一种查耳酮肟类化合物作为新型免疫抑制剂的制备方法与用途

摘要

一种查耳酮肟类化合物，它有如下通式：

说明书

技术领域

本发明涉及查耳酮肟类化合物及其制备方法与作为免疫抑制药物的用途。

背景技术

免疫抑制剂是用于医疗过程的一种重要的临床药物，其用于包括移植排斥反 应和自身免疫性疾病的治疗如系统性红斑狼疮，类风湿关节炎和牛皮癣。T淋巴 细胞在移植排斥反应中发挥了不可或缺的作用，使环孢素A(CsA)，他克莫司 (FK506的)和西罗莫司(雷帕霉素)作为免疫抑制剂治疗脱颖而出。虽然免疫 抑制药物已成功地用于器官移植和自身免疫性疾病的临床治疗，但其副作用包括 肝毒性、肾毒性、恶性肿瘤、感染、心血管毒性等却不容忽视。因此，寻找新的 调节免疫反应，和高效，低毒的作为潜在的临床应用的免疫抑制药物的需要从未 停止过。

据研究报道，查耳酮类的化合物具有抗炎、抗病毒、抗疟疾、免疫抑制等多 种生物活性，对免疫反应中的T细胞增殖有明显的抑制作用。某些肟类化合物 也具有一定的免疫抑制活性。因此，作为查耳酮的肟类衍生物，其在免疫抑制方 面的研究同样具有较大的潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一类新型查耳酮肟类化合物以及它们的制备方法与 用途。

本发明的技术方案如下：

1.一类查耳酮肟类衍生物，其特征是它有如下通式：

式中：R₁-为：

基团；

R₂-为：

基团。

一种制备上述的肟类化合物的方法，它由下列步骤组成：

步骤1.于甲醇溶液中，加入相应的苯乙酮类的化合物和相应的苯甲醛类的 化合物，苯乙酮类的化合物和苯甲醛类的化合物的物质的量之比为1∶1左右，再 加入6摩尔每升的氢氧化钾水溶液，氢氧化钾与苯乙酮的物质的量比为2.5∶1，室 温搅拌直至有固体形成，将固体过滤，再用冰水和冰甲醇洗，将得到的固体溶于 无水甲醇重结晶提纯，

步骤2.将步骤1得到的提纯后的固体溶于吡啶，加入6倍物质的量的盐酸 羟胺，搅拌加热至60℃，反应过夜12小时后冷却，滤液减压蒸干，将得到的固 体用水洗，再用无水乙醇重结晶，得到查耳酮肟类的化合物。

上述的制法，所述的步骤1中，甲醇的用量为每毫摩尔苯甲醛类的化合物加 5ml。

上述的制法，所述的步骤2中，吡啶的用量为每毫摩尔盐酸羟胺加1ml。

本发明的查耳酮肟类化合物对活化的T细胞明显的抑制作用，而对未活化 的T细胞的抑制作用较弱，因此本发明的肟类化合物可在制备免疫抑制药物中 应用。

具体实施方式

实施例一：(2E)-1-(4-氯苯基)-3-(4-氟苯基)查耳酮肟(化合物1)的制备

于100ml单口圆底烧瓶中加入对氯苯乙酮(10mmol)和对氟苯甲醛(10mmol)， 加入50ml的甲醇溶解，再加入的6摩尔每升的氢氧化钾水溶液(25mmol， 4.17mL)。室温搅拌反应至有固体产生，然后将固体过滤，再用冰甲醇和冰水洗 一遍，得到黄色的固体。将得到的固体放入100ml的烧杯，加无水乙醇至完全溶 解，然后重结晶后过滤，得到黄色的晶体状物质1-(4-氯苯基)-3-(4-氟苯基) 查耳酮。再将其移入100ml的单口圆底烧瓶中，加入6倍摩尔质量的盐酸羟胺， 溶于吡啶(10ml)。搅拌加热至60℃，回流过夜12小时以后用薄层层析法检测 反应，直至反应完全，冷却后过滤，滤液减压蒸干，重结晶后得到黄色的颗粒状 化合物，再用无水乙醇重结晶，得到黄色晶体状物质，即目标查耳酮肟类化合物。 产率：35％。Mp 150-152℃。¹H NMR(300Hz，CDCl₃)：5.95-6.00(m，1H)；6.85(d，J＝ 8.76Hz，2H)；6.94(d，J＝8.79Hz，2H)；7.16(d，J＝8.61Hz，2H)；7,26(s，1H)；7.68(d，J ＝8.79，2H).ESI-MS：277.05(C₁₅H₁₂ClFNO，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₅H₁₂ClFNO： C，65.35；H，4.02；N，5.08.FOUND：C，65.21；H，4.20；N，5.21.

