grillo-Lopez A，Levy R.Phase I clinical trial using escalating single-dose infusion of chimeric anti-CD20 monoclonal antibody(IDEC-C2B8)in patients with recurrent B-cell lymphoma.Blood 1994；1584(8)：2457-66.Marcus R，Hagenbeek A.The therapeutic use of Rituximab in non-Hodgkin’s lymphoma.Eur J Haematol Suppl.2007；(67)：5-14)。 

B细胞NHL表达的膜抗原有CD19、CD20、CD22、CD33、CD37、CD52等，其中CD20抗原的表达率达90％以上。CD20是非糖基化的III型跨膜蛋白，分子量35KD具有高度的保守性，人与鼠的CD20同源性可达73％，其功能类似于钙离子通道，参与调解B淋巴细胞的生长与分化，是常用于诊断B细胞淋巴瘤的一种指标。 

抗体导向治疗具有高效、低毒和靶向性等特点，在恶性血液疾病的治疗中越来越受到关注，Rituximab(美罗华)是第一个被FDA批准用于治疗肿瘤的单克隆抗体，该抗体为人鼠嵌合型IgG抗体。能特异性识别表达CD20的恶性B淋巴细胞和正常成熟B淋巴细胞，对其它正常细胞并无杀伤作用，因此由最早用于治疗复发及难治性B细胞淋巴瘤，逐渐作为一线药物用于治疗分化差的淋巴瘤和淋巴细胞白血病。其主要通过诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、诱导补体介导的溶细胞作用(CDC)、诱导细胞凋亡等机制发挥抗肿瘤作用，目前Rituximab已治疗了30多万例病人，单药治疗总反应率约50％，联合化疗有效率高达80％以上。尽管Rituximab治疗B细胞淋巴瘤有明显的疗效，但经过长期治疗后发现，约半数以上病人产生耐药，耐药出现的原因除了肿瘤细胞自身产生耐药性外，还可能存在肿瘤细胞周围免疫环境改变等因素(Rezvani AR，Maloney DG.Rituximab resistance.Best Pract Res Clin Haematol.2011；24(2)：203-16.)，其中可能涉及：(1)肿瘤本身细胞中CD20抗原分子减少、集体的FcγRIII受体基因效应细胞的多态性(Cartron G，Dacheux L，Salles G，Solal-Celigny P，Bardos P，Colombat P，Watier H.Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene.Blood.2002；99(3)：754-8)；(2)ADCC作用的效应细胞耗竭：Rituximab通过其Fc段招募效应细胞集介导ADCC效应，其中主要起作用的是NK细胞，目前研究显示Rituximab的ADCC作用主要限制因素是NK细胞的耗竭(Bhat R，Watzl C.Serial killing of tumor cells by human natural killer cells-enhancement by therapeutic antibodies.PLoS One.2007；2(3)：e326)；(3)有关补体调节蛋白异常；(4)抗细胞凋亡基因表达增强有关：Rituximab可与CD20交叉偶联促进caspases的激 活而引起B细胞系死亡，但Bcl-2的过表达倾向于阻碍单抗导致的细胞死亡。 

虽然CD20单抗在治疗上还存在这些局限性，且单独应用Rituximab治疗肿瘤的抗体需要量极大，生产价格非常昂贵，半衰期较短决定需反复用药，会增加了患者及其家庭痛苦，但它的高度特异性与低免疫源性决定了其在肿瘤生物靶向治疗中的重要地位，并且随着深入的临床研究，结果表明其在自身免疫疾病的治疗中也发挥着重要作用，因此，目前越来越多的学者致力于探索完善其效能的方法，目前倾向于通过蛋白重组构建结合型抗体(如抗CD20与抗CD22抗体的重组)(Gupta P，Goldenberg DM，Rossi EA，Chang CH.Multiple signaling pathways induced by hexavalent，monospecific，anti-CD20 and hexavalent，bispecific，anti-CD20/CD22 humanized antibodies correlate with enhanced toxicity to B-cell lymphomas and leukemias.Blood.2010；116(17)：3258-67.)及通过将放免制剂与抗体偶联而增强疗效(如 ¹³¹I/⁹⁰Y-Rituximab)(Illidge T，Morschhauser F.Radioimmunotherapy in follicular lymphoma.Best Pract Res Clin Haematol.2011；24(2)：279-93.)。 

