由微生物法生产的长链二元酸中脱除有机胺氮杂质的方法

摘要

本发明涉及一种由微生物法生产的长链二元酸中脱除有机胺氮杂质的方法，该方法主要是应用丙酮或丁酮做溶剂来脱除由微生物发酵氧化正构烷烃生产的长链二元酸中的有机胺氮化合物，使其含量达到低于12ppm的要求，以充分满足应用可提出的低有机胺氮含量的指标要求，同时该技术具有能耗低，工艺简单，与微生物发酵氧化正构烷烃生产长链二元酸工艺有良好的衔接性，并且该技术涉及的主要热源可由太阳能集热器提供即可。

说明书

技术领域

本发明涉及一种由微生物发酵氧化正构烷烃生产的长链二元酸 中脱除有机胺氮杂质的方法，亦即属于化学产物的分离与纯化精制的 技术范畴。

背景技术

长链二元酸是一种在正构烷烃基的两端含有两个羧基的有机化 合物。它做为基本有机化工的原料，有着广泛的用途。目前，对其应 用正在向更广的范围扩张。提到长链二元酸，我们习惯常指为含有8 －18个碳的分子特征。对其制成的原料，由液体石蜡而得到的相对 应的碳数的正构烷烃而来。该技术的发展水平，有两个方法可以做到。 其一是通过化学氧化法而来，由该法得到的产物长链二元酸的选择性 差，要得到纯品须经过相对复杂的过程，因此，该对应工艺技术相应 成本高，并且副产物对环境有影响。方法二，则是正构烷烃经过特定 的酵母菌来对其进行生物氧化而得到长链二元酸，该方法反应条件温 和，并且产物选择性好。是目前应用于大规模生产的主要工艺技术之 选。

但针对微生物氧化正构烷烃生产长链二元酸工艺，由于生产长链 二元酸的过程有一定量的微生物参与合成代谢过程，因此产成物中含 有一定量的有机胺氮化合物，在产品中含量极少。但近年来针对某些 领域的应用要求，在有机胺氮含量指标上有一些严格的要求，但对于 生物法直接经简单精制得到的长链二元酸（后称初品）中有机胺氮含 量指标是达不到要求的，并且也有一些人对这些初品的精制技术做过 工作，但其最低有机胺氮含量指标不小于25ppm。并且，应用这些方 法设备投资高，工艺运行费用较高，能耗大。

针对这些问题，本发明提供一种由微生物发酵氧化正构烷烃生产 的长链二元酸中脱除有机胺氮杂质的方法。

发明内容

本发明目的在于，提供一种由微生物法生产的长链二元酸中脱除 有机胺氮杂质的方法，该方法主要是应用丙酮或丁酮做溶剂来脱除由 微生物发酵氧化正构烷烃生产的长链二元酸中的有机胺氮化合物，使 其含量达到低于12ppm的要求，以充分满足应用可提出的低有机胺氮 含量的指标要求，同时该方法具有能耗低，工艺简单，与微生物发酵 氧化正构烷烃生产长链二元酸工艺有良好的衔接性，并且该方法涉及 的主要热源可由太阳能集热器提供即可。

本发明所述的一种由微生物法生产的长链二元酸中脱除有机胺 氮杂质的方法，该方法是由微生物发酵氧化正构烷烃生产的长链二元 酸中脱除有机胺氮杂质，具体操作按下列步骤进行：

