一种从莫勒菌中提取双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧的方法

摘要

本发明公开了一种从莫勒菌中提取双苯恶庚因-11(6H)酮-1，10-二羟基，3-甲基-7，8-二甲氧的方法，包括：1)活化菌株；2)初级培养；3)次级培养；4)减压抽滤得到菌丝体，菌丝体恒温干燥；5)研磨，过筛；6)多次进行200~300目硅胶柱层析，得到的流分旋蒸浓缩，氯仿洗出，自然挥干，甲醇重结晶，得产品。本发明以繁殖快、周期短的真菌为材料，成本低，操作简单，重复性好，无需昂贵的仪器，通过多次进行硅胶柱层析，得到一种新化合物双苯恶庚因-11(6H)酮-1，10-二羟基，3-甲基-7，8-二甲氧，通过对人类胃癌细胞株BGC823进行活性测定，得到的数据说明该种新化合物有优异的抗肿瘤活性。

说明书

技术领域

本发明属于新物质提取领域，具体涉及一种从莫勒菌中提取双苯恶庚因-11(6H)酮-1，10-二羟基，3 -甲基-7，8-二甲氧的方法。

背景技术

莫勒菌(Moelleriella)是虫生真菌的重要成员，其无性型为类座壳孢(Aschersonia-like)，由于它能引起粉虱和介壳类昆虫群体性流行病的发生，这使得它有可能成为有用的生物防治剂。随着研究的深入，近年来人们发现莫勒菌的代谢产物具有抗菌、抗肿瘤和抗疟原虫等生物活性，这预示该菌在生物农药或医药上存在很大应用价值。

由于人们在现代社会患癌症的概率较大，因此，寻找不同来源的抗癌药物已经越来越得到人们的关注。虫生真菌的代谢产物中含有多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇等多种具有杀虫、抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性物质，因此，充分开发利用虫生真菌，将有利于人类医疗水平的发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从莫勒菌中提取双苯恶庚因-11(6H)酮-1，10-二羟基，3 -甲基-7，8-二甲氧的方法，本发明以繁殖快、周期短的真菌为材料，成本低，操作简单，重复性好，无需昂贵的仪器，通过多次进行硅胶柱层析，得到一种新化合物，通过对人类胃癌细胞株BGC823进行活性测定，得到的数据说明该种新化合物有优异的抗肿瘤活性，促进其药理学的研究和作为先导化合物的开发和应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种从莫勒菌中提取双苯恶庚因-11(6H)酮-1，10-二羟基，3 -甲基-7，8-二甲氧的方法包括以下步骤：

（1）将莫勒菌（邱君志等，赭色小莫勒菌在中国的发现. 菌物学报，2009. 28(1): 148-150）活化后，取菌块接种PDB培养基中，在160r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养，按10％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在160r/min、25℃条件下连续培养28天即次级培养；

（2）减压抽滤得到菌丝体，菌丝体在40℃下恒温干燥后研磨成粉状，过筛，用乙酸乙酯浸泡，超声，重复3次；合并浸泡液，旋蒸得菌丝体浸膏；

（3）将菌丝体浸膏上200~300目硅胶柱，进行粗分；先用石油醚洗脱，之后换石油醚：二氯甲烷体积比=10:1洗脱，收集该部位洗脱液，旋蒸浓缩；

（4）将步骤（3）得到的浓缩物继续上200~300目硅胶柱，以石油醚：丙酮体积比=25:1梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=20:1部位洗脱液，旋蒸浓缩；

（5）将步骤（4）得到的浓缩物进一步上200~300目硅胶柱，先以石油醚洗脱，之后换石油醚：丙酮体积比=20:1梯度洗脱，最后以二氯甲烷：丙酮体积比=10:1梯度洗脱，收集二氯甲烷：丙酮体积比=1:1部位洗脱液，旋蒸浓缩，氯仿洗出，自然挥干，甲醇重结晶，即得到双苯恶庚因-11(6H)酮-1，10-二羟基，3 -甲基-7，8-二甲氧，结构式如下：

。

所述步骤（1）中接种菌块的大小为0.5×0.5cm，接种量为4块。所述PDB培养基的制备为：马铃薯去皮，切块，称取200g，沸水煮30min，6层纱布过滤，称取20g葡萄糖，加蒸馏水定容至1000mL，pH自然。高压灭菌121℃，20min。

所述步骤（2）中要用3倍体积乙酸乙酯浸泡24小时，超声1小时。

所述重结晶具体操作为：用氯仿将得到的含有少量杂质的双苯恶庚因-11(6H)酮-1，10-二羟基，3 -甲基-7，8-二甲氧溶解，自然挥干，待晶体析出后，再用甲醇洗去杂质，析出弃掉，剩余的晶体再用甲醇溶解后重结晶，直至获得单一的双苯恶庚因-11(6H)酮-1，10-二羟基，3 -甲基-7，8-二甲氧。