抗肿瘤免疫主要以细胞免疫为主。由于肿瘤细胞缺乏特异性抗原或因特异性抗原的免疫源性差，因此肿瘤的非特异性免疫治疗被广泛地应用于临床。同时，淋巴瘤患儿随着化疗时间的延长，机体的免疫功能进一步损伤，难以识别或清除残留的肿瘤细胞。因此对长期完全缓解的患儿提高机体的免疫功能是争取治愈的关键。国内外已有大量研究BRM如卡介苗(BCG)(Ludwig AT，Moore JM，Luo Y，et al.Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand：a novel mechanism for Bacillus Calmette-Guerin(BCG)-induced antitumor activity.Cancer Res，2004，64(10)：3386-3390.)、细胞因子、胸腺肽、转移因子、寡脱氧核酸(Lee KW，Jung J，Lce Y,et al.Immunostimulatory oligodeoxynucleotide isolated from genome wide screening of Mycobacterium bovis chromosomal DNA.Mol Immunol，2006，43(13)：2107-2118)等可改善肿瘤患者机体的免疫状态。Torisu等人对实体瘤患者采用BCG免疫治疗，进行了长达18年的随访观察，发现BCG能明显提高晚期肿瘤患者的免疫功能和生存时间。瘤内注射治疗黑色素瘤，可使50％的瘤体缩小，减少肿瘤转移、延长缓解期，提高生存率。成人粒细胞性白血病经化疗缓解后，加用BCG可维持疗效，可延长生存期。膀胱内注射BCG可降低膀胱癌手术后复发率，延长生存期。1974年Ellouz等发现，结核杆菌细胞壁骨架中的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(胞壁酰二肽，muramyl dipeptide，MDP)是小分子强效免疫佐剂的最小结构。研究结果表明，MDP及其类似物对免疫系统具有广泛的生理功能，它能激活T细胞、B细胞和巨噬细胞，促进白细胞介素-1的产生，增加体液和细胞的免疫功能，是一种强有力的免疫佐剂，对抗体、补体的生成和激活都有促进作用。同时，它还具有抗细菌、真菌、抑制肿瘤等活性(Tanabe T，Chamaillard M，Ogura Y，Zhu L，Qiu S，Masumoto J，Ghosh P，Moran A，Predergast MM，Tromp G，Williams CJ，Inohara N，Nunez G.Regulatory regions and critical residues of NOD2 involved in muramyl dipeptide recognition.EMBO J 2004；23(7)：1587-97.)。 

发明内容：

基于以上研究状况，如对肿瘤细胞的免疫治疗如能像BCG预防结核菌感染一样，使机体产生特异性的T细胞免疫应答，是免疫治疗最可靠的方法。要实现此方法，本研究以疫苗接种所产生的特异性细胞免疫和单克隆抗体的免疫导向作用为理论依据，将BCG的有效成分MDP与抗淋巴瘤细胞的单克隆抗体Rituximab结合制备成MDP-Rituximab偶联物，了解经BCG免疫后的免疫活性细胞，在MDP-Rituximab偶联物的介导下的体内外的抗肿瘤效果。MDP-Rituximab偶联物并不是通过Rituximab发挥ADCC或CDC发挥抗肿瘤作用，而是该偶联物保持了MDP的免疫原性，能刺激机体产生特异性的T细胞免疫应答，借助Rituximab抗体与淋巴瘤细胞膜表面CD20分子结合的免疫导向作用，将MDP带到残留的淋巴瘤细胞周围，通过MDP诱导的T细胞介导的免疫应答达到清除残存肿瘤的最终目的，这样该方法不仅克服了单用Rituximab药物抗性，而且减少了抗体用量，预示其在恶性淋巴瘤中的应用前景。 

附图说明

图1、化合物结构式及制备路线图(n1＝3；n2＝5；n3＝3；n4＝2) 