实施例二：(2E)-1-(4-氯苯基)-3-(噻吩-2-基)查耳酮肟(化合物2)的制备

制备方法同实施例一。以噻吩-2-甲醛代替对氟苯甲醛，得到黄色晶体状目标化 合物。产率30％。Mp 140-142℃.¹H NMR(300Hz，CDCl₃)：6.83-6.70(m，1H)； 6.97-7.03(m，1H)；7.09(d，J＝3.66Hz，1H)；7.29-7.34(t，J＝26.7Hz，1H)；7.39-7.48(m， 5H).ESI-MS：264.02(C₁₃H₁₁ClNOS，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₃H₁₀ClNOS：C， 59.20；H，3.82；N，5.31.FOUND：C，60.12；H，3.76；N，5.44.

实施例三：(2E)-1-(4-溴苯基)-3-(噻吩-2-基)查耳酮肟(化合物3)的制备

制备方法同实施例一。以对溴苯乙酮代替对氯苯乙酮，以噻吩-2-甲醛代替对氟 苯甲醛，得到黄色晶体状目标化合物。产率25％。Mp 129-132℃.¹H NMR (300Hz，CDCl₃)：7.08-7.11(m，1H)；7.28(d，J＝10.26Hz，1H)；7.37-7.44(m，2H)； 7.64(d，J＝8.43Hz，2H)；7.87(d，J＝8.58Hz，2H)；7.95(d，J＝15.36Hz，1H).ESI-MS： 307.97(C₁₃H₁₁BrNOS，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₃H₁₀BrNOS：C，50.66；H，3.27；N， 4.54.FOUND：C，51.89；H，3.38；N，4.32.

实施例四：(2E)-1-(4-溴苯基)-3-(4-氯苯基)查耳酮肟(化合物4)的制备

制备方法同实施例一。以对溴苯乙酮代替对氯苯乙酮，以对氯苯甲醛代替对氟苯 甲醛，得到黄色晶体状目标化合物。产率38％。Mp 166-170℃.¹H NMR(300Hz， CDCl₃)：7.39-7.47(m，3H)；7.58(d，J＝6.57Hz，2H)；7.64-7.67(m，2H)；7.76(d，J＝ 15.75Hz，1H)；7.86-7.90(m，2H).ESI-MS：337.61(C₁₅H₁₂BrClNO，[M+H]⁺).Anal. Calcd for C₁₅H₁₁BrClNO：C，53.52；H，3.29；N，4.16.FOUND：C，51.67；H，3.16；N， 4.29.

实施例五：(2E)-1-(4-溴苯基)-3-(2，4-二氯苯基)查耳酮肟(化合物5)的 制备

制备方法同实施例一。以对溴苯乙酮代替对氯苯乙酮，以2，4-二氯苯甲醛代替对 氟苯甲醛，得到黄色晶体状目标化合物。产率34％。Mp 174-177℃.¹H NMR (300Hz，CDCl₃)：7.16-7.20(m，1H)；7.60(d，J＝8.58Hz，4H)；7.80-7.83(m，4H). ESI-MS：372.06(C₁₅H₁₁BrCl₂NO，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₅H₁₀BrCl₂NO：C， 48.55；H，2.72；N，3.77.FOUND：C，48.64；H，2.83；N，3.62.

实施例六：(2E)-1-(4-溴苯基)-3-(4-氟苯基)查耳酮肟(化合物6)的制备

制备方法同实施例一。以对溴苯乙酮代替对氯苯乙酮，以对氟苯甲醛代替对氟苯 甲醛，得到黄色晶体状目标化合物。产率32％。Mp 180-184℃.¹H NMR(300Hz， CDCl₃)：7.09-7.14(m，2H)；7.40(d，J＝15.54Hz，1H)；7.57-7.67(m，4H)；7.75-7.80(t，J ＝7.86HZ，1H)；7.86-7.89(m，2H).ESI-MS：307.97(C₁₅H₁₂BrFNO，[M+H]⁺).Anal. Calcd for C₁₅H₁₁BrFNO：C，56.27；H，3.46；N，4.37.FOUND：C，56.39；H，3.54；N， 4.29.

实施例七：(2E)-1-(4-甲苯基)-3-(4-氟苯基)查耳酮肟(化合物7)的制备

制备方法同实施例一。以对甲基苯乙酮代替对氯苯乙酮，以对氟苯甲醛代替对氟 苯甲醛，得到黄色晶体状目标化合物。产率44％。Mp111-115℃.¹H NMR(300Hz， CDCl₃)：2.42(s，3H)；6.94(d，J＝8.79Hz，2H)；7.35(d，J＝15.54Hz，1H)；7.59-7.65(m， 4H)；7.79(d，J＝15.54Hz，1H)；7.88(d，J＝8.61Hz，2H).ESI-MS：256.29(C₁₆H₁₅FNO， [M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₆H₁₄FNO：C，75.28；H，5.53；N，5.49.FOUND：C，75.11； H，5.42；N，5.57.