a、利用热带假丝酵母菌的诱变菌株发酵氧化正构烷烃获得的长 链二元酸初品，用经过蒸馏后冷凝下来的丙酮或丁酮液体，在常温常 压下溶解二元酸初品；

b、将步骤a溶解初品后形成的溶液，用过滤精度0.1-50μm的滤 材进行过滤，保留滤液，滤渣即为脱除物；

c、将过滤后的滤液，在加热蒸发器中，用蒸馏的方法进行浓缩， 被蒸馏出的丙酮或丁酮蒸汽冷凝后循环使用；

d、在加热蒸发器中，被浓缩后的母液将有二元酸晶体析出，过 滤收取固相物质，并经干净空气吹扫后，即得到长链二元酸精制品。

步骤d中滤过的母液，再次返回加热蒸发器中循环使用。

步骤d中加热蒸发器所需热源和热能，由太阳能集热器中供给。

本发明所述一种由微生物发酵氧化正构烷烃生产的长链二元酸 中脱除有机胺氮杂质的方法，该方法将蒸馏之后冷凝下来的丙酮或丁 酮液体导入放置二元酸初品的置放容器中，该容器中放置的是常温状 态下的二元酸初品，导入的丙酮或丁酮液体在这里与待精制的初品汇 合，并将该初品溶解，形成含有二元酸的丙酮或丁酮溶液，之后该溶 液经过一个由无纺布式滤布制成的过滤介质过滤，该过滤介质的过滤 精度为0.1-50μm，经过上述过滤介质过滤后的滤液汇集后导入加热 蒸发器中，经过滤介质截留后的滤渣即为脱除的有机胺氮混合物，可 弃去。过滤介质经洗涤后可重复使用多次。在加热蒸发器中，蒸馏是 在常压状态下进行，亦即丙酮或丁酮被有效的蒸发，蒸发出溶液的丙 酮或丁酮蒸汽经冷凝后的凝液收集之后可重复使用。而被蒸发出丙酮 或丁酮的母液中由于其所含二元酸浓度的提高，而达到过饱和浓度 后，有一定量的二元酸晶体析出。将含有一定量(5-20%w/w)析出晶体 的母液引出来，引出的母液经过有效的过滤，滤出的固体物质，经过 干净空气的吹扫后即得到精制的长链二元酸产物。滤过后的母液再返 回到加热蒸发器中继续浓缩蒸发出丙酮或丁酮而进行循环操作。这里 从丙酮或丁酮的沸点来看，在加热蒸发器中引入太阳能集热采集的热 源能量即可进行蒸发操作，被蒸发的丙酮或丁酮的常压沸点与太阳能 集热器采集的热源能量很匹配，并可使该过程连续进行。

本发明所用的菌种为热带假丝酵母菌的诱变菌株，是委托中国工 业微生物菌种保藏管理中心购买的美国典型微生物菌种保藏中心编 号为20962的热带假丝酵母菌经诱变后的诱变菌株。

热带假丝酵母菌拉丁名称为：Candida tropicalis，热带假丝酵 母菌的生理特性如下：

一、发酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，海藻糖+，乳 糖-，蜜二糖-，棉籽糖-，松三糖+，菊糖-。

二、同化碳源：葡萄糖+，半乳糖+，L-山梨糖-，蔗糖+， 麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，蜜二糖-，棉籽糖-，松三糖 +，菊糖-，可溶性淀粉+，D-木糖+，L-阿拉伯糖+，D-阿拉伯糖-， D-核糖-，L-鼠李糖-，乙醇+，甘油+，赤藓醇-，核糖醇+，甜醇-， D-甘露醇+，D-山梨醇+，肌醇-，琥珀酸+。

三、同化硝酸盐：阴性。

四、在无维生素的培养基中生长：弱。

形态特征：奶油白色，有褶皱，呈梅花状；液体培养时，大部分 是单个卵圆形细胞。

本发明所述的一种由微生物法生产的长链二元酸中脱除有机胺 氮杂质的方法，该方法中利用热带假丝酵母菌的诱变菌株发酵氧化正 构烷烃获得的长链二元酸初品的步骤为：

制备培养基：

麦芽汁培养基:12Brix麦芽汁，2%琼脂；

种子培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g， 七水合硫酸镁0.5-1.0g，蔗糖15.0-25.0g，玉米浆1.0-2.0g，酵 母浸膏1.0-2.0g，尿素2.5-3.0g，维生素B₁0.1-0.3g，正构烷烃C₈-C₁₈40-50ml，纯水1000ml；

筛选培养基：

筛选培养基Ⅰ：各组份为磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾 5.0-6.0g，硫酸铵2.0-3.0g，氯化钠1.0-1.5g，酵母浸膏0.5-1.0g， 七水合硫酸镁0.5-1.0g，琼脂15.0-20.0g，正构烷烃nC₈-nC₁₈20-50ml， 纯水1000ml，pH7.0；

筛选培养基Ⅱ：各组份为磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾 5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，酵母浸膏0.5-1.0g，硫酸铵2.0-3.0g， 七水合硫酸镁0.5-1.0g，琼脂15.0-20.0g，蔗糖15.0-20.0g，纯 水1000ml，pH7.0；

筛选培养基Ⅲ：各组份为蔗糖15.0-20.0g，磷酸二氢钠 2.0-3.0g，磷酸氢二钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，七水合硫酸镁 0.5-1.0g，酵母浸膏0.5-1.0g，尿素1.5-2.0g，琼脂15.0-20.0g， 正构烷烃nC₈-nC₁₈20-50ml，纯水1000ml，pH7.5，酚红指示剂1%；

发酵培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g， 七水合硫酸镁0.5-1.0g，蔗糖15.0-25.0g，玉米浆1.0-2.0g，酵 母浸膏1.0-2.0g，无水醋酸钠3.0-4.0g，尿素2.0-3.0g，维生素 B₁0.1-0.3g，硫酸铵2.0-3.0g，丙烯酸0.001-0.002g，正构烷烃 nC₈-nC₁₈300～400ml，纯水1000ml；