图2、各组裸鼠肿瘤大体形态学变化 

图3、各组裸鼠病理组织变化，1.肝脏(*400)；2.脾脏(*200)；3.肿瘤组织(*200)；4.MDP-Rituximab组；5.LPS组肿瘤组织；(组织内可见散在核固缩、碎裂及溶解，胞浆内有空泡)；6.MDP-Rituximab+LPS组肿瘤组织(组织内可见大量核固缩、碎裂及溶解，胞浆内有空泡) 

具体实施方式： 

【实施例1】化合物1～5的制备 

化合物1的制备 

以含三个碳原子的连接臂为例。氩气保护下，在10ml烧瓶中，加入Boc保护的连接臂N-Boc-1，3-丙二胺盐酸盐(20mg，0.12mmol，CAS号：127346-48-9，Sigma-Aldrich公司)，用3ml二甲基甲酰胺溶解，加入过量的三乙胺，然后加入N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶硫基)丙酸酯(SPDP，74mg，0.24mmol，CAS号：68181-17-9，Sigma-Aldrich公司)，室温搅拌反应1h，点板检测反应结束，后经过硅胶柱(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1)分离，真空蒸干，得产物化合物1(19.8mg)。ESI-MS m/z 372.1[M+H]⁺. 

化合物2的制备 

氩气保护下，在10ml反应瓶中，加入化合物1(10mg，0.02mmol)加入1.5ml二氯甲烷，冰浴下搅拌10min，缓慢加入1.5ml三氟乙酸，冰浴条件下搅拌反应20min，点板检测反应结束，减压浓缩蒸干，并加入适量纯甲醇，再次蒸干，得到化合物2(8.4mg)。ESI/MS m/z271.1[M+H]⁺

化合物3的制备 

氩气保护下，在10ml反应瓶中，加入胞壁酰二肽(MDP，5mg，0.01mmol，CAS号：53678-77-6，Sigma-Aldrich公司)、化合物2(3mg，0.011mmol)，用2ml二甲基甲酰胺和四氢呋喃溶解，冰浴条件下加入1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(1.66mg，0.012mmol，CAS号：39968-33-7)及N-(3-二甲基氨基丙基)-N’乙基-碳二亚胺(2.34mg，0.012mmol，CAS号：25952-53-8)搅拌15min，恢复至室温，继续反应2～3h，点板检测反应完全，经硅胶柱(二氯甲烷∶甲醇＝3∶1)分离得化合物3，真空蒸干，得化合物3(7.5mg)。ESI-MS m/z 746.4[M+H]⁺. 

化合物4的制备 

氩气保护下，在25ml反应瓶中，加入鼠抗人CD20单克隆抗体(Rituximab，100mg，0.001mmol，Roche/Genetech，美国)，用含有EDTA(2mmol/l)的PBS液(0.1mol/L，PH＝8)溶解调整浓度为8mg/ml，然后加入2-亚氨基四氢噻吩(2-IT，1.38mg，0.01mmol，CAS号：78853-38-0，Sigma-Aldrich公司)，2-IT约对CD20抗体10倍过量，搅拌且室温反应1h，经Sephacryl S-100丙烯葡聚糖凝胶柱分离纯化(水∶甲醇＝1∶1)，得到化合物4(67.1mg)。ESI-MSm/z 144KD[M+H]⁺。采用Ellman’s试剂(10mM DTNB，CAS号：69-78-3，Sigma-Aldrich公司)，参照Sigma公司的相关操作说明，25℃条件下，用Tris缓冲液稀释半胱氨酸标准液配成梯度的稀释液(5.0ml)，其浓度分别为：0.00mM、0.025mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM，于波长412nm处测定吸光度值(A)，分别为：0.152、0.172、0.186、0.224、0.304、0.392、0.42、0.517，绘制半胱氨酸标准曲线。同样条件下测定化合物4(0.1g/ml)的吸光度为0.36，进而了解化合物4中巯基(-SH)数量，分析得化合物4中巯基数量为5。 