实施例八：(2E)-1-(4-甲苯基)-3-(4-氯苯基)查耳酮肟(化合物8)的制备

制备方法同实施例一。以对甲基苯乙酮代替对氯苯乙酮，以对氯苯甲醛代替对氟 苯甲醛，得到黄色晶体状目标化合物。产率42％。Mp 144-146℃.¹H NMR(300Hz，CDCl₃)：2.41(s，3H)；6.75(d，J＝16.65Hz，1H)；7.24(d，J＝9.87Hz，2H)； 7.29-7.44(m，6H)；7.63(d，J＝16.44Hz).ESI-MS：272.74(C₁₆H₁₅ClNO，[M+H]⁺). Anal.Calcd for C₁₆H₁₄ClNO：C，70.72；H，5.19；N，5.15.FOUND：C，70.58；H，5.25； N，5.20.

实施例九：(2E)-1-(4-甲苯基)-3-(2，4-二氯苯基)查耳酮肟(化合物9)的 制备

制备方法同实施例一。以对甲基苯乙酮代替对氯苯乙酮，以2，4-二氯苯甲醛代替 对氟苯甲醛，得到黄色晶体状目标化合物。产率39％。Mp 152-156℃.¹H NMR (300Hz，CDCl₃)：2.42(s，3H)；7.16-7.27(m，4H)；7.38-7.45(m，3H)；7.59(d，J＝ 16.65Hz，1H)；7.71(d，J＝9.51，1H).ESI-MS：307.19(C₁₆H₁₄Cl2NO，[M+H]⁺).Anal. Calcd for C₁₆H₁₃Cl₂NO：C，62.76；H，4.28；N，4.57.FOUND：C，62.65；H，4.17；N， 4.69.

实施例十：查耳酮肟类化合物免疫抑制活性的研究

采用MTT[3-(4，5)-双甲基-2-噻唑-(2，5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定肟类化 合物对活化的T细胞和未活化的T细胞最低抑制浓度(minimal inhibitory  concentration，MIC)。采用流式细胞仪和免疫印迹的方法对免疫活性最好的化合 物进行作用机制检测。

(1)动物准备：购自江苏省实验动物中心的6至8周龄雌性BALB/c小鼠。在 21±2℃下，小鼠保持自由食用的的食物和水，并保持12小时光/暗周期。实验 动物福利和实验程序是严格按照实验动物指南(科学与中国，2006年技术部) 和南京大学相关的伦理法规指南进行的。尽全力减少动物的痛苦和减少使用动物 的数量。

(2)细胞和试剂准备：分离自BALB/c小鼠的淋巴结细胞在37℃，5.0％的二氧 化碳增湿的空气中，在辅以10％胎牛血清的1640培养基中培养。抗CD3，抗 CD28鼠抗体，购自BD Pharmingen。膜联蛋白V-FITC/PI试剂盒购自晶美生物 科技。反裂caspase-3抗体和抗PARP抗体购自圣克鲁斯生物技术公司。抗-核糖 抗体购自细胞信号技术公司。所有其他化学品获得西格玛化工有限公司。

(3)细胞增殖实验：淋巴结细胞以5×10⁵个/板的密度培养在96孔中，用不同 浓度的化合物的与抗CD3/抗CD28共同刺激，持续72h。在培养结束前4h，每 孔加入20μl MTT，增殖阶段开始。结束后，除去上清液后，加入20μl DMSO 溶解甲臜结晶。用酶联免疫吸附试验仪测试540nm下的吸光度。

(4)细胞毒性试验：将细胞以5×10⁵个/孔的密度加入96孔板中，然后加入梯度 浓度的化合物培养72h。在结束培养前4h每孔加入20μl的MTT。然后再加入 200μl的DMSO溶解甲臜晶体。最后测540nm的吸光度值。

(5)统计分析

所有实验都重复进行了3-5次，均得到类似的结果。该两个实验组P值是用双尾 学生t-检验进行测试的。显著性水平定在P值为0.05。如果适用，数据报告为平 均值±标准差(SD)。

抑制率的计算：细胞生长的抑制率按照下列公式计算：

生长抑制率＝(1-存活率)×100％＝[1-(OD_实验-OD_空白)/(OD_对照-OD_空白)]×100％(OD_实验表示测试药物组的平均光密度，OD_对照表示对照组的平均光密 度，OD_空白表示对照组的平均光密度)。

半数抑制浓度(IC₅₀)定义为当50％的肿瘤细胞存活时的药物浓度。根据测 定的光密度(OD值)，制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其 对应的药物浓度。

本发明的查耳酮肟类化合物的对活化的T细胞的抑制IC₅₀值见表1，对未活 化的T细胞的抑制CC₅₀值见表2。

表1本发明所列肟类化合物的对活化的T细胞的抑制IC₅₀值(μM)和对未活 化的T细胞的抑制CC₅₀值

CsA：阳性对照