热带假丝酵母菌的诱变：

将热带假丝酵母菌菌株接入麦芽汁培养基斜面，在温度28-34℃ 的培养箱中培养24-48小时，向斜面内加入15ml无菌水，用无菌接 种环将菌体刮入无菌的含有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡30分钟 充分打散菌体，分别吸取10ml菌悬液于50ml无菌三角瓶中，用钴 60γ-射线进行辐照，辐照剂量为0.5-0.7KGy，将辐照后的菌悬液进 行梯度稀释，并涂麦芽汁平板，在温度28-34℃的培养箱中与对照平 板一起培养36-72小时，选择经辐照后平板中成活率在10-40%的热 带假丝酵母菌的单菌落；

将筛选出的平板中成活率在10-40%的单菌落分别一一对应接种 到含筛选培养基Ⅰ的平板和含筛选培养基Ⅱ的平板上，在温度28-34 ℃的培养箱中培养36-72小时，选择在筛选培养基Ⅰ平板上不生长而 在筛选培养基Ⅱ平板上生长旺盛的热带假丝酵母菌的单菌落；

再将筛选出的单菌落接种于含筛选培养基Ⅲ的平板上，在温度 28-34℃的培养箱中培养36-72小时，选择R值大的热带假丝酵母菌 的诱变菌株，其中R为菌落产酸面积/菌落面积；

热带假丝酵母菌诱变菌株的验证

将得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到种子培 养基进行种子培养，再将培养好的种子接种到发酵培养基中进行产酸 培养，最后在20m³的反应器内以正构十一碳烷烃为底物，在温度29 ℃，通气量0.6-1.6VVM（m³空气/m³发酵液·min）下培养144小时， 进行发酵试验，发酵结束经后处理得十一烷二元酸初品。

具体实施方式

实施例1

制备培养基：

麦芽汁培养基:12Brix麦芽汁，2%琼脂；

种子培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g， 七水合硫酸镁0.5-1.0g，蔗糖15.0-25.0g，玉米浆1.0-2.0g，酵 母浸膏1.0-2.0g，尿素2.5-3.0g，维生素B₁0.1-0.3g，正构烷烃C₈-C₁₈40-50ml，纯水1000ml；

筛选培养基：

筛选培养基Ⅰ：各组份为磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾 5.0-6.0g，硫酸铵2.0-3.0g，氯化钠1.0-1.5g，酵母浸膏0.5-1.0g， 七水合硫酸镁0.5-1.0g，琼脂15.0-20.0g，正构烷烃nC₈-nC₁₈20-50ml， 纯水1000ml，pH7.0；

筛选培养基Ⅱ：各组份为磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾 5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，酵母浸膏0.5-1.0g，硫酸铵2.0-3.0g， 七水合硫酸镁0.5-1.0g，琼脂15.0-20.0g，蔗糖15.0-20.0g，纯 水1000ml，pH7.0；

筛选培养基Ⅲ：各组份为蔗糖15.0-20.0g，磷酸二氢钠 2.0-3.0g，磷酸氢二钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，七水合硫酸镁 0.5-1.0g，酵母浸膏0.5-1.0g，尿素1.5-2.0g，琼脂15.0-20.0g， 正构烷烃nC₈-nC₁₈20-50ml，纯水1000ml，pH7.5，酚红指示剂1%；

发酵培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g， 七水合硫酸镁0.5-1.0g，蔗糖15.0-25.0g，玉米浆1.0-2.0g，酵 母浸膏1.0-2.0g，无水醋酸钠3.0-4.0g，尿素2.0-3.0g，维生素 B₁0.1-0.3g，硫酸铵2.0-3.0g，丙烯酸0.001-0.002g，正构烷烃 nC₈-nC₁₈300～400ml，纯水1000ml；

热带假丝酵母菌的诱变：

将热带假丝酵母菌菌株接入麦芽汁培养基斜面，在温度28-34℃ 的培养箱中培养24-48小时，向斜面内加入15ml无菌水，用无菌接 种环将菌体刮入无菌的含有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡30分钟 充分打散菌体，分别吸取10ml菌悬液于50ml无菌三角瓶中，用钴 60γ-射线进行辐照，辐照剂量为0.5-0.7KGy，将辐照后的菌悬液进 行梯度稀释，并涂麦芽汁平板，在温度28-34℃的培养箱中与对照平 板一起培养36-72小时，选择经辐照后平板中成活率在10-40%的热 带假丝酵母菌的单菌落；