化合物5的制备 

氩气条件下，在10ml反应瓶中，加入化合物4(67mg，0.0007mmol)，用2ml PBS(0.1mmol/L，PH＝8)溶液溶解，然后加入化合物3(1.5mg，0.0021mmol)搅拌，4℃下反应18-24h，点板检测反应完全，经Sephacryl S-100丙烯葡聚糖凝胶柱分离纯化(水∶甲醇＝1∶1)，得到化合物5(57.1mg)。采用电喷雾电离质谱(ESI-MS)与紫外线吸光度分析MDP-Rituximab偶联物的分子量及其分子比。根据MDP、Rituximab抗体分别在200nm、280nm有最大特征 吸收，采用PBS稀释成一定比例，分别测定两者于200nm与280nm的吸收，绘制标准曲线，求出吸光系数ε值。同时，将免疫偶联物稀释到一定浓度后检测其吸收，根据光吸收加合性(Hamblett KJ，Senter PD，Chace DF，et al.Effects of loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate[J].Clin Cancer Res，2004，10：7063-7070；Dai Y，Liu XJ，Zhen YS.Antitumor effect of the novel immunoconjugate compose of pinyangmycin and anti-type collagenase monoclonal antibody[J].Acta Pharm Sin(药学学报)，2006，41：41-46)，偶联物在200nm及280nm的吸收度分别为 

A₂₀₀＝ε²⁸⁰_CD20(1mg/ml)C_CD20+ε²⁸⁰_MDP(1mg/ml)C_MDP    (I) 

A₂₈₀＝ε²⁰⁰_CD20(1mg/ml)C_CD20+ε²⁰⁰_MDP(1mg/ml)C_MDP    (II) 

将(II)式除以(I)式，即 

$\frac{C_{\mathrm{MDP}}}{C_{\mathrm{CD}20}}=\frac{{{ϵ}^{280}}_{\mathrm{CD}20(1\mathrm{mg}/\mathrm{ml}}-R{{ϵ}^{200}}_{\mathrm{CD}20(1\mathrm{mg}/\mathrm{ml})}}{R{{ϵ}^{200}}_{\mathrm{MDP}(1\mathrm{mg}/\mathrm{ml})}-{{ϵ}^{280}}_{\mathrm{MDP}(1\mathrm{mg}/\mathrm{ml})}}---\left(\mathrm{III}\right)$

其中R＝A₂₀₀/A₂₈₀。(III)式中可计算出MDP与抗CD20抗体的分子比。 

结果显示：ESI-MS m/z 145.2KD[M+H]⁺.根据MDP、抗CD20单克隆抗体分别于200nm、280nm的标准曲线，ε²⁰⁰_MDP(1mg/ml)＝3.74，ε²⁸⁰_CD20(1mg/ml)＝4.82，ε²⁰⁰_{CD20(1mg/ml )}＝4.22，MDP-Rituximab中MDP与抗CD20单克隆抗体分子比为3∶1。 

【实施例2】免疫活性的测试 

1、体外免疫活性 

1.1测试方法 

被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中合成的化合物5及未偶联的抗CD20单克隆抗体、MDP、脂多糖(LPS，Escherichia coli 0128：B12，Sigma-Aldrich公司)。准确称取适量样品，用RPMI1640完全培养液配制成所需浓度的溶液，供活性测试。 

本发明采用间接流式细胞仪联合抗体-抗原特异性结合的方法，测试评价了被测试样品对CD20+淋巴瘤细胞(Raji细胞，≥90％)的结合活性。抗CD20单克隆抗体与淋巴瘤细胞CD20抗原特异性结合，加入FITC标记的非特异性二抗，避光孵育，流式细胞仪检测荧光强度。由于荧光强度与结合活性成正比，所以可根据荧光强度了解药物与CD20淋巴瘤细胞的结合能力。活性测试时，收集对数生长期Raji淋巴瘤细胞(CD20≥90％)，用PBS液配制成细胞浓度为1*10⁵个的悬液，加入10μl MDP-Rituximab免疫偶联物，4℃避光孵育1h，用PBS液重复洗涤2次，加入5μl FITC标记的二抗，4℃避光孵育30min，洗涤2次后用4％甲醛固定15min，采用流式细胞仪检测荧光强度，测定荧光阳性的细胞数，以未偶联抗CD20单克隆抗体作为阴性对照。 