本发明的有益效果在于：本发明以繁殖快、周期短的真菌为材料，成本低，操作简单，重复性好，无需昂贵的仪器，通过多次进行硅胶柱层析，制得了一种新化合物双苯恶庚因-11(6H)酮-1，10-二羟基，3 -甲基-7，8-二甲氧。通过对人类胃癌细胞株BGC823进行活性测定，得到的数据说明该种新化合物有优异的抗肿瘤活性。

具体实施方式

实施例1：双苯恶庚因-11(6H)酮-1，10-二羟基，3 -甲基-7，8-二甲氧的制备

1）将莫勒菌（本实验室野外采集，分离纯化并保藏菌株）活化后，以0.5×0.5cm（4块）接种于 PDB培养基（马铃薯去皮，切块，称取200g，沸水煮30min， 6层纱布过滤，称取20g葡萄糖，加蒸馏水定容至1000mL，pH自然。分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，高压灭菌121℃,20min。）中，在160r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养，按10％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在160r/min、25℃条件下连续培养28天即次级培养；

2）减压抽滤得到菌丝体，菌丝体在40℃下恒温干燥后研磨成粉状，过筛，用3倍乙酸乙酯浸泡，超声，重复3次。合并浸泡液，旋蒸得菌丝体浸膏。 

3）将菌丝体浸膏上200~300目硅胶柱，进行粗分。先用石油醚洗脱，之后换石油醚:二氯甲烷体积比=10:1洗脱，收集该部位洗脱液，旋蒸浓缩。

4）将3）中得到的浓缩物继续上200~300目硅胶柱，以石油醚：丙酮体积比=25:1梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=20:1部位洗脱液，旋蒸浓缩。

5）将4）中得到的浓缩物进一步上200~300目硅胶柱，先以石油醚洗脱，之后换石油醚：丙酮体积比=20:1梯度洗脱，最后以二氯：丙酮体积比=10:1梯度洗脱，收集二氯：丙酮体积比=1:1部位洗脱液，旋蒸浓缩，氯仿洗出，自然挥干，甲醇重结晶，经HREIMS、NMR、HMBC谱图分析得到一种新化合物双苯恶庚因-11(6H)酮-1，10-二羟基，3 -甲基-7，8-二甲氧。

产物的表征数据如下：¹H NMR(CDCl₃, 600MHz, ppm): δ13.42 (s, 1H, OH-1), δ12.18 (s, 1H, OH-10), δ6.55 (d, J=1.70Hz, 1H, H-2)，δ6.53 (s, 1H, H-9)，δ6.39 (d, J=1.70Hz, 1H, H-4), δ5.19 (s,2H, H-6), 3.95 (s, 3H, OCH₃-8), δ3.84 (s, 3H, OCH₃-7), δ2.31 (s, 3H, H-12)。

¹³C NMR (CDCl₃, 600MHz, ppm): δ195.3 (C-11), δ165.8 (C-1), δ161.9 (C-4a), δ161.8 (C-10), δ159.3 (C-8), δ149.5 (C-3), δ138.5 (C-7), δ130.9 (C-6a), δ114.4 (C-10a), δ113.2 (C-2), δ111.0 (C-11a), δ110.8 (C-4), δ101.2 (C-9), δ66.7 (C-6), δ62.2 (OCH₃-7), δ56.1 (OCH₃-8), δ21.9(CH₃ -12)。

实施例2：抗肿瘤活性的实验

采用实施例1得到的化合物进行如下实验：

细胞系及其培养条件：本发明所用细胞系是人类胃癌细胞株BGC823。细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，其中含有每毫升100单位青霉素和100微克链霉素，细胞接种于直径为10厘米的培养皿后，37℃、5%CO₂环境中培养，细胞长满时用胰蛋白酶消化法进行传代。

细胞毒性测试：细胞毒性采用MTT法测定。将细胞用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，采用血球计算版进行活细胞数，调整活细胞浓度为5×10⁴每毫升接种于96孔培养板，每孔160微升。将培养板放入CO₂培养箱中，在37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养24小时。在细胞贴壁后，将培养液吸弃，以无双苯恶庚因-11(6H)酮-1，10-二羟基，3 -甲基-7，8-二甲氧处理的细胞为对照组，以不同浓度双苯恶庚因-11(6H)酮-1，10-二羟基，3 -甲基-7，8-二甲氧处理的细胞为实验组，各浓度分别设置3个复孔。当培养结束前4小时，每孔加入20微升MTT。培养箱中继续孵育4小时，弃上清，每孔加入100微升DMSO，震荡10分钟，置酶标仪测定OD值，波长设置为490nm。按下列公式计算存活率，同时作图并求得半数杀伤度（IC₅₀），评价药物的细胞毒性。

存活率%=加药孔平均OD值/对照孔平均OD值×100%

经作图计算得双苯恶庚因-11(6H)酮-1，10-二羟基，3 -甲基-7，8-二甲氧对人类胃癌细胞株BGC823的IC50为10 μg/mL。

上述实施例制得的新化合物对人类胃癌细胞株BGC823有优异的抗肿瘤活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。