将筛选出的平板中成活率在10-40%的单菌落分别一一对应接种 到含筛选培养基Ⅰ的平板和含筛选培养基Ⅱ的平板上，在温度28-34 ℃的培养箱中培养36-72小时，选择在筛选培养基Ⅰ平板上不生长而 在筛选培养基Ⅱ平板上生长旺盛的热带假丝酵母菌的单菌落；

再将筛选出的单菌落接种于含筛选培养基Ⅲ的平板上，在温度 28-34℃的培养箱中培养36-72小时，选择R值大的热带假丝酵母菌 的诱变菌株，其中R为菌落产酸面积/菌落面积；

热带假丝酵母菌诱变菌株的验证

将得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到种子培 养基进行种子培养，再将培养好的种子接种到发酵培养基中进行产酸 培养，最后在20m³的反应器内以正构十一碳烷烃为底物，在温度29 ℃，通气量0.6-1.6VVM（m³空气/m³发酵液﹒min）下培养144小时， 进行发酵试验，发酵结束经后处理得十一烷二元酸初品；

a、利用热带假丝酵母菌的诱变菌株发酵氧化正构烷烃获得的长 链二元酸初品，用经过蒸馏后冷凝下来的丙酮或丁酮液体，在常温常 压下溶解二元酸初品；

b、将步骤a溶解初品后形成的溶液，用过滤精度0.1μm的滤材 进行过滤，保留滤液，滤渣即为脱除物；

c、将过滤后的滤液，在由太阳能集热器供给热源和热能的加热 蒸发器中，用蒸馏的方法进行浓缩，被蒸馏出的丙酮或丁酮蒸汽冷凝 后循环使用；

d、在加热蒸发器中，被浓缩后的母液将有二元酸晶体析出，过 滤收取固相物质，并经干净空气吹扫后，即得到长链二元酸精制品， 滤过的母液，再次返回加热蒸发器中循环使用。

实施例2

热带假丝酵母菌的诱变菌株发酵氧化正构烷烃获得的长链二元 酸初品按实施例1进行；

a、将利用热带假丝酵母菌的诱变菌株发酵氧化正构烷烃获得的 长链二元酸初品，用经过蒸馏后冷凝下来的丙酮或丁酮液体，在常温 常压下溶解二元酸初品；

b、将步骤a溶解初品后形成的溶液，用过滤精度10μm的滤材进 行过滤，保留滤液，滤渣即为脱除物；

c、将过滤后的滤液，在由太阳能集热器供给的热源和热能的加 热蒸发器中，用蒸馏的方法进行浓缩，被蒸馏出的丙酮或丁酮蒸汽冷 凝后循环使用；

d、在加热蒸发器中，被浓缩后的母液将有二元酸晶体析出，过 滤收取固相物质，并经干净空气吹扫后，即得到长链二元酸精制品， 滤过的母液，再次返回加热蒸发器中循环使用。

实施例3

热带假丝酵母菌的诱变菌株发酵氧化正构烷烃获得的长链二元 酸初品按实施例1进行；

a、将利用热带假丝酵母菌的诱变菌株发酵氧化正构烷烃获得的 长链二元酸初品，用经过蒸馏后冷凝下来的丙酮或丁酮液体，在常温 常压下溶解二元酸初品；

b、将步骤a溶解初品后形成的溶液，用过滤精度30μm的滤材进 行过滤，保留滤液，滤渣即为脱除物；

c、将过滤后的滤液，在由太阳能集热器供给热源和热能的加热 蒸发器中，用蒸馏的方法进行浓缩，被蒸馏出的丙酮或丁酮蒸汽冷凝 后循环使用；

d、在加热蒸发器中，被浓缩后的母液将有二元酸晶体析出，过 滤收取固相物质，并经干净空气吹扫后，即得到长链二元酸精制品， 滤过的母液，再次返回加热蒸发器中循环使用。

实施例4

热带假丝酵母菌的诱变菌株发酵氧化正构烷烃获得的长链二元 酸初品按实施例1进行；

a、将利用热带假丝酵母菌的诱变菌株发酵氧化正构烷烃获得的 长链二元酸初品，用经过蒸馏后冷凝下来的丙酮或丁酮液体，在常温 常压下溶解二元酸初品；

b、将步骤a溶解初品后形成的溶液，用过滤精度50μm的滤材进 行过滤，保留滤液，滤渣即为脱除物；

c、将过滤后的滤液，在由太阳能集热器供给热源和热能的加热 蒸发器中，用蒸馏的方法进行浓缩，被蒸馏出的丙酮或丁酮蒸汽冷凝 后循环使用；

d、在加热蒸发器中，被浓缩后的母液将有二元酸晶体析出，过 滤收取固相物质，并经干净空气吹扫后，即得到长链二元酸精制品， 滤过的母液，再次返回加热蒸发器中循环使用。