本发明以B系恶性淋巴瘤患儿(CR≥6个月)外周血树突状细胞为研究对象，采用流式细胞仪、ELISA法分别测试MDP-Rituximab免疫偶联物对体外树突状细胞增殖、成熟及功能的影响。(1)树突状细胞及淋巴细胞的体外培养：①人外周血单个核细胞(PMNC)分离：无菌采集B系恶性淋巴瘤患儿(完全缓解≥6个月)外周血20～30ml，肝素钠抗凝(20U/ml)，加入等体积的PBS液稀释，吸管吹打均匀，以2∶1的比例沿管壁缓慢加到淋巴细胞分离液上层，离心(2000r/min，12min)，用吸管轻轻吸取中间白细胞层，置15ml无菌离心管中，用PBS液悬浮细胞，重复洗涤3次，用RPMI1640完全培养液悬浮细胞，调整细胞浓度为1*10⁶/ml，接种于24孔培养板，在37℃通过5％二氧化碳的培养箱中贴壁培养3h。②树突状细胞的培养：贴壁3h后，吸取悬浮细胞于另一24孔培养板中，用于淋巴细胞的培养。将贴壁细胞分为如下各组：对照组：rhGM-CSF(终浓度100ng/ml)+rhIL-4(100ng/ml)+RPMI1640完全培养液；Rituximab组：rhGM-CSF(终浓度100ng/ml)+rhIL-4(100ng/ml)+未偶联抗CD20抗体(Rituximab，20μg/ml)；MDP组：rhGM-CSF(终浓度100ng/ml)+rhIL-4(100ng/ml)+MDP (0.05μg/ml)；MDP-Rituximab组：rhGM-CSF(终浓度100ng/ml)+rhIL-4(100ng/ml)+MDP-Rituximab(20μg/ml)；LPS组：rhGM-CSF(终浓度100ng/ml)+rhIL-4(100ng/ml)及LPS(1μg/ml)；MDP-Rituximab+LPS组：LPS组再加入MDP-Rituximab免疫偶联物。各组细胞在37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养，每2天半量换液及全量补充细胞因子，于培养第6天加入Rituximab、MDP、MDP-Rituximab和/或LPS，培养第8天收集细胞。③淋巴细胞的培养：收集贴壁3h后的悬浮细胞，经尼龙膜过滤后收集淋巴细胞，部分-80℃冻存备用，部分加入含有白介素2的RPMI1640培养液培养。(2)DCs表面抗原表达的变化：成熟DCs会高表达MHC分子(HLA-DR)，共刺激分子(CD80、CD86)及CD83(成熟标志抗原)，收集体外培养第8天的上述各组树突状细胞，用PBS液调整细胞浓度为1*10⁵/ml的悬液，分别加入FITC、PI标记的HLA-DR(Clone：LN3，Biolegend公司，327005)、CD80(Clone：2D10，Biolegend公司，305207)、CD86(Clone：IT2.2，Biolegend公司，305405)、CD83单抗(Clone：HB15e，Biolegend公司，305305)10μl，4℃避光孵育30min，洗涤2次后用4％甲醛液固定15min，采用流式细胞仪检测荧光强度，测定荧光阳性的细胞数。(3)DCs吞噬能力的变化：分别收集培养第5天及第8天上述各组的树突状细胞，加入1mg/ml FITC标记的葡聚糖液(FITC-dextran，MW：40,000，Sigma-Aldrich公司)，37℃或4℃避光孵育1h，洗涤2次后用4％甲醛固定15min，采用流式细胞仪检测荧光强度，了解MDP-Rituximab偶联物作用的DCs吞噬作用变化。(4)DCs分泌细胞因子(IL-12)的变化：收集上述各组培养第八天的细胞上液，加入ELISA试剂盒，通过酶标仪检测吸光度，了解各组细胞上液白介素12水平；(5)混合淋巴细胞反应：荧光染料CFSE(CFDA-SE，Sigma-Aldrich公司，CAS号.：150347-59-4)，即羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯，是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，可以标记活体细胞。其基本原理是CFSE能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。收集上述各组DCs细胞，经50ug/ml丝裂霉素于37℃作用1h，用PBS液洗涤2次，作为刺激细胞，再将已分离纯化的CD4⁺T细胞浓度调整至1*10⁶/ml，以每孔2*10⁴DC与每孔2*10⁵CD4⁺T(DC∶T＝1∶10)共同接种于96孔板中培养，每组设5个复孔，37℃，5％CO₂培养箱中培养72h后，每孔加入CFSE-staining10μl，避光孵育1h，4％甲醛固定15min，上机检测荧光强度，了解各组淋巴细胞增殖情况；同时收集共同培育72h的细胞上液，加入ELISA试剂盒，检测各组细胞上液IFN-γ水平。 

本发明进一步采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法分析了MDP-Rituximab免疫偶联物诱导的树突状细胞对同体T淋巴细胞体外增殖及杀伤活性的研究：体外培养诱导培养树突状细胞方法同上，以上各组于第4天，每孔加入Raji细胞抗原50μl，培养24h后，用培养液洗涤，重新添加细胞因子继续培养从而致敏DCs。第8天收集树突状细胞。同时，无菌采集同体患儿的外周血15ml，采用Ficoll-Hypaque分离法及贴壁方法、收集悬浮细胞，经尼龙膜柱(0.8g/10ml柱体积)筛选获得T淋巴细胞，含10％FCS的RPMI-1640调整细胞浓度为1×10⁶/ml，加入rhIL-2(20ng/ml，)，于37℃、5％CO2孵箱中培养，隔天半量换液及全量细胞因子，第7天收获细胞。用含10％FCS的RPMI-1640分别调整以上各组致敏的DCs及培养第7天的同体T淋巴细胞，浓度分别为1×10⁵/ml，1×10⁶/ml，二者各100ul(DCs∶T＝1∶10)接种于96孔培养板中，共培养于37℃、5％CO₂孵箱中，48h后获得细胞毒T淋巴细胞，即效应细胞。 

调整对数生长期Raji淋巴瘤细胞(中国科学院上海生命科学院，目录号：TCHu 44)浓度为1.0×10⁵/ml，作为靶细胞，按效应细胞与靶细胞细胞数目比为10∶1的比例共同培养12h，根据LDH释放试剂盒(南京建成公司)说明进行LDH含量的检测，取每组50μl上清液，加入50μl底物，室温避光孵育30min，每孔加入50μl终止液终止反应，PBS液洗涤、离心，酶标仪上于490nm检测各组吸光度(A490)。同时，设单纯靶细胞自然释放组及单纯效应细胞自然释放组，用1％triton X-100作用的靶细胞为靶细胞最大释放组，最终根据吸光度及以下公式计算各组杀伤率：杀伤活性＝(实验组A-靶细胞自然释放组A-效应细胞自然释放组A)/(靶细胞最大释放组A-靶细胞自然释放组A)*100％ 

1.2实验结果 

由间接流式细胞仪检测MDP-Rituximab免疫偶联物的抗体-抗原特异活性结果发现，MDP-Rituximab免疫偶联物中抗CD20单克隆抗体与CD20抗原特异性结合的能力与天然未偶联的抗CD20抗体的结合能力无显著性差异，这提示MDP-Rituximab免疫偶联物保持抗体-抗原特异性结合能力。 

由MDP-Rituximab免疫偶联物作用B系恶性淋巴瘤患儿外周血树突状细胞成熟及功能的结果发现，MDP-Rituximab免疫偶联物能促进树突状细胞高表达HLA-DR、共刺激分子(CD80、CD86)及成熟标记分子(CD83)，分泌高水平细胞因子(IL-12)及能刺激同体T淋巴细胞增殖、分泌高水平T淋巴细胞因子IFN-γ，当其与LPS共同作用时，以上效应作用为最强。 

LDH释放法检测体外刺激的细胞毒性T细胞杀伤活性结果显示，MDP-Rituximab组的杀伤率为(35.7±5.8)％，明显高于对照组(7.3±2.4)％、Rituximab组(13.8±2.9)％及未偶联的MDP组(15.2±3.1)％，而低于LPS组(51.3±6.4)％及MDP-Rituximab+LPS组(63.3±6.9)％，以MDP-Rituximab+LPS组杀伤活性最强，这提示MDP-Rituximab诱导的树突状细胞体外能增强细胞毒T淋巴细胞的杀伤作用，且与LPS具有协同作用。 

2.体内免疫活性 

2.1测试方法 

本发明在体外诱导B系恶性淋巴瘤患儿外周血树突状细胞及刺激获得细胞毒性T淋巴细胞的基础上，以负瘤的裸鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)为研究对象，通过瘤内注射免疫活性细胞的方法观察负瘤裸鼠的肿瘤体积变化。具体步骤为：Balb/C裸鼠，4周龄，雄性，体重10-12g，收集对数生长期Raji活细胞，用RPMI1640培养液悬浮细胞，调整细胞浓度为1*10⁷/0.2ml。裸鼠右侧肩背部皮肤用碘伏消毒后，在无菌条件下采用皮下注射方式将Raji活细胞注入裸鼠皮下。接种肿瘤细胞后，隔日观察裸鼠活动状态、饮食情况、体重增减、皮下瘤节形成及有无转移情况。约接种后7～10天于注射部位皮下可触及直径约4～5*4～5mm小瘤节，成瘤率可达100％。于成瘤第2天、第7天分别瘤内注射上述各组致敏DCs刺激的T淋巴细胞，根据V(mm)＝长(mm)*宽²(mm²)/2计算肿瘤体积，取其平均值，绘制移植瘤生长曲线，且给药后第14天处死裸鼠，剥离瘤体，测量肿瘤长度及宽度，计算肿瘤体积同上，根据以下等式计算肿瘤体积变化率：体积变化率＝100％*(V₁₄-V₁)/V₁，[其中V₁₄为给药后第14天处死裸鼠时肿瘤体积；V₁为给药前天的肿瘤体积]。同时行肿瘤、肝脾脏器等病理组织的检查而了解MDP-Rituximab免疫偶联物体内发挥抑瘤的作用。 

2.2实验结果 

荷瘤的淋巴瘤裸鼠：移植瘤生长曲线显示：瘤内给药后，MDP-Rituximab组肿瘤体积变化明显小于对照组、Rituximab组及未偶联的MDP组，但大于LPS组及MDP-Rituximab+LPS组，且以MDP-Rituximab+LPS组体积变化最小。肿瘤体积变化率结果显示：MDP-Rituximab组为11.9％、LPS组为6.2％、MDP-Rituximab+LPS组为5.2％，明显低于对照组、Rituximab组及未偶联的MDP组，以MDP-Rituximab+LPS组变化最小。HE染色观察肿瘤、肝脾病理组织：对照组肿瘤细胞大小不一，排列紊乱，多呈多角形或圆形，分裂相多见；而其他各组显微镜下可见不同程度的坏死，以MDP-Rituximab组、LPS组及MDP-Rituximab+LPS组最明显，此三组内可见大量核固缩、碎裂及溶解，胞浆可见空泡现象。所有组裸鼠的肝脾均未见Raji细胞浸润，这提示MDP-Rituximab免疫偶联物诱导的树突状细胞能刺激细胞毒性T淋巴细胞发挥体内抑制肿瘤的作用。 

3、结论 

本研究成功将MDP及抗CD20抗体(Rituximab)偶联合成新的免疫偶联物MDP-Rituximab，MDP-Rituximab不仅保持抗体-抗原特异性结合能力，而且体外能促进B细 胞恶性淋巴瘤患儿外周血树突状细胞成熟及刺激同体T淋巴细胞增殖，同时能增强同体细胞毒性T淋巴细胞的体外、体内杀伤活性，结合新免疫偶联物中抗体用量小，能减轻患儿家庭负担，预示着其在治疗恶性淋巴瘤具有广泛的前景。因此，本发明的免疫偶联物具有靶向治疗淋巴瘤的潜力，可应用于缓解后治疗防止淋巴瘤复发。